この実験の全体的な目的は、腸内の上皮細胞透過性をインビトロおよびインビボで測定することによって上皮バリア機能障害によって引き起こされる疾患を研究することです。この方法は、炎症性腸疾患に関連するものなど、腸バリア機能分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、腸内上皮細胞の透過性がインビトロおよびインビボの両方で評価できることである。
腸上皮バリア機能障害がこれらの疾患に寄与するため、この技術の意味は、胃腸疾患の治療または診断に及ぶ。この方法は、腸のバリア機能に関する洞察を提供することができますが、薬物毒性研究や他の細胞タイプのバリア完全性などの他のシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、いくつかの手順を学習することが困難であるため、重要です。
この方法の正確な動作は、テキスト記述によって理解できるようになりました。まず、Caco-2bbe細胞を培地でT75フラスコで増殖させます。細胞密度に応じて、フラスコを定期的に供給します。
細胞が80%コンフルエントである場合は、培地を取り除き、カルシウムなしで1〜2ミリリットルの無菌PBSを使用してリンスします。トリプシンEDTAを1.5ミリリットル加え、フラスコをそっと揺らします。その後、37°Cインキュベーターに20分間、揺れることなく置きます。
細胞がトリプシン化されている間、多孔質ポリカーボネート膜を含むインサートを24ウェルプレートに入れる。次に、膜の下部スペースである基底室に培養培地を1ミリリットル加えます。フラスコに培地5ミリリットルを加え、フラスコの内側に対して細胞を5~10回激しくピペットし、培養液を緩い個々の細胞、または2〜3個の細胞塊に分離する。
膜の上部スペースである天端チャンバに細胞の0.166ミリリットルをプレートします。その後、37°Cでプレートを最大3週間インキュベートします。細胞を週3回送り、圧力ポンプを用いて各井戸の基底コンパートメントから培地を慎重に吸気する。
その後、各インサートの尖体室に1ミリリットルの培地をそっと滴り落とします。サイトカイン研究では、経上皮電気抵抗またはTER測定の1日前に、インターフェロンガンマの1ミリリットル当たり10ナノグラムを含む媒体で基底媒体を交換する。実験の日に、TNFの1ミリリットルあたり2.5または7.5ナノグラムを含むHBSSで媒体を交換してください。
メーターを補正するには、入力ポートに補正電極を挿入し、オームモードを選択します。次に、ドライバを使用して、メーターに 1,000 Ω の測定値が表示されるまで R 調整ねじを調整します。70%エタノールで15~30分間殺菌し、15秒間空気乾燥させます。
次に、実験細胞培養培地中の電極をすすい。次に、電源を入れ、オームモードを選択します。電極を垂直に保ちながら、電極ブリッジの長い端を基底室に慎重に配置し、皿に触れられるようにします。
次に、短い端を補助室に入れ、それらが培地の表面の下にとどまることを確認しますが、組織培養は挿入します。サイトカイン処理後0、1、2、3、および4時間でサンプルおよびブランクインサートの抵抗を測定します。その後、抵抗を記録します。
異なるプレートフォーマット間で一貫性を達成するために、次に示すように抵抗と有効な膜領域の積を計算します。24ウェルインサートの場合、有効な膜面積は0.33平方センチメートルです。大腸炎を誘発するには、DSSをオートクレーブ水に加え、体積当たり3.5%の重量の最終濃度にします。
次に、DSS溶液を使用して、8週齢の雄C57黒6匹のマウスのケージ内の飲料水を合計7日間交換します。マウスを制御するためにDSSなしで定期的な飲料水を与えます。7日目以降、DSS水を通常の飲料水に切り替えます。
毎日、マウスの体重を量り、直腸脱出、便の一貫性、出血、および活性の4つのパラメータによって疾患の重症度に従って定義された臨床スコアを評価する。これらのパラメータのスコアを合計して、最終的な臨床スコアを得ます。DSS治療後7日間の大腸組織の病理組織状態を解析し、テキストプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、結腸と盲腸を単離し、結腸の長さを測定する。
遠位結腸から0.5センチメートルのセグメントを切断し、10ミリリットルのホルマリンを一晩含む15ミリリットルのハヤブサチューブに組織を固定する。グレードエタノールとキシレンで固定組織を洗浄します。その後、パラフィンに組織を埋め込み、ヘマトキシリンとエオシン染色のための6ミリメートルのセクションを切断します。
DSS誘導マウスにおける上皮バリア透過性を測定するために、DSS投与開始から7日後、マウスを3時間速くする。ガバジ針をオートクレーブして無菌性を確保し、滅菌水中に4キロダルトンFITCデキストランあたり150マイクロリットルを使用してマウスを飼育し、未使用のFITCデキストランを維持して血清採取後の標準曲線を測定します。次に、透過性計算のためにマウスを重み付けします。
4時間後、IP注入によりマウスを麻酔した後、反射神経およびウィスカーの動きの欠如によって適切な麻酔を確認する。その後、マウスをヒートブロックに5分間置きます。はさみを使用して、尾の1センチメートルの部分をクリップし、血清採取チューブに尾から血液の100マイクロリットルを収集します。
採取した血液を10,000倍g、室温で10分間回転させます。水で、血清を1~4個希釈します。次に、標準曲線を作るために、水を使用して未使用のFITCデキストランの希釈液を調製する。
血清のウェルあたり100マイクロリットルを加え、標準曲線サンプルを96ウェルプレートに加えます。プレートリーダーを使用して、励起485と528の発光で蛍光を読み取ります。標準曲線に基づいて透過性値を計算し、希釈を補正するために 4 を掛けます。
FITC デキストランの濃度を重みで割って値を正規化します。これは、マウスが病気で体重が減った場合にFITCデキストランデリバリーの差を正常化するのに役立ちます。ここに示すCaco-2bbe細胞は、未分化細胞と分化細胞の違いを示すために核およびF-アクチン染色で標識した。
ストレス繊維は未分化細胞にはっきりと見られます。分化された細胞は、未分化細胞よりも体積が小さく、核が大きく、ストレス繊維が少ない。TNFはMLCK依存性の堅い接合の調節を通して腸の障壁損失に中心である。
この図に見られるように、TNFは用量依存的にCaco-2bbe単層のTERを有意に減少させ、TNFが上皮透過性を増加することを示唆している。最初の体重と比較して、DSSで治療されたマウスはかなりの量の体重を失う。大腸炎の重症度は、直腸脱、便の一貫性、出血、および活動によって採点される。
ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された大腸組織の断面は、DSS処置マウスにおける大腸粘膜損傷を示す。さらに、大腸暗号の長さだけでなく、結腸自体も、DSS処理マウスでは減少する。最後に、DSS処置マウスのFITCデキストラン染色のレベルは、コントロールマウスと比較して約2倍に増加しています。
この手順を試みる際には、運用手順を標準化し、統計的手法を利用して、エラーを最小限に抑えることを忘れないようにしてください。その開発後、この技術は、モデル生物と細胞株の両方で胃腸疾患を探求する腸バリア機能の分野の研究者への道を開いた。このビデオを見た後、TERを測定し、FITCデキストランを見学し、形態学的および組織化学的変化を観察することによって、腸上皮透過性を決定する方法をよく理解する必要があります。
