이 프로토콜은 지방 세포에서 이득 기능 분석을 수행하기 위한 기존 바이러스 벡터에 대한 대안 전략으로 SPH CRISPR 활성화 시스템을 제시합니다. 그것은 아데노 관련 바이러스를 사용하여 맞춤형 단일 가이드 RNA를 전달함으로써 지방 조직의 복잡한 세포 환경 내에서 단일 또는 다중 지방 세포 내인성 유전자의 과발현을 허용합니다. 이 프로토콜의 어려운 단계는 단일 가이드 RNA를 클로닝하고 아데노 관련 바이러스를 생산 및 지방 조직에 주입하는 것과 관련이 있습니다.
먼저, 찹찹(chopchop) 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 PRDM16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: CRISPR/Cas9를 사용하여 Mus musculus에서 PRDM16으로 표적 및 활성화를 위해. 벡터 백본 PAAVU6GRNACBHM 체리의 Sac1 제한 부위와 일치하도록 sgRNA에 돌출부를 추가합니다.
여기서 n은 뉴클레오티드에 대응하는 5'AGCT 3'를 포함한다. 표시된 도구를 사용하여 3'sgRNA 역보체 서열을 얻습니다. 다음에, 단일-가닥 상보적 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 위해, 10 마이크로리터의 최종 반응 부피를 위해 각각의 5' 및 3' 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 1 마이크로리터, T4 리가제 완충제 1 마이크로리터, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 0.5 마이크로리터 및 물 6.5 마이크로리터를 첨가한다.
섭씨 37도에서 30분 동안, 섭씨 95도에서 5분 동안 열순환기를 사용하여 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 다음 분당 섭씨 5도의 램프 다운 속도를 수행합니다. 그런 다음 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드의 결찰을 위해 2마이크로리터의 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드, 1마이크로리터의 Sac1 효소, 2마이크로리터의 10X T4 DNA 리가아제 완충액, 1마이크로리터의 T4 DNA 리가아제 및 물을 10마이크로리터의 최종 반응 부피에 25나노그램의 플라스미드 PAAVU6GRNACBHM 체리를 추가합니다. 열순환기를 사용하여 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 5분 동안 15사이클 동안 인큐베이션하고 섭씨 25도에서 5분 동안 인큐베이션한 후 섭씨 4도에서 유지하여 결찰을 수행합니다.
다음에, 유능한 대장균 DH10B 세포를 섭씨 42도에서 45초 동안 열 충격에 의해 4 마이크로리터의 결찰 생성물로 변형시키고, 밀리리터당 10 마이크로그램의 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 퍼뜨린다. PCR Master Mix를 사용하여 Colony Polymerase Chain Reaction 또는 PCR로 형질전환된 콜로니를 확인하고, 콜로니를 선택하여 5마이크로리터의 마스터 믹스, 0.1마이크로리터의 범용 프라이머, 0.1마이크로리터의 sgRNA 역방향 프라이머 및 5마이크로리터의 물과 혼합합니다. 섭씨 94도에서 2분 동안 초기 변성을 수행한 후 섭씨 94도에서 20초 동안 35주기의 변성, 섭씨 60도에서 30초 동안 어닐링, 섭씨 72도에서 30초 동안 연장, 섭씨 72도에서 5분 동안 최종 신장 단계를 사용하여 PCR을 실행합니다.
PCR 후, 90 볼트에서 30 분 동안 0.5X TAE 버퍼에서 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 DNA를 분해합니다. 범용 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱을 위해 양성 샘플을 제출합니다. 다음으로, 제조자의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 양성 클론으로부터 플라스미드를 정제한다.
마취된 마우스를 앙와위 자세로 놓고 사타구니 백색 지방 조직 또는 면도기로 IWAT 주사를 위해 고관절 근위의 옆구리의 작은 부위를 면도합니다. 5 분 동안 탈모 크림을 첨가하십시오. 피부 화상을 방지하기 위해 물로 잔류 크림을 제거하십시오.
깨끗한 거즈와 70% 알코올로 포비돈 요오드 용액을 피부에 세 번 번갈아 가며 바르고 피부를 소독합니다. 그런 다음 관절의 근위 부위에 멸균 된 가위로 1-2 센티미터 절개를하고 집게를 사용하여 피부를 열어 지방 저장소를 노출시킵니다. WAT는 양쪽 피부에 부착 할 수 있으며 처음부터 뒤에서 고환쪽으로 확장 할 수 있습니다.
집게를 사용하여 절개를 통해 지방 저장소를 위쪽으로 부드럽게 당겨 주사가 올바른 위치와 깊이에 있는지 확인합니다. 마이크로리터 주사기에 2.5마이크로리터의 아데노 관련 바이러스 또는 내인성 PRDM16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 포함하는 AAV를 채웁니다. 바늘을 IWAT에 30-45도 각도로 조심스럽게 삽입합니다.
조직의 다른 위치에 주사를 5회 반복하여 전체 IWAT 지방 패드를 균질하게 감염시킵니다. 의식이 회복될 때까지 가열 패드에 마우스를 올려 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 10-15 분마다 동물을 모니터링하십시오.
동물이 의식을 회복한 후 기관차 프로파일링을 관찰하십시오., 선형이어야 하고 고통이나 고통의 징후가 없어야 합니다. adipo SPH 마우스 IWAT로부터 유래한 기질 혈관 세포 또는 SVF를 완전한 DMEM 배지가 들어있는 6-웰 플레이트에 1 내지 2시간 동안 넣고, 배지를 흡인하고, PBS를 사용하여 웰을 두 번 세척하고, 이를 신선하고 완전한 배지로 교체한다. 세포가 70-80% confluency에 도달할 때까지 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 및 95% 습도에서 세포를 배양합니다.
Day 0에서, 유도 배지로 세포를 처리하여 분화를 유도하고, 2일 후에 유도 배지를 유지 배지로 교체한다. 다시 2 일 후, 4 일째에 2-3 일 동안 유지 보수 매체를 새로운 유지 보수 매체로 교체하십시오. 지방전구세포가 지방세포로 완전히 분화될 때까지 48시간마다 유지 배지를 교체하십시오.
분화된 세포에 지질 방울이 가득 차 있는 것처럼 보이는 것을 광학 현미경을 사용하여 성숙한 지방 세포를 관찰합니다. 세포가 70-80% confluency에 도달할 때까지 완전한 배지가 있는 6-Well 배양 플레이트에서 세포를 성장시킨 후 AAV 운반 sgRNA PRDM16 마이크로리터당 5.6*10^10 바이러스 게놈과 2밀리리터의 완전 배지 및 헥사디메트린 브로마이드를 혼합합니다. 완전한 배지를 교체하고 AAV를 포함하는 완전한 배지를 추가하여 세포를 형질도입합니다.
형질도입된 세포를 섭씨 37도, 습도 95%, 이산화탄소 5%에서 12시간 동안 배양합니다. 세포를 베이지색 지방세포로의 세포 증식 및 분화에 대해 기재된 바와 같이 분할하고 본다. adipo SPH 마우스의 IWAT의 면역형광 이미지는 대조군과 PRDM16 그룹 모두에서 dCas9의 발현을 입증했습니다.
SPH 유도 PRDM16 발현은 다안구 베이지색 지방세포가 IWAT에 광범위하게 축적되도록 명확하게 유도했습니다. 또한, 정량적 PCR은 대조군에 비해 PRDM16 그룹에서 PRDM16 및 열 발생 유전자 프로그램의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, in vitro 유전자 발현 분석을 통해 대조군에 비해 PRDM16 과발현 군에서 내인성 PRDM16 유전자 및 열발생 유전자의 발현 증가를 확인하였다.
SPH 유도 PRDM16 발현은 대조군 세포보다 더 높은 기저 및 최대 산소 소비를 초래했습니다. 중요하게도, 데이터는 대조군에 비해 PRDM16 그룹에서 향상된 비결합 호흡을 나타냅니다. Adipo SPH 모델은 지방세포 내의 여러 유전자 및 조절 요소를 조사하는 데 적합합니다.
이 방법은 베이지 색 지방 생물학에 대한 더 깊은 이해의 가능성을 열어줍니다.
