まず、剃って麻酔をかけたマウスを加温パッドの上に置きます。4本目の乳首付近でピンセットで皮膚をつまみ、盛り上がった皮膚を鋭利なハサミで切って正中線を約1センチ切ります。頭蓋方向と尾側の両方で腺の周りに円形の切開を行い、腹部から皮膚を慎重に剥がします。

生理食塩水で外因性の血液を迅速に除去し、その後の光学分解能の低下を防ぎます。失血を最小限に抑えるには、ハンドヘルド焼灼器で目立つ血管を密封します。次に、細かい鉗子で表層をやさしくからかい、表在性の結合組織と脂肪組織を取り除きます。

露出した腺を生理食塩水で湿らせてください。必要に応じて、手術中に露出した腺を入浴させることにより、外因性薬剤、例えば薬理学的薬剤またはオルガネラ特異的色素で腺を治療します。腹壁を半透明の柔軟な熱可塑性フィルムで保護します。

腹部を下にしてマウスを倒立顕微鏡ステージに慎重に配置し、皮膚フラップが中央のカバーガラスに伸びるようにします。露出した領域をゲルの薄い層で保護します。後脚とテールをステージにテープで固定します。

次に、皮膚フラップと体壁の間に3本のテープで留めた綿棒から準備されたカスタムメイドのノッチ付きスペーサーを配置して、呼吸や心拍によって引き起こされる運動アーチファクトから腺をクッションします。ステージ開口部の両端にプラスチックカバーをしっかりとテープで固定し、イメージング中に皮膚フラップが滑らないようにします。チューブ、シリンジ、ポンプに取り付けられた背側の皮下に皮下留置カテーテルを挿入します。

従来の蛍光顕微鏡を使用して、皮膚フラップが十分な血流で安定していることを確認します。BODIPY 665676で標識したEGFP細胞またはEGFP膜マウスの従来の共焦点顕微鏡、およびモノダンシルペンタンで標識したEGFP膜マウスおよびモノダンシルペンタンで標識したtdTomato膜マウスの2光子顕微鏡検査を行います。EGFP細胞マウスでは、分泌上皮細胞の細胞質がEGFPによって明確に標識されました。

同時に、BODIPY 665676で染色された脂肪滴は、特に頂端表面に向かって丸い蛍光体として現れました。タイムラプス解析では、BODIPY 665676染色された脂肪滴が基底部から頂端部まで可変速度で移動し、輸送中に互いに融合していることが示されました。EGFP膜マウスでは、EGFPは毛細血管上皮細胞と分泌上皮細胞の原形質膜を強調し、BODIPYで染色された脂肪滴が細胞質全体に見られました。

EGFP膜マウスまたはtdTomato膜マウスの乳腺の2光子顕微鏡検査により、腺の形態をより包括的に調査することができました。表面のコラーゲン線維は、第2高調波発生を通じてモノダンシルペンタンチャネルで可視化されます。実質のさらに奥深くでは、分泌上皮が基底、外側、および頂端の原形質膜とモノダンシルペンタンで染色された脂質液滴によって明らかになります。

中央の内腔は、肺胞のさらに奥まで明らかになります。赤色のtdTomato蛍光色素は、EGFP細胞マウスのEGFPとは異なり、毛細血管内皮の標識に特に有用でした。