私たちのプロトコルは、さまざまな細胞株における複製ストレスのマーカーである一本鎖DNAを定量するための非常に効率的で再現性のある方法を提供します。さらに、そのシンプルさにより、高スループットのアプリケーションと画面が可能になります。特に、この方法は、いくつかの卵巣癌の特徴である複製ストレスの迅速な定量化を可能にする。
また、ホストの自動分析ソフトウェアにも適しており、効率をさらに向上させます。一本鎖DNAは現在、DNA修復経路を標的とする化学療法への応答のバイオマーカーとして積極的に検討されています。したがって、この方法はそのシナリオに非常に適しています。
複製ストレスは、卵巣癌の文脈またはBRCA1、BRCA2欠損癌を超えて存在します。したがって、この方法は、他の幅広い細胞型または疾患の状況に適用することができる。まず、直径12mmのオートクレーブ処理したカバースリップとポリリジン溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに加えてポリリジンコーティングされたカバースリップを作り、ロッカーに15分間置きます。
組織培養フード上で溶液を吸引する。滅菌水を加えてカバースリップを洗い、カバースリップが入っているチューブをロッカーに5分間戻します。カバースリップを3回洗浄した後、チューブから水を吸引し、カバースリップを滅菌皿に広げます。
残りの水を吸引し、組織培養フード内で1時間、または水滴がなくなるまで乾燥させます。乾いたら、皿をパラフィルムで密封し、摂氏4度に置きます。抽出前ステップ中にカバースリップから細胞が剥離するのを防ぐために、ポリリジンコーティングされたカバースリップを24ウェルプレートの各ウェルに1つずつ配置します。
OVCAR3細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、プレートから培地を吸引し、5〜7ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。プレートからPBSを吸引します。PBSを吸引した後、1ミリリットルの0.25%トリプシンを加え、摂氏37度のインキュベーターに8〜10分間、または細胞がプレートの底から浮き上がるまで皿を置きます。
5〜10ミリリットルの培地で細胞を収集し、細胞懸濁液を円錐形のチューブに加えます。標準的な手順を使用して、血球計算盤で手動で細胞を数えます。次に、細胞懸濁液を希釈し、3つの集団の後に70〜80%のコンフルエント性をもたらす数を得る。
24ウェルプレートのウェルに入れたポリリジンカバースリップに1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、標準条件下で培養液中で細胞を増殖させます。1つの集団倍増後、プレートから既存の培地を吸引し、その後の2つの集団倍増のために10マイクロモルIdUで細胞をパルスします。細胞を回収するには、氷上で5分間、氷冷した0.5%PBSTxで培地を交換します。
細胞を固定するには、PBSTxを吸引し、室温で3%パラホルムアルデヒドで細胞を15分間インキュベートします。PBSで3〜4回洗浄した後、さらに使用するまで固定セルを摂氏4度に保ちます。固定後、氷上で0.5%PBSTxを5分間使用して細胞を透過し、カバースリップ全体を確実に覆います。
室温で1ミリリットルの0.2%PBSTで細胞を3〜4回洗浄した後、PBSTを吸引し、PBS製の5%BSAを使用して室温で30分間サンプルをブロックします。免疫染色のために、平らな底のタッパーウェアの上に濡れたペーパータオルを置くことによって統一された部屋を準備してください。24ウェルプレートの蓋をパラフィルムで覆います。
加湿チャンバーに入れ、プレートの蓋にカバースリップを置きます。カバースリップの上部に60マイクロリットルの希釈抗BrdU一次マウス抗体を追加します。あるいは、抗体の乾燥を減らし、使用量を減らすには、希釈した抗体を一滴パラフィルムの上に置き、カバースリップをその上にひっくり返します。
その後、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体を吸引します。カバースリップを24ウェルプレートに戻し、0.2%PBSTで4回洗浄します。
前述のようにカバースリップに希釈した二次抗体を加え、室温で暗所で1時間インキュベートします。顕微鏡スライドにラベルを付け、DAPI封入剤でスライドにカバースリップを取り付けます。封入剤を硬化または硬化させる必要がある場合は、スライドを室温で暗所に24時間保管してください。
0.5ミリモルのヒドロキシ尿素で未処理および処理した細胞に由来する核を染色し、DAPIおよびIdUチャネルで識別できるようにしました。これらの画像の分析は、各核の病巣の数を定量化することからなる。病巣の数は、複製ストレスの程度に比例する。
IdUパルスの時間は、より長いまたはより短い倍加期間で変化する可能性があるため、選択した細胞株の倍加時間を考慮することが重要です。あるいは、細胞に複製プロテインAをプローブして結果を確認し、細胞内のさまざまな複製ストレス応答を評価することもできます。この技術は、単一のひずみDNAの蓄積を調べるために、任意のDNA損傷誘発剤と組み合わせて多くの細胞株に使用されます。
したがって、この方法は広くアクセス可能で適用可能です。
