Organoides e esferoides, sendo muito frágeis, ficam seriamente danificados durante o manuseio. Nosso protocolo garante que essas estruturas de cultivo 3D permaneçam intactas durante vários processos, aumentando assim a precisão, a reprodutibilidade, a confiabilidade e a repetibilidade. O pesquisador pode cultivar, congelar, descongelar, processar, manchar, rotular e examinar organoides e esferoides inteiros sob vários microscópios enquanto permanecem intactos em um hidrogel dentro de um único dispositivo multiuso.
Ele permite a criação de um modelo de doença e o rastreamento de etapas sequenciais em um dispositivo multiuso. A tecnologia traz mais precisão ao examinar biomarcadores para diagnóstico e prognóstico de doenças. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema de crescimento 3D, incluindo organoides, esferoides, células individuais ou organismos vivos.
Para iniciar a cultura organoide ou esferoide, coloque o hidrogel devidamente descongelado no gelo dentro de um exaustor de fluxo laminar por 15 minutos. Além disso, mantenha o tubo contendo uma pelota do carcinoma hepatocelular, ou células HEPG2, no gelo. Em seguida, pratique 30 a 35 microlitros de 100% de hidrogel dentro do nicho do dispositivo multiuso pré-aquecido para criar uma gota de gel, coloque 10.000 células HEPG2 no centro do topo da gota de hidrogel e incube a configuração a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Após a incubação, cubra a gota de hidrogel com 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium, ou DMEM, contendo 10% de soro fetal bovino, ou FBS. Coloque a tampa no dispositivo corretamente, permitindo o fluxo de gás, antes de colocá-lo na incubadora. A cada dois dias, alimente as células com 200 microlitros de DMEM contendo 10% de FBS.
Verifique o crescimento dos esferoides sob um microscópio invertido. Antes de iniciar a marcação por imunofluorescência dos organoides, aqueça os meios e soluções necessários a 37 graus Celsius. Aspirar o meio de cultura celular em torno da gota de hidrogel antes de adicionar 200 microlitros de 4% de paraformaldeído pré-aquecido a 37 graus Celsius e fixá-lo colocando-o em uma incubadora a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos.
Em seguida, aspirar o fixador e lavar a solução para marcação por imunofluorescência, ou SIF, pré-aquecida a 37 graus Celsius três vezes por 10 minutos cada. Adicione água destilada à área ao redor do nicho para fornecer umidade antes de prosseguir com os próximos passos. Aspirar o SIF em torno da gota de hidrogel e adicionar 100 microlitros da solução de anticorpos primários pré-aquecida em SIF ao hidrogel antes de incubá-lo a 37 graus Celsius durante 30 a 60 minutos.
Em seguida, aspirar a solução primária de anticorpos e lavar com SIF pré-aquecido a 37 graus Celsius três vezes por 10 minutos cada. Após a lavagem, aspirar o SIF restante e adicionar 100 microlitros da solução de anticorpos secundários pré-aquecida em SIF ao hidrogel. Incubar o hidrogel a 37 graus Celsius no escuro por 30 a 60 minutos.
Após a incubação, aspirar a solução de anticorpos secundários e lavar a gota de hidrogel com PBS a 37 graus Celsius três vezes no escuro por 10 minutos cada. Em seguida, aspirar o PBS residual e incubar o hidrogel com 100 microlitros de coloração de DNA nuclear contendo meio de montagem ou glicerol a 37 graus Celsius no escuro. Encha o nicho com glicerol para evitar a secagem antes de fechar firmemente o dispositivo multiuso que contém o hidrogel.
Para examinar os organoides por microscopia confocal, defina os parâmetros do microscópio seguindo as instruções dadas no manuscrito. Para congelar os organoides, aspirar o meio de cultura celular, adicionar 200 microlitros da solução de congelamento pré-aquecida e incubar a amostra a 37 graus Celsius por uma hora. Feche bem a tampa do dispositivo antes de colocá-lo dentro de uma caixa de espuma.
Coloque esta caixa de espuma em outra caixa de espuma e feche ambas as caixas de espuma com força. Mantenha a caixa a menos 20 graus Celsius por duas horas e, em seguida, deixe-a durante a noite em um freezer de menos 80 graus Celsius. Para armazenar os organoides por mais de seis meses, remova o dispositivo multiuso que contém os organoides das caixas e transfira-o para o tanque de nitrogênio líquido.
Para descongelar os organoides, retire o dispositivo multiuso que contém a amostra do congelador ou do tanque de nitrogênio líquido e coloque-o diretamente em uma incubadora a 37 graus Celsius. Uma vez descongelado, aspirar suavemente a mistura de solução média e de congelação antes de adicionar o meio fresco e proceder à imagem do hidrogel organoide de montagem inteira. Em imagens vivas, os organoides em crescimento dentro do hidrogel tornaram-se visíveis três a cinco dias após a inserção do pellet celular, especialmente na periferia da cúpula do hidrogel.
A série temporal de imagens em diferentes níveis de um hidrogel contendo esferoides sob um microscópio de contraste de fase invertida é mostrada aqui. Imagens de microscopia confocal dos organoides vivos de montagem inteira após coloração viva da membrana celular e do núcleo mostraram densidade de marcação semelhante na periferia e no centro. Além disso, a marcação por imunofluorescência dos esteroides de montagem completa poderia ser realizada com sucesso com um anticorpo, dois anticorpos, bem como três anticorpos, eliminando qualquer necessidade de etapas adicionais de tratamento.
A análise representativa demonstra dois organoides das vias aéreas marcados com imunofluorescência em um dispositivo. Imagens de MEV de todos os esferoides no dispositivo multiuso e 10 imagens de esteroides seccionados indicaram arquitetura 3D bem preservada de esferoides, organelas citoplasmáticas e outras características celulares ultraestruturais, demonstrando a eficácia do protocolo descrito. A irregularidade nos limites da cúpula do hidrogel foi evidente após o congelamento das amostras.
No entanto, o tamanho e a arredondamento dos esferoides permaneceram semelhantes. A migração celular na superfície da cultura foi observada após o descongelamento das amostras congeladas. A técnica é muito simples.
No entanto, o pesquisador deve ser muito gentil ao aspirar ou adicionar quaisquer líquidos ao redor da gota de hidrogel para evitar que a amostra danifique. O pesquisador pode olhar para a mesma amostra em um único dispositivo usando um microscópio de alta tecnologia e realizar um estudo correlato.
