Questo protocollo presenta il sistema di attivazione SPH CRISPR come una strategia alternativa ai vettori virali convenzionali per eseguire saggi di funzione di guadagno negli adipociti. Consente la sovraespressione di geni endogeni adipociti singoli o multipli all'interno del complesso ambiente cellulare del tessuto adiposo fornendo un singolo RNA guida personalizzato utilizzando un virus adeno associato. Le fasi impegnative di questo protocollo sono legate alla clonazione del singolo RNA guida e alla produzione e iniezione di virus adeno-associato nel tessuto adiposo.
Per iniziare, progetta un singolo RNA guida o sgRNA per l'attivazione di CRISPR usando chopchop o qualsiasi altro strumento adatto. Progettare l'sgRNA che prende di mira il gene PRDM16 utilizzando i seguenti parametri:Target come PRDM16 in un Mus musculus usando un CRISPR / Cas9 e per come attivazione. Aggiungi sporgenze allo sgRNA per abbinare il sito di restrizione Sac1 nella dorsale vettoriale PAAVU6GRNACBHM ciliegia.
Includere 5'AGCT 3'dove n corrisponde ai nucleotidi. Ottenere la sequenza di complemento inverso di 3'sgRNA usando lo strumento indicato. Successivamente, per la ricottura di oligonucleotidi complementari a singolo filamento, aggiungere un microlitro di ogni oligonucleotide a singolo filamento 5' e 3', un microlitro di tampone T4 ligasi, 0,5 microlitri di polinucleotide chinasi T4 e 6,5 microlitri di acqua per un volume di reazione finale di 10 microlitri.
Ricottura degli oligonucleotidi a singolo filamento complementari utilizzando un termociclatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti e 95 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da una velocità di discesa di cinque gradi Celsius al minuto. Quindi per la legatura degli oligonucleotidi sgRNA ricotti aggiungere 25 nanogrammi di ciliegia plasmide PAAVU6GRNACBHM a due microlitri di oligonucleotidi sgRNA ricotti, un microlitro di enzima Sac1, due microlitri di tampone 10X T4 DNA ligasi, un microlitro di T4 DNA ligasi e acqua per un volume di reazione finale di 10 microlitri. Utilizzando un termociclatore, eseguire la legatura incubando la miscela di reazione per 15 cicli a 37 gradi Celsius per cinque minuti e 25 gradi Celsius per cinque minuti seguita da tenere a quattro gradi Celsius.
Successivamente, trasformare le cellule competenti di Escherichia coli DH10B con quattro microlitri di prodotto di legatura mediante shock termico a 42 gradi Celsius per 45 secondi e distribuire su una piastra di agar contenente 10 microgrammi per millilitro di ampicillina. Confermare le colonie trasformate mediante Colony Polymerase Chain Reaction o PCR utilizzando il Master Mix PCR, prelevare la colonia e mescolarla con cinque microlitri di Master Mix, 0,1 microlitri di primer universale, 0,1 microlitri di primer inverso sgRNA e cinque microlitri di acqua. Eseguire la PCR utilizzando la denaturazione iniziale a 94 gradi Celsius per due minuti, seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 20 secondi, ricottura per 30 secondi a 60 gradi Celsius, estensione a 72 gradi Celsius per 30 secondi e una fase di allungamento finale a 72 gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo la PCR, risolvere il DNA utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio in tampone TAE 0,5X a 90 volt per 30 minuti. Invia campioni positivi per il sequenziamento Sanger utilizzando primer universale. Quindi, purificare il plasmide da un clone positivo utilizzando un kit di purificazione del plasmide seguendo le istruzioni del produttore.
Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina e radere una piccola area sui fianchi prossimali alle articolazioni dell'anca per il tessuto adiposo bianco inguinale o iniezioni IWAT con un rasoio. Aggiungere la crema depilatoria per cinque minuti. Rimuovere la crema residua con acqua per evitare ustioni cutanee.
Disinfettare la pelle usando tre cicli alternati di applicazione della soluzione di iodio povidone sulla pelle con una garza pulita e alcool al 70%. Quindi, praticare un'incisione da uno a due centimetri con forbici sterilizzate nella zona prossimale delle articolazioni e tenere la pelle aperta usando una pinza per esporre il deposito di grasso. Il WAT può essere attaccato alla pelle su entrambi i lati estendendolo dall'inizio dalla schiena e verso i testicoli.
Utilizzando una pinza, tirare delicatamente il deposito di grasso verso l'alto attraverso l'incisione per assicurarsi che l'iniezione sia nella posizione e nella profondità corrette. Riempire la siringa da microlitri con 2,5 microlitri di virus adeno-associato o un AAV contenente l'sgRNA che ha come bersaglio il gene endogeno PRDM16. Inserire con cautela l'ago con un angolo di 30-45 gradi nell'IWAT.
Ripetere l'iniezione cinque volte in diverse posizioni del tessuto per infettare in modo omogeneo l'intero cuscinetto adiposo IWAT. Posizionare il mouse sulla piastra riscaldante fino a quando la coscienza non viene riacquistata. Monitorare l'animale ogni 10-15 minuti fino a quando non si riprende completamente.
Dopo che l'animale ha ripreso conoscenza osservare il profilo della locomotiva, che dovrebbe essere lineare e non avere segni di angoscia o dolore. Vedere le cellule vascolari stromali o SVF derivate da adipo SPH mouse IWAT in una piastra a 6 pozzetti contenente mezzo DMEM completo per una o due ore, aspirare il mezzo, lavare il pozzetto due volte usando PBS e sostituirlo con terreno fresco e completo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 95% di umidità fino a quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza.
Al giorno 0, indurre la differenziazione trattando le cellule con il mezzo di induzione e dopo due giorni sostituire il mezzo di induzione con il mezzo di mantenimento. Di nuovo dopo due giorni, al quarto giorno, sostituire il mezzo di manutenzione con un nuovo mezzo di manutenzione per 2-3 giorni. Cambiare il mezzo di mantenimento ogni 48 ore fino a quando i preadipociti non sono completamente differenziati in adipociti.
Osservare gli adipociti maturi usando la microscopia ottica poiché le cellule differenziate sembrano essere cariche di goccioline lipidiche. Dopo aver fatto crescere le cellule su una piastra di coltura a 6 pozzetti con il mezzo completo fino a quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, mescolare 5,6 * 10 ^ 10 genoma virale per microlitro di sgRNA trasportatore di AAV PRDM16 con due millilitri di terreno completo e bromuro di esadimetrina. Trasduci le celle sostituendo il mezzo completo e aggiungendo il mezzo completo contenente AAV.
Incubare le cellule trasdotte per 12 ore a 37 gradi Celsius 95% di umidità e 5% di anidride carbonica. Dividi e vedi le cellule come descritto per la proliferazione cellulare e la differenziazione in adipociti beige. Le immagini di immunofluorescenza da IWAT di topi adipo SPH hanno dimostrato l'espressione di dCas9 sia nel gruppo di controllo che in quello PRDM16.
L'espressione di PRDM16 indotta da SPH ha chiaramente indotto un accumulo diffuso di adipociti beige multioculari in IWAT. Inoltre, la PCR quantitativa ha rivelato una maggiore espressione di PRDM16 e del programma genico termogenico nel gruppo PRDM16 rispetto al controllo. Allo stesso modo, l'analisi dell'espressione genica in vitro ha confermato l'aumento dell'espressione del gene endogeno PRDM16 e dei geni termogenici nel gruppo di sovraespressione PRDM16 rispetto al controllo.
L'espressione di PRDM16 indotta da SPH ha comportato un consumo di ossigeno basale e massimo più elevato rispetto a quello delle cellule di controllo. È importante sottolineare che i dati hanno indicato una maggiore respirazione disaccoppiata nel gruppo PRDM16 rispetto a quella nel gruppo di controllo. Il modello Adipo SPH è adatto per studiare più geni ed elementi regolatori all'interno degli adipociti.
Questo metodo apre la possibilità di una comprensione più profonda della biologia del grasso beige.
