Этот протокол представляет систему активации SPH CRISPR в качестве альтернативной стратегии обычным вирусным векторам для выполнения анализов функции усиления в адипоцитах. Он обеспечивает сверхэкспрессию одного или нескольких эндогенных генов адипоцитов в сложной клеточной среде жировой ткани, доставляя индивидуальную единую направляющую РНК с использованием аденоассоциированного вируса. Сложные этапы этого протокола связаны с клонированием единой направляющей РНК, а также с производством и инъекцией аденоассоциированного вируса в жировую ткань.
Для начала разработайте однонаправляющую РНК или сгРНК для активации CRISPR с помощью chopchop или любого другого подходящего инструмента. Разработайте sgRNA, нацеленную на ген PRDM16, используя следующие параметры:Нацеливайтесь как PRDM16 в мускулусе Mus с использованием CRISPR/Cas9 и для активации. Добавьте выступы к sgRNA, чтобы они соответствовали сайту рестрикции Sac1 в векторной основной цепи вишни PAAVU6GRNACBHM.
Включите 5'AGCT 3', где n соответствует нуклеотидам. Получите последовательность обратного комплемента 3-й сгРНК с помощью указанного инструмента. Затем для отжига одноцепочечных комплиментарных олигонуклеотидов добавьте по одному микролитру каждого 5'- и 3'-одноцепочечного олигонуклеотида, один микролитр буфера Т4-лигазы, 0,5 микролитра Т4-полинуклеотидкиназы и 6,5 микролитра воды для конечного объема реакции 10 микролитров.
Отжигают дополнительные одноцепочечные олигонуклеотиды с помощью термоциклера при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут и 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем увеличивают скорость до пяти градусов Цельсия в минуту. Затем для лигирования отожженных олигонуклеотидов sgRNA добавляют 25 нанограммов плазмиды PAAVU6GRNACBHM вишни к двум микролитрам отожженных олигонуклеотидов sgRNA, одному микролитру фермента Sac1, двум микролитрам 10X буфера ДНК-лигазы T4, одному микролитру ДНК-лигазы T4 и воде к конечному реакционному объему 10 микролитров. Используя термоциклер, выполняйте лигирование, инкубируя реакционную смесь в течение 15 циклов при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут и 25 градусах Цельсия в течение пяти минут с последующей выдержкой при четырех градусах Цельсия.
Затем трансформируйте компетентные клетки Escherichia coli DH10B четырьмя микролитрами продукта лигирования путем теплового шока при температуре 42 градуса Цельсия в течение 45 секунд и распределите на агаровой пластине, содержащей 10 микрограммов на миллилитр ампициллина. Подтвердите трансформированные колонии с помощью колони-полимеразной цепной реакции или ПЦР с использованием мастер-смеси ПЦР, выберите колонию и смешайте ее с пятью микролитрами мастер-микса, 0,1 микролитра универсального праймера, 0,1 микролитра обратного праймера сгРНК и пятью микролитрами воды. Запустите ПЦР, используя начальную денатурацию при 94 градусах Цельсия в течение двух минут, затем 35 циклов денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 20 секунд, отжиг в течение 30 секунд при 60 градусах Цельсия, удлинение при 72 градусах Цельсия в течение 30 секунд и последний этап удлинения при 72 градусах Цельсия в течение пяти минут.
После ПЦР рассасывайте ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле в 0,5-кратном буфере TAE при напряжении 90 вольт в течение 30 минут. Отправьте положительные образцы для секвенирования по Сэнгеру, используя универсальный праймер. Затем очистите плазмиду от положительного клона с помощью набора для очистки плазмиды, следуя инструкциям производителя.
Поместите анестезированную мышь в положение лежа на спине и побрейте небольшой участок на боках проксимальнее тазобедренных суставов для паховой белой жировой ткани или инъекций IWAT бритвой. Добавьте крем для депиляции на пять минут. Удалите остатки крема водой, чтобы избежать ожогов кожи.
Продезинфицируйте кожу, используя три чередующихся раунда нанесения раствора повидон-йода на кожу с чистой марлей и 70%-ным спиртом. Затем сделайте стерилизованными ножницами разрез на один-два сантиметра в проксимальной области суставов и держите кожу открытой с помощью щипцов, чтобы обнажить жировое депо. WAT может быть прикреплен к коже с обеих сторон, расширяя ее с самого начала от спины и к яичкам.
Используя щипцы, осторожно потяните жировое депо вверх через разрез, чтобы убедиться, что инъекция находится в правильном месте и на правильной глубине. Наполните микролитровый шприц 2,5 микролитрами аденоассоциированного вируса или AAV, содержащего сгРНК, нацеленную на эндогенный ген PRDM16. Осторожно вставьте иглу под углом 30-45 градусов в IWAT.
Повторите инъекцию пять раз в разные места ткани, чтобы гомогенно инфицировать весь жировой пакет IWAT. Положите мышь на грелку до тех пор, пока сознание не будет восстановлено. Наблюдайте за животным каждые 10-15 минут, пока оно полностью не выздоровеет.
После того, как животное придет в сознание, наблюдайте за профилированием локомотива, которое должно быть линейным и не иметь признаков дистресса или боли. Посмотрите на стромальные сосудистые клетки или SVF, полученные из мыши с адипо SPH, IWAT в 6-луночную пластину, содержащую полную среду DMEM, в течение одного-двух часов, аспирируйте среду, дважды промойте лунку с помощью PBS и замените ее свежей полной средой. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и влажности 95%, пока клетки не достигнут слияния 70-80%.
На 0-й день индуцируют дифференцировку, обрабатывая клетки индукционной средой, а через два дня заменяйте индукционную среду поддерживающей средой. Снова через два дня, на четвертый день, замените поддерживающую среду свежей поддерживающей средой на 2-3 дня. Меняйте поддерживающую среду каждые 48 часов до тех пор, пока преадипоциты полностью не дифференцируются в адипоциты.
Наблюдайте за зрелыми адипоцитами с помощью световой микроскопии, так как дифференцированные клетки, по-видимому, загружены липидными каплями. После выращивания клеток на 6-луночной культуральной пластине с полной средой до тех пор, пока клетки не достигнут 70-80% слияния, смешайте 5,6 * 10 ^ 10 вирусного генома на микролитр ААВ-несущей сгРНК PRDM16 с двумя миллилитрами полной среды и гексадиметрина бромидом. Трансдуцируют клетки, заменяя полную среду и добавляя полную среду, содержащую AAV.
Инкубируйте трансдуцированные клетки в течение 12 часов при 37 градусах Цельсия, влажности 95% и углекислом газе 5%. Разделите и посмотрите на клетки, как описано для пролиферации и дифференцировки клеток в бежевые адипоциты. Иммунофлуоресцентные изображения из IWAT мышей с адипо SPH продемонстрировали экспрессию dCas9 как в контрольной группе, так и в группе PRDM16.
SPH-индуцированная экспрессия PRDM16 явно индуцировала широкое накопление мультиглазных бежевых адипоцитов в IWAT. Кроме того, количественная ПЦР выявила повышенную экспрессию PRDM16 и термогенной генной программы в группе PRDM16 по сравнению с контролем. Аналогичным образом, анализ экспрессии генов in vitro подтвердил повышенную экспрессию эндогенного гена PRDM16 и термогенных генов в группе гиперэкспрессии PRDM16 по сравнению с контролем.
Индуцированная SPH экспрессия PRDM16 приводила к более высокому базальному и максимальному потреблению кислорода, чем в контрольных клетках. Важно отметить, что данные указывали на усиленное несвязанное дыхание в группе PRDM16 по сравнению с контрольной группой. Модель Adipo SPH подходит для исследования нескольких генов и регуляторных элементов в адипоцитах.
Этот метод открывает возможность более глубокого понимания биологии бежевого жира.
