この方法は、遺伝物質を特別で一時的かつ定量的に制御可能な方法で乳腺上皮細胞に送達する。乳腺上皮細胞への遺伝物質の送達は特別で一時的かつ定量的に制御されているため、この方法によって生成された乳腺モデルは、自然な腫瘍発生をよりよく模倣します。33ゲージの金属製ハブ針を約1センチの長さに切断し、アルコールに保管することからシリンジの準備を開始します。
アルコールから注射器と針を取り外し、残りのアルコールを注射器と針から押し出します。次に、空気乾燥のためにシリンジを分解します。乾燥後、シリンジを組み立てます。
マイナス80°Cの冷凍庫からウイルスストックチューブを取り出し、氷上で解凍します。ブロモフェノールブルーを加えるには、ピペットチップをブロモフェノールブルー粉末に1センチメートルの深さまで浸します。次に、付着した微量のブロモフェノールブルーをウイルス懸濁液に入れます。
ウイルスを氷の上に置く前に、10回上下にピペッティングしてブロモフェノールブルーをウイルス溶液と混合します。麻酔をかけた雌マウスのつま先をつまんで麻酔の深さを確認します。動物が麻酔下にある間、乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。
マウスを暖かいパッドの上に仰臥位にし、粘着テープを使用して四肢すべてをベンチに取り付けます。注入する乳首を特定し、ハサミを使用して周囲の髪を整えて露出させます。70%アルコールとイオタ4本の綿棒を交互に3回に分けて乳首部分に塗り、乳首をきれいにして露出させます。
拡大鏡ランプの下に小さな中央管開口部が見えるまで、滅菌されたマイクロ解剖スプリングハサミを使用して乳首の遠位先端を横断します。次に、10マイクロリットルのウイルスブロモフェノールブルー混合物をシリンジに入れ、拡大鏡ランプを使用して針を乳首の開口部に慎重に挿入します。10マイクロリットルのウイルス全体をダクトツリーに注入し、マウスが完全に目覚めるまで摂氏45度に設定されたスライドウォーマーにマウスを置きます。
ウイルス注射の3〜5日後に胸腔を開きます。ハサミを使用して腹側の中央線と上肢と下肢に沿って皮膚を切ります。皮膚を持ち上げて乳腺を露出させます。
注射した乳腺を皮膚から取り除き、注射していない腺をコントロールとして鉗子とハサミで取り除きます。完了したら、乳腺をスライドガラスの上に置き、腺を元の形状に広げてから、蛍光実体顕微鏡で観察およびイメージングします。乳管内注射の成功は、乳腺を露出させ、青い管の木を観察することによって確認されました。
lenti-EGFPFUCGWウイルス注射の2〜5日後、乳腺上皮細胞感染を蛍光実体顕微鏡下でマウント全体標品を観察することによって評価した。ウイルスによって産生される蛍光タンパク質または細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のために、非感染腺および感染腺を採取し、単一の細胞懸濁液に処理して、ウイルス感染率を推定しました。活性化されたERBBB2は、数週間で前癌性病変を引き起こし、数ヶ月で腫瘍を引き起こしました。
乳首の大きさは、個々のマウス間の質量、年齢、体重および強度の違いにより、大きく異なり得る。乳首の先端を適切にトリミングして乳管の開口部を露出させ、針をはめ込むことは、ウイルスをうまく注入するための重要なステップです。
