ナノファイバーアレイは、エネルギー省科学局のユーザー施設であるナノフェーズ材料科学センターで作製されました(提案ID:CNMS2019-103およびCNMS2022-A-1182)。CNMSからの支援は、査読付きプロポーザルシステムを通じて授与され、成果を公表する予定の合格者には無償で提供されます(http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml)。ナノファイバーアレイの製造に協力してくれたKevin Lester氏とCNMSに感謝します。実験計画法について批判的な議論をしてくれたJohn Caughmen博士、Timothy McKnight博士、Amber Webb博士、Daryl Briggs博士、Travis Bee氏に感謝します。PECVD装置の回路図を提供してくださったAdam Rondinone博士に感謝します。科学的なイラストを描いてくれたレスリー・キャロルに感謝します。この研究は、米国エネルギー省、科学・生物・環境研究局、DE-SC0019104、および米国農務省のバイオイメージング科学プログラム(2021-67013-34835)から資金提供を受けました。JMMは、米国農務省:国立食糧農業研究所:農業および食品研究イニシアチブ博士課程前フェローシップ2021-67034-35167の支援を受けました。

1. VACNFの生成(図2 、 図3)
<ol><li>シリコンウェーハをポリメチルメタクリレート(PMMA)495 A4でスピンコートし、4000rpmでレジストし、180°Cで5分間焼きます。 注意: 次のステップに進む前に、ウェーハを10秒間冷ましてください。</li>
	<li>レジストの2層目(PMMA 950 A2)をスピンコートし、180°Cで5分間焼成します。</li>
	<li>電子線リソグラフィーを使用して、直径300 nmの触媒ドットを、指定された横方向の間隔(ピッチ:10 μm、または35 μm)で3 mm x 3 mmアレイで定義します。</li>
	<li>レジストを30〜40 mLの1:3メチルイソブチルケトン:イソプロピルアルコール(IPA)で1.5分間現像し、続いてIPAでリンスし、N2で乾燥させます。 注:明視野顕微鏡(20倍対物レンズ)を使用してドットの配列を確認します。</li>
	<li>シリコンエッチャー内の酸素プラズマ(デスカム)に6秒間曝露して、残留レジストのウェーハを洗浄します。</li>
	<li>電子ビーム蒸着法を使用して、最初に金属の接着層(TiまたはCr、10 nm)を堆積させ、次にNi触媒(130 nmまたは150 nm)である2番目の層を堆積させます。TiまたはNi金属の堆積中は、見通し内堆積のために、電流を10kVで0.2A未満、圧力を5 x 10-6Torr 未満、および堆積速度を~1A/sに保ちます。</li>
	<li>シーケンシャルバス超音波処理を使用して、下地のレジスト層に堆積した金属(Ni)を除去し、Niをシリコンウェーハに直接堆積させます。このプロセスはリフトオフと呼ばれます。<ol><li>このために、アセトンを入れた3つの容器を準備し、ウェーハをアセトンで1分間超音波処理します。室温(室温、20°C)で周波数35kHzで3回繰り返します。IPAで洗い流し、N2で乾かします。 注意: ウェーハ上でアセトンを乾燥させないでください。最後のアセトン超音波処理の後、すぐにIPAですすぎ、次にN2 ガスで乾燥させます。いずれかの時点でウェーハが時期尚早に乾燥した場合(IPAリンス前)、余分な金属とレジストがすべて除去されず、アセトンが残留物を残す可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて触媒形状の形状を確認します。VACNFチップのSEM画像をキャプチャするには、ステージを30°の角度に傾け、1〜3kVの電圧、ビーム電流~100pA、~5mmの作動距離を使用します。 注:触媒はホッケーパック(コンパクトなシリンダー)のように見えます(図4)。コンパクトなシリンダーの高さは、シリコンウェーハに堆積したNiの厚さを反映する必要があります。Niドットのプロファイルが高く、上部が火山のように凹んでいるように見える場合(図4)、触媒は複数のNi液滴に脱湿する可能性が高くなり、カーボンナノファイバー9が分岐します9。 このような問題は、堆積時間が長いことやリフトオフ手順の問題により、金属蒸着中のレジスト溶融が原因である可能性があります(図4および図5)。</li>
	<li>シリコンウェーハを四分の一にし、アセチレンとアンモニアの混合物と一緒に直流プラズマ強化化学気相成長チャンバー(dc-PECVD)に入れます。ナノファイバー(チップ<200 nm)の長さとテーパーを制御するために、成長パラメータを最適化します。<ol><li>1〜1.5Aの電流と440〜560Vの電圧範囲を使用してください。繊維を成長させるときは、機械と基材が620°Cまで加熱されている間に、アンモニアフローによる前処理段階を使用します。 プラズマを開始する前に、必ず炭素源(アセチレン)を10秒間オンにしてください。 注:クォーターウェーハは、PECVDマシンの実行パラメータを最適化する必要がある場合に使用されます。長さが40μmを超え、先端の直径が200nm未満の繊維を製造するには、Ni触媒の厚さが130nmの場合、電流1.75A、成長時間70分、アセチレン:アンモニア比45標準立方センチメートル/分(sccm):100sccm)を使用します。Niの厚さが150nmの場合、電流1.5A、成長時間80分、アセチレン:アンモニア比48sccm:100sccmを使用します。触媒の厚さに関係なく、成長温度620°C、プラズマ中の圧力10トル、シャワーヘッドの高さ20mmのパラメータを使用してVACNFを成長させます(図6)。</li>
	</ol></li>
	<li>SEMを使用して、加速ポテンシャル1 kVで30°の傾きで得られたファイバーの形状を評価します。 注:最適な繊維は、まっすぐで枝分かれしていないものになります。Ni触媒の結晶方位を電子線蒸着器で制御することは不可能です。その結果、触媒脱湿潤9のために分岐する繊維がいくつか存在することになる。また、結晶方位によってVACNFが異なる高さに成長するため、すべてのVACNFの高さを均一にすることは困難です。</li>
	<li>フォトレジスト(SPR955)の層を1000rpmで45秒間繊維上にスピンコートします。次に、ダイシングソーを使用して、1/4ウェーハを3mm x 3mmのアレイにダイスします。後で使用するために、この時点でファイバーを保管します。 注意: ファイバーをフレキシブル基板に転写する場合は、ステップ1.11を実行しないでください。</li>
</ol>2.VACNFをフレキシブル基板にランシングする(図7、図8)
<ol><li>繊維が合成された後、SU-8 2015フォトレジストをウェーハまたはクォーターウェーハ上に4000rpmで45秒間スピンコートします。</li>
	<li>ウェーハを95°Cで3分間ソフトベークします。</li>
	<li>コンタクトアライナーを使用して、95 mJ/cm2の電子ビームリソグラフィーから定義されたパターンに整列する3 mm 3 mmアレイパターンマスクでウェーハを露光します。 注意: 最も高いファイバーよりも20 μm大きい露出ギャップで近接接触モードを使用します。プロセスのこのステップ中に繊維が倒れる可能性があります。</li>
	<li>95°Cで6分間の曝露後ベークを行います。</li>
	<li>ウェーハをSU-8現像液で15秒間現像し、IPAですすぎ、N2でウェーハを上から下に移動して乾燥させます。 注:ウェーハを現像するときは、完全に水没していることを確認してください。</li>
	<li>薄いフォトレジスト(SPR 955 CM 0.7)の保護層でパターン化されたウェーハを3000rpmで45秒間スピンコートし、90°Cで30秒間ソフトベークします。</li>
	<li>薄い酸化ケイ素層をウェーハ(2〜3nm)に堆積させ、100°Cで22サイクル原子層堆積させます。</li>
	<li>ダイシングソーを使用して、ウェーハを3mm×3mmの正方形に切断します。ダイシングソーをウェーハ上の既存のパターンに合わせます。</li>
	<li>SEMを使用して、30°の傾斜と3 kVの加速ポテンシャルで得られたファイバーの形状を評価します。</li>
	<li>チップを長期間(>1週間)保管する場合は、ここで停止してください。チップは暗闇に保管してください。</li>
	<li>軟質基板と硬質基板を分離するには、個々のチップをアセトンに30分間、またはSU-8がカールし始めるまで置きます。</li>
	<li>SU-8フィルム(硬質基板に付着または剥離したもの)をIPAで5分間洗浄し、次に水で5分間洗浄します。チップを輸送するときは、粘着パッド付きの市販の箱に入れてください。</li>
	<li>オプション:SU-8フィルムのファイバーレス面を水溶性テープの上に置くか、薄いポリエチレンテレフタレート(PET)(厚さ12.5μm)の裏地が付いた薄いシリコーンゴムの上に置きます。<ol><li>ピンセットを使用してSU-8フィルムを転写します。SU-8の正方形の端を押して、テープ/シリコンゴム-PETにくっつくようにします。これは、繊維を壊さないようにするためです。この時点で、VACNFフィルムはすぐに使用できる状態になっています。</li>
		<li>シリコーンゴム/PETホルダーを準備するには、次のことを行います:シリコーンゴム用の2液型キットを使用して、2つの部品(エラストマーと架橋剤)を混ぜ合わせます。次に、PETの正方形を切り取り、透明なプラスチック皿にテープで留めます。PETの上にシリコーンゴムの非常に薄い層を注ぎ、80°Cで1〜2時間硬化させます。</li>
	</ol></li>
</ol>3.硬質基板に繊維を使用するオンプラント法(送達する溶液を植物表面に一滴置く方法)(図1A)
<ol><li>使用前に、アセトン(100%、5分)、IPA(100%、5分)、およびddH2O(5分)を段階的に洗浄してフォトレジストを除去します。</li>
	<li>串刺しにする植物組織を硬い表面に置いて支えます。</li>
	<li>1 μLの液滴に色素またはDNA(200 ng)を植物組織の表面に置きます。</li>
	<li>液滴の上に硬質基板を備えたVACNFチップを配置し、繊維が液滴と接触するように配向します。 注:チップの向きは、ウェーハの「光沢」によって決定できます。チップの光沢のある面には繊維があり、不透明な面にはありません。</li>
	<li>ピンセットの平らな面を使って、チップをタップします。チップが接触した植物の領域を、先端が柔らかいマーカーでマークします。納品後、VACNFチップを取り外してください。 注意: タッピング時に加えられる力の量は、使用する植物組織の種類によって異なります。繊維の串刺しを行う前に、切りくずのタッピングを練習することをお勧めします。植物組織への損傷を避けてください。損傷は、植物組織内のVACNFチップの輪郭が見える場合に明らかです。</li>
	<li>コントロール(+色素/DNA、-繊維、-色素/DNA、+繊維、および-色素/DNA、-繊維)について、手順3.1〜3.5を繰り返します。-ファイバーはチップのファイバーレス面です。</li>
	<li>必要に応じて、無傷の植物または切除した植物器官を、長日条件(16時間の明るい、8時間の暗い)の湿気の多いチャンバーに保管します。切除された臓器の場合は、濡れたペーパータオルでプラスチック製のペトリ皿を使用します。</li>
</ol>4. オンチップ方式(送達する溶液をVACNFチップ上に一滴垂らす)、硬質基板(図1B)
<ol><li>使用前に、アセトン(100%、5分)、IPA(100%、5分)、およびddH2O(5分)を段階的に洗浄してフォトレジストを除去します。</li>
	<li>1 μLの液滴1μLの色素またはプラスミドDNA(200 ng)を、硬質基板を備えたVACNFチップのファイバー側にドロップキャストします。液滴をチップの中央に配置し、いくつかのファイバーを覆ってください。液滴を15分間乾かします。 注:チップの向きは、ウェーハの「光沢」によって決定できます。チップの光沢のある面には繊維があり、不透明な面にはありません。</li>
	<li>葉やその他の切除された臓器を扱うときは、硬い表面の上に置きます。無傷の植物を扱う場合は、VACNFが適用される器官の下に硬い表面を置きます。</li>
	<li>15分間の乾燥工程の後、繊維側が植物組織に接触するようにVACNFチップを配置します。ピンセットの後端でチップをタップします。 注意: タッピング時に加えられる力の量は、使用する植物組織の種類によって異なります。チップを叩く練習をすることをお勧めします。</li>
	<li>プラント内法の手順3.6〜3.7を繰り返します。</li>
</ol>5. SU-8膜中のVACNFをオンチップ法で植物組織に適用(図1C)
<ol><li>SU-8フィルムの繊維側に1μLの染料またはDNA(200ng)の液滴を置き、10分間乾燥させます。液滴は必ずチップの中央に置いてください。 注:使用する基材によって乾燥時間が異なります。</li>
	<li>鋭利なピンセットを使用して、VACNFフィルムを植物の表面に置きます。 注:SU-8フィルムを空中に長く放置するほど、フィルムはより脆くなります。SU-8フィルムを紛失するリスクを抑えるために、すべてのプラント/サンプルと機器をSU-8フィルムの近くに配置してください。</li>
	<li>小さなメイクアップアプリケーターをVACNFフィルムの上にそっと転がします。フレキシブル基板が置かれている領域に、先端の柔らかいマーカーで印を付けます。テープを使用して植物表面から柔軟な基板を取り除きます。 注意: メイクアップアプリケーターを転がすときに加えられる力の量は、使用する植物組織によって異なります。生体分子または色素の送達を行う前に、VACNFフィルムを塗布する練習をしてください。植物組織への目に見える損傷は、植物組織内のVACNFフィルムの輪郭を見ることができるときに明らかです。</li>
	<li>プラント内法のステップ5.1〜5.3で説明したように、コントロールと保管プラントについて手順3.7を繰り返します。</li>
</ol>6. あらゆる配送方法に対応する顕微鏡検査と画像解析
<ol><li>共焦点顕微鏡を用いて、納品された蛍光プローブ/レポーターに適した発光波長と励起波長を用いてサンプルをイメージングします。 注:一過性形質転換に必要な時間は、植物種と送達されるマーカーによって異なります。例えば、蛍光マーカーの発現は、シロイヌナズナでは48時間後に検出されたのに対し、レタスの葉では96時間後に検出されました7。</li>
	<li>イメージングの際は、繊維が剥離した領域に焦点を合わせるようにしてください。繊維の配向は異なります。送達の成功は、切れた繊維の出現に依存しません。 注:繊維は、PECVD18の繊維形成から生じる窒化ケイ素層の形成により、最も一般的な励起/発光設定で蛍光を発します。</li>
	<li>サンプルごとに少なくとも 5 枚の画像をキャプチャします。結果の信号は変化します。</li>
	<li>ImageJ19を用いて、20 μm x 20 μmの共焦点画像領域7における全蛍光(積分密度)として蛍光値を測定する。</li>
</ol>

カーボンナノファイバーアレイを用いた効率的な生体分子および植物への色素送達

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著者は何も開示していません。

本論文では、カーボンナノファイバーアレイを垂直に配列し、その繊維をフレキシブル基板に転写し、硬質または軟質の基板にファイバーを植物に塗布し、生体分子や色素を植物に送達する方法を紹介しました。導入した材料を堆積させるには、オンチップ法とオンプラント法の2つの一般的なアプローチを説明し、VACNF膜を用いたオンチップ法だけでなく、硬質基板上に繊維を作製することに成功した結果を示しました。これらの繊維の応用は、従来の植物形質転換法(粒子衝撃、PEGまたはエレクトロポレーションによるプロトプラスト形質転換)よりも実践的にも理論的にも単純であり、アグロバクテリウムを介した形質転換に抵抗性のある植物に使用できます。ただし、変換されるセルはごくわずかです。
垂直に配向したカーボンナノファイバーは、オークリッジ国立研究所ナノフェーズ材料科学センターのユーザープログラムを通じて製造されました。利用者は、VACNFの製造のためにこの施設の使用を申請することができます。あるいは、VACNFチップは、炭素源22,23を備えた直流プラズマ強化化学気相成長装置を備えたクリーンルームで製造することができます。説明されている方法では、繊維の製造、繊維の転写、およびVACNFチップ/フィルムの応用に不可欠ないくつかのステップがあります。繊維の塗布が機能するためには、植物細胞への送達を成功させるためには、繊維がまっすぐで先端の先細り直径が<200 nmでなければなりません6,7(図3)。特定のサイズとピッチのカーボンナノファイバーを作成するために、ドットサイズ、横方向のピッチ、触媒の堆積量など、さまざまなパラメータを変更することができます。カーボンナノファイバーの製造に使用する最適なドットサイズを選択するために、さまざまなドットサイズからファイバーを成長させました(図5を参照)。直径300 nmのファイバーが最適であることがわかったため、このドットサイズを選択しました(図5)。適切なパラメータを見つけた後、理想的な形状(ストレート、チップ径<200 nm)のファイバー>50%のチップを使用することを検討しました。ファイバーの形状を確認するために、走査型電子顕微鏡を使用して、VACNFチップ/フィルムのサンプル上のランダムな視野を画像化しました。
さらに、繊維は植物細胞内で送達するために一定の最小長を持っている必要があります。異なる長さの繊維を製造することの重要性は、より長い繊維を使用してより深い組織層に浸透できることです。より長い繊維(長さ>40μm)は、繊維が根元から繊維を切断することによって繊維転写が機能し、繊維の上にSU-8を層状にする必要があるため、柔軟なフィルムに不可欠です。このプロトコルに使用されるSU-8層の作業厚さは20〜35μmです。様々な植物(湾曲または平ら)の表皮内で送達を達成するために必要な最小の高さは10〜15μmである6,7。そのため、VACNF膜には>40μmの長さの繊維が必要となる。カーボンナノファイバーを製造する際には、触媒材料、触媒形状、触媒材料の厚さ、PECVDチャンバー内の条件(ガス比、圧力、温度、電流、シャワーヘッドの高さ、成長時間)など、いくつかの異なるパラメータを考慮する必要があります8,9,24,25。Morganら7とDavernら6が用いた25μm以上の炭素ナノファイバーを製造するために、Ni触媒の量を増やし、アセチレンとアンモニアの比率を変化させ、電流と成長時間を長くしました。さらに、触媒材料の形状にも注意を払いました。背の高い直線繊維を製造するためには、堆積した触媒が火山のような形状ではなく、ホッケーパックの形状である必要がありました(図4)。火山構造は、リフトオフ後のフォトレジストの残骸から発生します。火山の形成を防ぐために、PMMAの二重層が電子ビームリソグラフィー26中にアンダーカットを作成するために使用されました。アンダーカットは、堆積した金属触媒のリフトオフを助けます(図2)。触媒の厚い層は、背の高いVACNFの成長に重要です。VACNFの形態はMerkulova et al.24によって調べられている。VACNFの垂直方向の配向は、Ni触媒チップ型の成長と、基板に垂直な直流電位の配向の両方によるものです(図6)。シャワーヘッドは、PECVD反応器(図6)の形状を記述し、電界27の電位の源として機能する。
電子線リソグラフィーで触媒ドットの配列を確定するために、電子線レジスト(ポリメチルメタクリレート)を塗布し、電子ビームを用いてレジストに特定の形状とウェーハ上の特定の位置に小さな穴を開けました。所望の直径の穴を規定の間隔(ピッチ)で規則的なグリッド上に配置し、所望のパターンを指定したファイルを電子ビームリソグラフィー装置にロードしてから、基板をマシンにロードしました。繊維の高さに加えて、繊維の転写を成功させるためのもう一つの重要なパラメータは、アセトン浴で費やされる時間です。VACNFフィルムは、エッジがカールし始めるまでアセトン浴に長時間放置する必要があります。アセトン浴に放置する時間が短すぎると、チップが浮き上がりにくくなり、破損する可能性があります。チップが古ければ古いほど、アセトン浴に長くとどまらなければなりません。アセトン浴に続いて、フィルム/チップをイソプロパノールと水に入れて、アクセスアセトンを除去し、繊維上の保護フォトレジストを除去しました。
スピンコートを行うには、スピンコーター内の真空チャックにウェーハまたはウェーハ片を配置し、スピンコーターのテスト機能を使用してウェーハの中心位置を確認します。小さな水たまり(直径~2.5cm)のレジストをウェーハの中心に塗布し、紡糸(3000rpm×45秒)するスピンコート前後の繊維の画像は、繊維形状(高さ、配向、ピッチ)の保存を示す図8に示されている。繊維が存在すると、繊維の根元にレジストが湧き上がり、予想以上に厚い層になります。VACNF成長後のスピンコーティングは、他のグループによって研究されています11,18。
このプロセスのもう一つのステップで非常に重要なのは、VACNFチップ/フィルムに適切な量の力が加えられるようにすることです。送達機構は、ピンセットの衝撃力によって細胞壁に小さな穿刺を行う繊維に依存している6,7、または柔軟な基板上でミニメイクアップアプリケーターで転がる。繊維は、結果に影響を与えることなく、植物細胞に分解されて埋め込まれたままになる場合とそうでない場合があります6,7が、適切な圧力を得るためには、色素の取り込みと組織損傷の検査と併せて練習する必要があります。さらに、検出可能な発現までの時間は植物種や送達されるベクターの種類によって異なるため、VACNFチップ/フィルムを用いたDNA導入後の適切なイメージング時点を選択することが重要です7(図16)。
この方法は植物に広く適用できますが、いくつかの制限があります。例えば、VACNF膜に酸化ケイ素の薄層を添加しても、SU-8の上にフォトレジストの保護層が追加されるため、必ずしも完全に親水性になるとは限りません。この問題が現実のものとなった場合、VACNFにはより厚い酸化ケイ素の層を施すことができます。フィルムが疎水性か親水性かをテストするには、フィルムを水に入れることができます。フィルムが沈むと親水性になり、浮くと疎水性になります。さらに、生産される繊維のバッチ間にばらつきがある可能性があります。dc-PECVDマシンで繊維を成長させるときに変更できるいくつかのパラメータがあります。このプロトコルで記述されているものは、2つの異なる量のNi触媒のパラメータのセットです。さらに、Ni触媒の結晶方位は制御できず28 、分岐は必然的に繊維に生じる。
この論文では、硬質基質と軟質基質の両方を使用して、フルオレセイン色素とDNAを植物細胞に送達することを実証しましたが、この方法は、他の生体分子や遺伝子組み換えアプローチ、たとえば、安定したトランスジェニック株を産生するのに何年もかかるリンゴやその他の果物などの植物系のRNAiサイレンシングに広く適用できるはずです。さらに、これらの繊維は、遺伝子編集材料の送達や植物の安定した形質転換にも使用できます。

植物の形質転換(一過性および安定的の両方)は、すべての植物組織および種において、まだ広く達成可能にはなっていない。植物の一過性形質転換とは、プラスミドにコードされた遺伝子が一時的に植物に導入されるが、ゲノムに安定的に取り込まれないプロセスです。プロトプラストの粒子衝撃、アグロバクテリア、エレクトロポレーション、またはポリエチレングリコール処理を使用する従来の方法は、時間がかかり、面倒な場合があります。さらに、それらはすべての植物種に適用できるわけではありません1,2,3,4。DNA送達のためのナノマテリアルの使用は、まだ初期段階にある急成長中の分野です5。ナノ材料、特にカーボンナノファイバーは、創傷反応を引き起こすことなく、タンパク質、デキストラン、染料を植物の葉に送達するためにも成功しています6。この研究の目標は、ナノ材料の一種であるカーボンナノファイバーを使用して、生体分子または色素を植物に送達するための詳細なプロトコルを提供することです。ここでは、さまざまな植物器官における細胞の一過性形質転換を可能にする生体分子としてDNAに着目します。
以前、Morganらは、硬質シリコン基板にカーボンナノファイバーを貼り付けて、レタス、N. benthamiana、ポプラの葉、およびシロイヌナズナの葉と根の両方を一過性に変化させることを実証しました。形質転換はさまざまな器官で成功しましたが、根や果実などの曲面を持つ植物組織に繊維を適用することはより困難でした。私たちは、ナノファイバーの柔軟な裏打ちが、臓器の形状によりよく適合することで、ナノファイバーの送達効率を向上させる可能性があると推論しました。
本稿では、垂直に配向したカーボンナノファイバーの作製と設計、VACNFのフレキシブル基板への転写、硬質基板と軟質基板の両方にVACNFを植物に塗布して生体分子と色素を送達する方法について詳述する。炭素ナノファイバーは、Ni触媒を用いた直流触媒プラズマ化学気相成長法(dc C-PECVD)を用いて作製した。Ni触媒ドットの位置、直径、高さは、Melechkoらによって記述されているように、電子ビームリソグラフィー、金属蒸着、およびリフトオフプロセスの組み合わせを使用して制御されました8,9。2層電子ビームレジストを用いることで、より厚いNi触媒を基板上に堆積させ、より長い繊維10を得ることができる。硬質基板からフレキシブル基板への繊維転写は、Fletcherら11に記載の方法の修正に基づいており、現在の方法は、非晶質炭素層または犠牲フォトレジスト層の使用を控えている。繊維転写によるSU-8のリフトオフは、SU-812,13,14のアンダーベークと露出不足から生じる固有の引張応力を利用することによって達成されます。複合ポリマーであるSU-8は、自然に疎水性であるため、DNA送達を促進するための使用は困難です。SU-8の疎水性を打ち消すために、SU-8に繊維を埋め込んだ後、原子層堆積15を介して酸化ケイ素の薄層を塗布します。生体分子/色素送達のための硬質基板上の繊維の適用は、Davern et al.6 で説明されているピンセットタッピングの衝撃力と、Morgan et al.7 で説明されているオンプラントおよびオンチップ法を利用します。柔軟なVACNFフィルムは、Morganらのオンチップ法7と同様に、まずフィルム上のDNAまたは色素の液滴を半乾燥させ、次に小さなメイクアップアプリケーターを使用して湾曲した植物表面にフィルムを転がすことによって、湾曲した植物表面に適用されます16,17。図1は、硬質および軟質基質の繊維を植物に適用するためのさまざまなアプローチを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

生体分子や不浸透性色素を無傷の植物に送達することは、大きな課題です。ナノマテリアルは、DNAを植物に送達するための新進気鋭のツールです。これらの新しいツールはエキサイティングですが、まだ広く適用されていません。硬質基板(バッキング)上に作製されたナノ材料は、湾曲した植物構造にうまく適用することが特に困難です。本研究では、垂直に配向したカーボンナノファイバーアレイを微細加工し、硬質基板から軟質基板に転写するプロセスについて述べる。これらの繊維(硬質または軟質基質上)を、植物への一過性形質転換または色素(フルオレセインなど)の送達にどのように使用できるかを詳述し、実証します。VACNFを硬質シリコン基板からフレキシブルSU-8エポキシ基板に転写して、フレキシブルVACNFアレイを形成する方法を示します。SU-8の疎水性を克服するために、可撓性フィルム中の繊維を薄い酸化ケイ素層(2〜3nm)でコーティングした。これらの繊維を湾曲した植物器官に送達するために、VACNFフィルムの繊維側に1μLの色素またはDNA溶液の液滴を付着させ、10分間待ってから、フィルムを植物器官に置き、転がる動きのある綿棒を使用して繊維を植物細胞に打ち込みます。この手法により、曲面を有する植物器官への色素・DNA送達を実現しました。

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

著者スポットライト:カーボンナノファイバーアレイによるイノベーションによるプラント変革の解き放つ 

硬質または軟質基板上に垂直に配向したカーボンナノファイバーアレイを使用して、生体分子および色素を植物に送達

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

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ここでは、垂直に配向したカーボンナノファイバー(VACNF)を微細加工し、VACNFをフレキシブル基板に転写し、硬質および軟質基板上のVACNFを植物に塗布して生体分子と色素を送達する方法について説明します。

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

私たちは、カーボンナノファイバーアレイを用いて、色素やDNAを植物に導入する一般的な方法を実証しようとしています。多くの植物は、従来の形質転換方法に抵抗があります。本手法は、フレキシブルな硬質基板上にカーボンナノファイバーアレイを用いることで、この問題を解決できる。私たちの技術は高速でユーザーフレンドリーです。それは事実上すべての植物種または植物器官に適用することができます。また、染料やタンパク質などの他の試薬の送達にも使用できます。

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

924 ビュー.  The University of Chicago. 私たちは、カーボンナノファイバーアレイを用いて、色素やDNAを植物に導入する一般的な方法を実証しようとしています。多くの植物は、従来の形質転換方法に抵抗があります。本手法は、フレキシブルな硬質基板上にカーボンナノファイバーアレイを用いることで、この問題を解決できる。私たちの技術は高速でユーザーフレンドリーです。それは事実上すべて?...

ビデオ: 著者スポットライト:カーボンナノファイバーアレイによるイノベーションによるプラント変革の解き放つ 

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

生物工学

On-Chip Method to Deliver Dye or Biomolecules to Plants Using VACNFs in a Flexible Substrate

Begin by preparing vertically aligned carbon nano fibers, or VACNFs. To transfer the VACNFs to a flexible substrate, first place the individual chips in acetone to separate the flexible substrate from the rigid substrate. Then, wash SU-8 films with IPA for five minutes, followed by washing with water for five minutes.Place the chips in a commercial box with a sticky pad when transporting them. Prepare a silicone rubber PET holder by mixing the elaststomer and the crosslinker from a two-part kit. Cut out a square of PET and tape it down in a clear plastic dish.Then, pour a very thin film of silicone rubber on top of the PET and cure it at 80 degrees Celsius for one to two hours. Transfer the SU-8 film to the PET holder using a pair of tweezers, and place the fiberless side of the SU-8 film on the silicone rubber. Press on the edges of the SU-8 square to help it stick to the silicone rubber PET and avoid breaking off fibers.Then, place a one microliter droplet of dye onto the fiber side of the SU-8 film and let it dry for 10 minutes. After drying, place the VACNF film onto the plant surface using a pair of sharp tweezers. Then, gently roll a small makeup applicator over the VACNF film.Mark the areas where the flexible substrates are placed with a soft tipped marker. Then remove the flexible substrates from the plant surface using tape. Repeat VACNF application for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film.The on-chip method was used to deliver fluorescein dye to curved surfaces, such as strawberries, in which a strong fluorescein signal was observed immediately. Whereas in apples, a strong fluorescein signal was seen after two hours of delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in apples.Also, a successful transient transformation of onions was done by delivering the plasmid containing yellow fluorescent protein using VACNF films.

フレキシブル基板中のVACNFを使用して植物に色素または生体分子を送達するオンチップ法

On-Plant Method to Deliver Dye or Biomolecules Using VACNFs in a Rigid Substrate

To begin, remove the photo resist from the VACNFs by washing with 100%acetone for five minutes, followed by a five minute wash with 100%IPA, and then double distilled water for five minutes. Then, place the plant tissue to be impaled on a hard surface for support. Place a one microliter droplet of dye onto the surface of the plant tissue.Place a VACNF chip with a rigid substrate down the top of the droplet, with the fibers oriented such that they will come into contact with the droplet. Using the flat side of a pair of tweezers, tap the chip, mark the area of the plant that the chip came into contact with using a soft tipped marker. Remove the VACNF chips after delivery.Repeat these steps for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film. Store intact plants or excised plant organs in humid chambers in long day conditions. For excised organs, use a plastic Petri dish with wet paper towels.Using this method, fluorescein dye was delivered to Arabidopsis leaves. Images taken at different time points, showed that the fluorescein dye was observed immediately after delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in Arabidopsis leaves.