אורגנואידים וספרואידים, בהיותם שבירים מאוד, נפגעים קשות בזמן הטיפול. הפרוטוקול שלנו מבטיח שמבני גידול תלת-ממדיים אלה יישארו שלמים במהלך תהליכים שונים, ובכך יגדיל את הדיוק, יכולת השכפול, האמינות ויכולת החזרה. החוקר יכול לתרבת אורגנואידים, להקפיא, להפשיר, לעבד, להכתים, לסמן ולבחון אורגנואידים וספרואידים שלמים תחת מיקרוסקופים שונים בזמן שהם נשארים שלמים בהידרוג'ל בתוך מכשיר רב-תכליתי יחיד.
היא מאפשרת יצירת מודל מחלה ומעקב אחר צעדים רציפים במכשיר רב-תכליתי אחד. הטכנולוגיה מביאה דיוק רב יותר כאשר בוחנים סמנים ביולוגיים לאבחון ופרוגנוזה של מחלות. ניתן ליישם שיטה זו על כל מערכת גידול תלת-ממדית, כולל אורגנואידים, ספרואידים, תאים בודדים או אורגניזמים חיים.
כדי להתחיל את התרבית האורגנואידית או הספרואידית, הניחו את ההידרוג'ל המופשר כראוי על קרח בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי למשך 15 דקות. כמו כן, שמור את הצינור המכיל כדור של קרצינומה hepatocellular, או תאי HEPG2, על קרח. לאחר מכן, צלחת 30 עד 35 microliters של 100% הידרוג'ל בתוך הנישה של המכשיר הרב תכליתי שחומם מראש כדי ליצור טיפת ג'ל, למקם 10, 000 תאי HEPG2 במרכז החלק העליון של טיפת הידרוג'ל, ולדגור את ההתקנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לאחר הדגירה, כסו את טיפת ההידרוג'ל ב-200 מיקרוליטרים של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו, או DMEM, המכיל 10% סרום בקר עוברי, או FBS. מניחים את המכסה על המכשיר כראוי, המאפשר זרימת גז, לפני הצבתו באינקובטור. כל יומיים, הזינו את התאים ב-200 מיקרוליטרים של DMEM המכילים 10% FBS.
בדוק את הצמיחה של spheroids תחת מיקרוסקופ הפוך. לפני תחילת תיוג immunofluorescence של האורגנואידים, לחמם את המדיה הנדרשת ופתרונות ל 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום תרבית התאים המקיף את טיפת ההידרוג'ל לפני הוספת 200 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד שחוממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס וקבעו אותו על ידי הצבתו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות.
לאחר מכן, שאפו את המקבע ושטפו את התמיסה לתיוג אימונופלואורסצנציה, או SIF, שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת. הוסיפו מים מזוקקים לאזור המקיף את הגומחה כדי לספק לחות לפני שתמשיכו בצעדים הבאים. שאפו את ה-SIF סביב טיפת ההידרוג'ל והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים הראשונית שחוממה מראש ב-SIF להידרוג'ל לפני הדגירה שלו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות.
לאחר מכן, שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו עם SIF שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. לאחר הכביסה, שאפו את ה-SIF הנותר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית שחוממה מראש ב-SIF להידרוג'ל. לדגום את ההידרוג'ל ב 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 עד 60 דקות.
לאחר הדגירה, שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את טיפת ההידרוג'ל עם PBS ב 37 מעלות צלזיוס שלוש פעמים בחושך במשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן, שאפו את שאריות ה- PBS ודגרו את ההידרוג'ל עם 100 מיקרוליטרים של כתם DNA גרעיני המכיל מדיום הרכבה או גליצרול ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. מלאו את הגומחה בגליצרול כדי למנוע ייבוש לפני סגירה הדוקה של המכשיר הרב-תכליתי המכיל את ההידרוג'ל.
כדי לבחון את האורגנואידים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, הגדר את הפרמטרים של המיקרוסקופ בהתאם להוראות שניתנו בכתב היד. כדי להקפיא את האורגנואידים, לשאוף את המדיה של תרבית התאים, להוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת ההקפאה שחוממה מראש, ולדגור את הדגימה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. סגור את המכסה של המכשיר בחוזקה לפני הנחתו בתוך קופסת קצף.
מניחים את קופסת הקצף בקופסת קצף אחרת וסוגרים את שתי קופסאות הקצף בחוזקה. השאירו את הקופסה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואז השאירו אותה למשך הלילה במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לאחסן את האורגנואידים למשך יותר משישה חודשים, הסר את המכשיר הרב-תכליתי המכיל את האורגנואידים מהקופסאות והעבר אותו למיכל החנקן הנוזלי.
כדי להפשיר את האורגנואידים, הוציאו את המכשיר הרב-תכליתי המכיל את הדגימה מהמקפיא או ממיכל החנקן הנוזלי והכניסו אותו ישירות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, שאפו בעדינות את תערובת התמיסה הבינונית וההקפאה לפני הוספת מדיום טרי והמשיכו לדמות את ההידרוג'ל האורגנואידי השלם. בהדמיה חיה, האורגנואידים הגדלים בתוך ההידרוג'ל נראו לעין שלושה עד חמישה ימים לאחר החדרת כדור התא, במיוחד בשולי כיפת ההידרוג'ל.
סדרת הזמן של תמונות ברמות שונות של הידרוג'ל המכיל ספרואידים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה מוצגת כאן. תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של האורגנואידים החיים בשלמותם לאחר צביעה חיה של קרום התא והגרעין הראו צפיפות תיוג דומה בפריפריה ובמרכז. יתר על כן, תיוג immunofluorescence של סטרואידים כל הר יכול להתבצע בהצלחה עם נוגדן אחד, שני נוגדנים, כמו גם שלושה נוגדנים, ביטול כל צורך בשלבי טיפול נוספים.
הניתוח המייצג מדגים שני אורגנואידים של דרכי הנשימה המסומנים כאימונופלואורסצנטיים במכשיר. תמונות SEM של כל הספרואידים במכשיר הרב-תכליתי ו-10 תמונות של סטרואידים חתוכים הצביעו על ארכיטקטורה תלת-ממדית שהשתמרה היטב של ספרואידים, אברונים ציטופלסמיים ותכונות תאיות אולטרה-סטרוקטורליות אחרות, המדגימות את היעילות של הפרוטוקול המתואר. אי סדירות בגבולות כיפת ההידרוג'ל ניכרה לאחר הקפאת הדגימות.
עם זאת, הגודל והמעוגלות של הספרואידים נותרו דומים. נדידת תאים על פני התרבית נצפתה לאחר הפשרת הדגימות הקפואות. הטכניקה היא פשוטה מאוד.
עם זאת, החוקר צריך להיות עדין מאוד בזמן שאיפה או הוספת נוזלים סביב טיפת הידרוג'ל כדי למנוע את הפגיעה בדגימה. החוקר יכול להסתכל על אותה דגימה במכשיר בודד באמצעות מיקרוסקופ היי-טק ולערוך מחקר קורלטיבי.
