このプロトコルにより、負荷時に腱内の局所組織株の測定が可能になります。腱が機械的にどのように振る舞い、それらの負荷環境に適応するかを理解することは有用です。この技術の主な利点は、使用されるソフトウェアがオンラインで公開されており、真の組織株が不明な場合でも測定精度に関するフィードバックを提供することです。
腱の局所組織ひずみを測定することは、腱の変性と修復中に細胞がどのように組織をリモデリングするかを理解するのに役立ちます。この手順を実演するのは、学部生のスタントン・ゴッドシャルと、私の研究室の博士課程の学生であるクリシュナ・ペダプロルです。採取したアキレス腱をDTAFで染色した後、組織をDTAF溶液からDRAQ5溶液に移し、暗空間で室温で10分間インキュベートします。
腱を引張荷重装置のグリップに配置します。グリップをローディングデバイスに取り付ける前に、デジタルノギスを使用して、踵骨アタッチメントと反対側のグリップの間の距離を測定します。グリップをPBSを含むローディングデバイスに取り付けて、組織の水分補給を維持します。
アルゴリズムのX株とY株の出力が腱軸と一致するように、腱を顕微鏡画像のx軸またはy軸のいずれかにできるだけ合わせます。腱に1グラムの張力をかけます。必要に応じて、組織の中心領域で80ミクロン間隔で4本の線のセットを光退色し、グリップの近くの左右の両端でこのプロセスを繰り返します。
各組織領域の線間の距離の変化は、データを検証するために使用できる局所組織株の二次測定値です。次に、共焦点顕微鏡を使用して、1グラムの予負荷でのDTAFおよびDRAQ5蛍光の体積画像を取得します。毎秒0.5%で2%ひずみまでのひずみランプを実行します。
ひずみ速度と増分ひずみの大きさは調整できることに注意してください。組織を10分間ストレスリラックスさせた後、変形後の組織の別の体積画像を撮影します。必要な数のひずみ増分に対してこのプロセスを繰り返します。
デジタル変換された画像を作成するには、コード digital_strainをダウンロードします。mはGitHubから。ダウンロード後、コードを開いて実行します。
プロンプトが表示されたら、OKを押す前に、最大適用ひずみ、適用ひずみ増分、およびポアソン比に必要な値を挿入します。次に、再度プロンプトが表示されたら、変形していない参照画像を選択します。ひずみ増分ごとに、参照画像と変換後の画像のオーバーレイが表示されます。デジタル変換された画像は、デジタル変換されたXパーセントひずみ(Xはひずみ増分)という名前のディレクトリに保存されます。
表示された名前のスクリプトを開き、[実行] をクリックして画像解析を開始します。プロンプトが表示されたら、必要に応じて拡張ラグランジュデジタル画像相関またはALDICパラメータの値を変更します。プロンプトが表示されたら、yesチェックボックスを選択して、目的の変数コレクションの平均値、標準偏差、および2Dマップを自動的に保存します。
プロンプトが表示されたら、Xひずみ、Yひずみ、せん断ひずみ、不良領域などの目的の変数を選択し、[OK]を押します。次のプロンプトに従って、名前を変更した最大強度 Z 投影を含むフォルダを選択します。ソフトウェアは自動的にインクリメンタルALDICを実行して、変形画像のひずみ場を決定します。プロンプトが表示されたら、左クリックして 4 点ポリゴンを作成し、ひずみを測定するための関心領域を定義します。
フォルダ核追跡結果は、行555と556を調整することによって名前を変更することができ、以前に指定されたすべてのプロットを格納します。このフォルダーには、前に指定したすべての平均と標準偏差を格納する results という名前のスプレッドシートも含まれています。デジタル歪み画像を使用して検証した場合、ALDICアルゴリズムは一貫して平均Xひずみを過小評価し、誤差の大きさは加えられたひずみの増加とともに増加しました。
Y株もほとんど過小評価されていました。しかし、いずれの場合も、ひずみ誤差の大きさは非常に小さかった。計算されたXひずみとYひずみの標準偏差は、大きさは低いものの、適用ひずみの増加とともに増加した。
不良領域解析の結果、累積法で解析したデジタル変換画像において、ひずみ計算が無効である不良領域の数は、ひずみを6%印加した後も一貫して増加し、増分量は1%のままであった。 外れ値として扱われた4つのサンプルのうち1つでは、最大ひずみ増分で画像のほぼ半分が不良であると識別されました。ALDICによって計算されたX株は、PBLから決定されたものよりも大きく、差は0.005以内であり、これはすべてのサンプルで平均化されたPBLデータの標準偏差と同様でした。引張荷重を受けた腱の局所ひずみの大きさと空間分布を決定すると、すべてのサンプルで、Xひずみは一貫して適用されたひずみを下回っていることが示されました。
Y方向の平均ひずみはすべての増分でほぼゼロでしたが、標準偏差は高かったです。平均せん断ひずみは、ひずみ増分全体にわたって着実に増加しました。覚えておくべき最も重要な点は、より大きなひずみを加える前に画像を保存することです。
保存しないと、イメージは失われ、復元できません。この技術は、腱内の組織ひずみを測定するために特別に検証されていますが、他の多くの動物および人間の組織の機械的生物学および力学への洞察を提供することができます。
