このプロトコルは、脂肪細胞でゲイン機能アッセイを実行するための従来のウイルスベクターの代替戦略としてSPH CRISPR活性化システムを提示します。アデノ随伴ウイルスを使用してカスタマイズされた単一ガイドRNAを送達することにより、脂肪組織の複雑な細胞環境内で単一または複数の脂肪細胞内因性遺伝子の過剰発現を可能にします。このプロトコルの困難なステップは、単一ガイドRNAのクローニングと、脂肪組織へのアデノ随伴ウイルスの産生と注入に関連しています。
まず、チョップチョップまたはその他の適切なツールを使用して、CRISPR活性化用のシングルガイドRNAまたはsgRNAを設計します。以下のパラメータを使用してPRDM16遺伝子を標的とするsgRNAを設計します:CRISPR/Cas9を使用して筋肉筋のPRDM16として標的とし、活性化として。ベクター骨格PAAVU6GRNACBHMチェリーのSac1制限部位と一致するようにsgRNAにオーバーハングを追加します。
5'AGCT 3'を含み、ここでnはヌクレオチドに対応する。示されたツールを使用して3'sgRNA逆補体配列を取得します。次に、一本鎖相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングのために、各5'および3'一本鎖オリゴヌクレオチド1マイクロリットル、T4リガーゼ緩衝液1マイクロリットル、T4ポリヌクレオチドキナーゼ0.5マイクロリットル、および6.5マイクロリットルの水を加えて、最終反応容量10マイクロリットルとする。
相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをサーモサイクラーを用いて摂氏37度で30分間、摂氏95度で5分間アニーリングした後、毎分摂氏5度のランプダウン率でアニーリングします。次に、アニーリングされたsgRNAオリゴヌクレオチドのライゲーションのために、25ナノグラムのプラスミドPAAVU6GRNACBHMチェリーを2マイクロリットルのアニーリングされたsgRNAオリゴヌクレオチド、1マイクロリットルのSac1酵素、2マイクロリットルの10X T4 DNAリガーゼバッファー、1マイクロリットルのT4 DNAリガーゼおよび水を最終反応容量10マイクロリットルに加える。サーモサイクラーを用いて、反応混合物を摂氏37度で5分間、25度で5分間インキュベートした後、摂氏4度で保持してライゲーションを行います。
次に、コンピテント大腸菌DH10B細胞を4マイクロリットルのライゲーション産物で摂氏42度で45秒間のヒートショックで形質転換し、1ミリリットルあたり10マイクログラムのアンピシリンを含む寒天プレートに広げます。PCRマスターミックスを用いたコロニーポリメラーゼ連鎖反応またはPCRによって形質転換されたコロニーを確認し、コロニーをピックし、5マイクロリットルのマスターミックス、0.1マイクロリットルのユニバーサルプライマー、0.1マイクロリットルのsgRNAリバースプライマー、および5マイクロリットルの水と混合します。初期変性を摂氏94度で2分間、続いて摂氏94度で20秒間35サイクル変性し、摂氏60度で30秒間アニーリングし、摂氏72度で30秒間伸長し、最後の伸長ステップを摂氏72度で5分間使用してPCRを実行します。
PCR後、0.5X TAEバッファー中でアガロースゲル電気泳動を使用し、90ボルトで30分間DNAを分離します。ユニバーサルプライマーを使用したサンガーシーケンシングの陽性サンプルを提出してください。次に、製造元の指示に従ってプラスミド精製キットを用いて陽性クローンからプラスミドを精製する。
麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、股関節の近位の脇腹の小さな領域を剃り、鼠径部の白色脂肪組織またはシェーバーによるIWAT注射を行います。脱毛クリームを5分間加えます。皮膚のやけどを防ぐために、残りのクリームを水で取り除きます。
清潔なガーゼと70%アルコールで皮膚にポビドンヨード溶液を塗布する3ラウンドを交互に使用して皮膚を消毒します。次に、関節の近位部に滅菌ハサミで1〜2センチの切開を行い、鉗子を使用して皮膚を開いたままにして脂肪蓄積を露出させます。WATは両側の皮膚に取り付けることができ、最初から背中から精巣に向かって伸ばすことができます。
鉗子を使用して、脂肪デポーを切開部からゆっくりと上に引き上げ、注射が正しい位置と深さにあることを確認します。マイクロリットルのシリンジに、内因性PRDM16遺伝子を標的とするsgRNAを含む2.5マイクロリットルのアデノ随伴ウイルスまたはAAVを充填します。針をIWATに30〜45度の角度で慎重に挿入します。
組織の異なる場所に注射を5回繰り返して、IWAT脂肪パッド全体に均一に感染します。意識が回復するまでマウスを加熱パッドに置きます。完全に回復するまで、10〜15分ごとに動物を監視します。
動物が意識を取り戻した後、機関車のプロファイリングを観察してください、それは直線的であるべきであり、苦痛や痛みの兆候がないはずです。脂肪SPHマウスIWATに由来する間質血管細胞またはSVFを、完全なDMEM培地を含む6ウェルプレートに1〜2時間観察し、培地を吸引し、PBSを使用してウェルを2回洗浄し、新鮮な完全培地と交換します。細胞が70〜80%のコンフルエント性に達するまで、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で細胞をインキュベートします。
0日目に、細胞を誘導培地で処理して分化を誘導し、2日後に誘導培地を維持培地と交換する。再び2日後、4日目に、2〜3日間、メンテナンス培地を新しいメンテナンス培地と交換します。脂肪前駆細胞が脂肪細胞に完全に分化するまで、48時間ごとに維持培地を交換してください。
分化した細胞に脂肪滴がロードされているように見えるので、光学顕微鏡を使用して成熟脂肪細胞を観察します。細胞が70〜80%コンフルエントに達するまで、完全培地を含む6ウェル培養プレート上で細胞を増殖させた後、AAVを運ぶsgRNA PRDM16のマイクロリットルあたり5.6 * 10 ^ 10のウイルスゲノムを2ミリリットルの完全培地および臭化ヘキサジメトリンと混合します。完全な培地を交換し、AAVを含む完全な培地を添加することにより、細胞を形質導入します。
形質導入した細胞を摂氏37度、湿度95%、二酸化炭素5%で12時間インキュベートします。細胞増殖およびベージュ脂肪細胞への分化について説明したように細胞を分割して見る。アディポSPHマウスのIWATからの免疫蛍光画像は、対照群およびPRDM16群の両方においてdCas9の発現を実証した。
SPH誘導PRDM16発現は、多眼ベージュ脂肪細胞のIWATへの広範な蓄積を明らかに誘導した。さらに、定量PCRにより、PRDM16群では対照と比較してPRDM16および熱発生遺伝子プログラムの発現が増加していることが明らかになりました。同様に、インビトロ遺伝子発現解析により、PRDM16過剰発現群における内因性PRDM16遺伝子および熱発生遺伝子の発現増加が対照と比較して確認された。
SPHによって誘導されたPRDM16発現は、対照細胞よりも高い基礎および最大酸素消費量をもたらしました。重要なことに、データは、対照群と比較してPRDM16群の非共役呼吸の増加を示した。Adipo SPHモデルは、脂肪細胞内の複数の遺伝子や調節要素の調査に適しています。
この方法は、ベージュ脂肪生物学のより深い理解の可能性を開きます。
