المواد العضوية والكروية ، كونها هشة للغاية ، تتضرر بشكل خطير أثناء التعامل معها. يضمن بروتوكولنا بقاء هذه الهياكل المتنامية 3D سليمة أثناء العمليات المختلفة ، وبالتالي زيادة الدقة والتكرار والموثوقية والتكرار. يمكن للباحث زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ وتسمية وفحص عضويات وكرويات كاملة تحت مجاهر مختلفة بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز واحد متعدد الأغراض.
يتيح إنشاء نموذج مرض وتتبع الخطوات المتسلسلة في جهاز واحد متعدد الأغراض. توفر هذه التقنية مزيدا من الدقة عند فحص المؤشرات الحيوية لتشخيص الأمراض وتشخيصها. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام نمو 3D ، بما في ذلك المواد العضوية أو الكروية أو الخلايا الفردية أو الكائنات الحية.
لبدء الثقافة العضوية أو الكروية ، ضع الهيدروجيل المذاب بشكل صحيح على الجليد داخل غطاء تدفق رقائقي لمدة 15 دقيقة. أيضا ، احتفظ بالأنبوب الذي يحتوي على حبيبات من سرطان الخلايا الكبدية ، أو خلايا HEPG2 ، على الثلج. بعد ذلك ، قم بلوحة 30 إلى 35 ميكرولتر من هيدروجيل 100٪ داخل مكانة الجهاز متعدد الأغراض الذي تم تسخينه مسبقا لإنشاء قطرة هلام ، ضع 10،000 خلية HEPG2 في وسط الجزء العلوي من قطرة هيدروجيل ، واحتضان الإعداد عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة ، قم بتغطية قطرة الهيدروجيل ب 200 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco ، أو DMEM ، الذي يحتوي على 10٪ من مصل الأبقار الجنيني ، أو FBS. ضع الغطاء على الجهاز بشكل صحيح ، مما يسمح بتدفق الغاز ، قبل وضعه في الحاضنة. كل يوم ، قم بتغذية الخلايا ب 200 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
تحقق من نمو الأجسام الكروية تحت المجهر المقلوب. قبل البدء في وضع العلامات المناعية للعضويات ، قم بتسخين الوسائط والحلول المطلوبة إلى 37 درجة مئوية. قم بشفط وسط زراعة الخلايا المحيط بقطرة الهيدروجيل قبل إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية وقم بإصلاحه بوضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بشفط المثبت وغسل المحلول لوضع العلامات المناعية ، أو SIF ، قبل تسخينه إلى 37 درجة مئوية ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. أضف الماء المقطر إلى المنطقة المحيطة بالمكان المناسب لتوفير الرطوبة قبل متابعة الخطوات التالية. استنشاق SIF المحيط بقطرة الهيدروجيل وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية الدافئة مسبقا في SIF إلى الهيدروجيل قبل حضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الأساسي واغسله باستخدام SIF المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. بعد الغسيل ، استنشاق SIF المتبقي وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي تم تسخينه مسبقا في SIF إلى الهيدروجيل. احتضان هيدروجيل عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
بعد الحضانة ، استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل قطرة هيدروجيل مع PBS عند 37 درجة مئوية ثلاث مرات في الظلام لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك ، استنشاق PBS المتبقي واحتضان الهيدروجيل مع 100 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي النووي التي تحتوي على وسط متصاعد أو الجلسرين عند 37 درجة مئوية في الظلام. املأ مكانه بالجلسرين لتجنب التجفيف قبل إغلاق الجهاز متعدد الأغراض الذي يحتوي على هيدروجيل بإحكام.
لفحص المواد العضوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، اضبط معلمات المجهر باتباع التعليمات الواردة في المخطوطة. لتجميد المواد العضوية ، قم بشفط وسائط زراعة الخلايا ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول التجميد قبل التسخين ، واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أغلق غطاء الجهاز بإحكام قبل وضعه داخل صندوق رغوة.
ضع صندوق الرغوة هذا في صندوق رغوة آخر وأغلق صندوقي الرغوة بإحكام. احتفظ بالصندوق عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين ، ثم اتركه طوال الليل في مجمد درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتخزين المواد العضوية لمدة تزيد عن ستة أشهر ، قم بإزالة الجهاز متعدد الأغراض الذي يحتوي على المواد العضوية من الصناديق وانقله إلى خزان النيتروجين السائل.
لإذابة المواد العضوية ، أخرج الجهاز متعدد الأغراض الذي يحتوي على العينة إما من الفريزر أو خزان النيتروجين السائل وضعه مباشرة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بشفط خليط المحلول المتوسط والتجميد برفق قبل إضافة وسط جديد والمضي قدما في تصوير الهيدروجيل العضوي بالكامل. في التصوير الحي ، أصبحت الكائنات العضوية المتنامية داخل الهيدروجيل مرئية بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من إدخال حبيبات الخلية ، خاصة في محيط قبة الهيدروجيل.
تظهر هنا السلسلة الزمنية للصور على مستويات مختلفة من هيدروجيل يحتوي على كرويات تحت مجهر تباين الطور المقلوب. أظهرت صور الفحص المجهري متحد البؤر للعضويات الحية الكاملة بعد تلطيخ غشاء الخلية والنواة كثافة وسم مماثلة في المحيط والمركز. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء وضع العلامات المناعية للستيرويدات الكاملة بنجاح باستخدام جسم مضاد واحد ، واثنين من الأجسام المضادة ، بالإضافة إلى ثلاثة أجسام مضادة ، مما يلغي أي حاجة لخطوات علاج إضافية.
يوضح التحليل التمثيلي اثنين من عضويات مجرى الهواء التي تحمل علامة المناعي في الجهاز. أشارت صور SEM للكرويات بأكملها في الجهاز متعدد الأغراض و 10 صور من المنشطات المجزأة إلى بنية 3D محفوظة جيدا من الأجسام الكروية والعضيات السيتوبلازمية وغيرها من الميزات الخلوية فائقة البنية ، مما يدل على فعالية البروتوكول الموصوف. كان عدم الانتظام عند حدود قبة الهيدروجيل واضحا بعد تجميد العينات.
ومع ذلك ، ظل حجم واستدارة الأجسام الكروية متشابهة. لوحظت هجرة الخلايا على سطح المزرعة بعد إذابة العينات المجمدة. هذه التقنية بسيطة جدا.
ومع ذلك ، يجب أن يكون الباحث لطيفا جدا أثناء استنشاق أو إضافة أي سوائل تحيط بقطرة الهيدروجيل لمنع إتلاف العينة. يمكن للباحث النظر إلى نفس العينة في جهاز واحد باستخدام مجهر عالي التقنية وإجراء دراسة مترابطة.
