유기체와 스페로이드는 매우 약해서 취급 중에 심각하게 손상됩니다. 당사의 프로토콜은 이러한 3D 성장 구조가 다양한 공정 중에 그대로 유지되도록 하여 정확성, 재현성, 신뢰성 및 반복성을 높입니다. 연구원은 단일 다목적 장치 내에서 하이드로겔에 손상되지 않은 상태로 유지하면서 다양한 현미경으로 전체 오가노이드와 스페로이드를 배양, 냉동, 해동, 처리, 염색, 라벨링 및 검사할 수 있습니다.
하나의 다목적 장치에서 질병 모델을 생성하고 순차적 단계를 추적할 수 있습니다. 이 기술은 질병의 진단 및 예후를 위해 바이오마커를 검사할 때 더 높은 정확도를 제공합니다. 이 방법은 오가노이드, 스페로이드, 개별 세포 또는 살아있는 유기체를 포함한 모든 3D 성장 시스템에 적용할 수 있습니다.
오가노이드 또는 스페로이드 배양을 시작하려면 적절하게 해동된 하이드로겔을 층류 후드 내부의 얼음 위에 15분 동안 두십시오. 또한 간세포 암종 또는 HEPG2 세포의 펠릿이 들어있는 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 예열된 다목적 장치의 틈새 내에 30 내지 35 마이크로리터의 100% 하이드로겔을 플레이트하여 겔 드롭을 만들고, 하이드로겔 드롭의 상단 중앙에 10, 000개의 HEPG2 세포를 놓고, 섭씨 37도에서 15분 동안 셋업한다.
배양 후 하이드로겔 드롭을 200마이크로리터의 Dulbecco의 변형 독수리 배지 또는 DMEM(10% 태아 소 혈청 또는 FBS)으로 덮습니다. 인큐베이터에 넣기 전에 가스 흐름을 허용하여 장치의 뚜껑을 올바르게 놓습니다. 격일로 세포에 10% FBS를 함유한 200마이크로리터의 DMEM을 공급한다.
도립 현미경으로 스페로이드의 성장을 확인하십시오. 오가노이드의 면역형광 라벨링을 시작하기 전에 필요한 배지와 용액을 섭씨 37도까지 예열합니다. 하이드로겔 방울 주변의 세포 배양액을 흡인하여 섭씨 37도로 예열한 4% 파라포름알데히드 200마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 15-30분 동안 넣어 고정합니다.
이어서, 고정액을 흡인하고, 면역형광 표지 또는 SIF를 위해 용액을 세척하고, 섭씨 37도까지 예열하여 각각 10분 동안 3회 가온한다. 다음 단계를 진행하기 전에 틈새 주변 영역에 증류수를 추가하여 습도를 제공하십시오. 하이드로겔 방울을 둘러싸고 있는 SIF를 흡인하고, SIF에 예열된 1차 항체 용액 100마이크로리터를 하이드로겔에 첨가한 후 섭씨 37도에서 30 내지 60분 동안 배양한다.
이어서, 1차 항체 용액을 흡인하고, 섭씨 37도로 예열된 SIF로 각각 10분 동안 3회 세척한다. 세척 후, 남은 SIF를 흡인하고, SIF에 예열된 100 마이크로리터의 2차 항체 용액을 하이드로겔에 첨가한다. 하이드로겔을 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30 내지 60분 동안 배양한다.
배양 후, 2차 항체 용액을 흡인하고 PBS로 떨어뜨린 하이드로겔을 섭씨 37도에서 각각 10분 동안 암실에서 3회 세척한다. 다음으로, 잔류 PBS를 흡인하고, 하이드로겔을 장착 배지 또는 글리세롤을 함유하는 100 마이크로리터의 핵 DNA 염색과 함께 어둠 속에서 섭씨 37도에서 배양한다. 하이드로 겔이 들어있는 다목적 장치를 단단히 닫기 전에 건조를 피하기 위해 틈새를 글리세롤로 채우십시오.
컨포칼 현미경으로 오가노이드를 검사하려면 원고에 제공된 지침에 따라 현미경 매개변수를 설정하십시오. 오가노이드를 동결하려면 세포 배양 배지를 흡인하고 예열된 동결 용액 200마이크로리터를 추가하고 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 폼 상자 안에 넣기 전에 장치의 뚜껑을 단단히 닫으십시오.
이 폼 상자를 다른 폼 상자에 넣고 두 폼 상자를 단단히 닫습니다. 상자를 영하 20도에서 2시간 동안 보관한 다음 영하 80도의 냉동고에 밤새 두십시오. 오가노이드를 6개월 이상 보관하려면 상자에서 오가노이드가 포함된 다목적 장치를 꺼내 액체 질소 탱크로 옮깁니다.
오가노이드를 해동하려면 냉동고 또는 액체 질소 탱크에서 샘플이 들어 있는 다목적 장치를 꺼내 섭씨 37도의 인큐베이터에 직접 넣으십시오. 해동되면 배지와 동결 용액 혼합물을 부드럽게 흡인하여 새로운 배지를 추가하고 전체 마운트 오가노이드 하이드로겔을 이미지화합니다. 라이브 이미징에서 하이드로겔 내부의 성장하는 유기체는 세포 펠릿을 삽입한 후 3-5일 후, 특히 하이드로겔 돔 주변에서 볼 수 있었습니다.
도립 위상차 현미경에서 스페로이드를 포함하는 하이드로겔의 다양한 수준에서 시계열 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포막과 핵을 생염색한 후 전체 마운트 리빙 오가노이드의 공초점 현미경 이미지는 주변과 중앙에서 유사한 표지 밀도를 보여주었습니다. 또한, 전체 장착 스테로이드의 면역 형광 표지는 1 개의 항체, 2 개의 항체 및 3 개의 항체로 성공적으로 수행 될 수 있으므로 추가 치료 단계가 필요하지 않습니다.
대표적인 분석은 장치에서 두 개의 면역형광 표지된 기도 유기체를 보여줍니다. 다목적 장치에 있는 전체 스페로이드의 SEM 이미지와 절편된 스테로이드의 10개 이미지는 스페로이드, 세포질 소기관 및 기타 초구조적 세포 특징의 잘 보존된 3D 아키텍처를 나타내어 설명된 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 하이드로겔 돔의 경계에서의 불규칙성은 샘플을 동결시킨 후에 명백하였다.
그러나 스페로이드의 크기와 진원도는 비슷하게 유지되었습니다. 동결된 시료를 해동한 후 배양 표면상의 세포 이동을 관찰하였다. 이 기술은 매우 간단합니다.
그러나 연구원은 샘플 손상을 방지하기 위해 하이드로겔 방울 주변의 액체를 흡입하거나 추가하는 동안 매우 부드러워야 합니다. 연구원은 첨단 현미경을 사용하여 단일 장치에서 동일한 샘플을보고 상관 연구를 수행 할 수 있습니다.
