この研究は、ジョージ・メイソン大学の内部研究基金の支援を受けました。

1. ウイルスおよびウイルス粒子の集合体
<ol><li>ベクター:SARS-CoV-2 M、E、N、およびSARS-CoV-2 S(野生型、Wt)、デルタ(B.1.617.2)、オミクロン(B.1.1.529)の発現ベクターを市販で購入します。 注:発現ベクターのタンパク質配列は、 補足ファイル1に記載されています。これらの発現ベクターのベンダーは、 材料表にも記載されています。</li>
	<li>細胞および細胞培養:10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、50ユニット/mLのペニシリン、および50μg/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でHEK293T細胞を維持します。 注:すべての細胞培養作業は、層流バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。ポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションには、通常、5〜6時間のインキュベーションが必要です。開始時間は事前に慎重に検討する必要があります。</li>
	<li>ウイルス集合体とPEIベースのコトランスフェクション:HEK293T細胞のコトランスフェクションによりHa-CoV-2粒子をアセンブルします。コトランスフェクションの前日に、10 cmの細胞培養ペトリ皿(4-5 x 106細胞/ 皿あたり6細胞)に10 mLの完全なDMEM培地で細胞を播種します。この研究では、3つのペトリ皿を使用して、Ha-CoV-2野生型、デルタ型、オミクロン株をそれぞれ組み立てるための細胞を播種します。</li>
	<li>ペトリ皿をCO2 インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。 翌朝、皿をチェックして、細胞が80%コンフルエントであることを確認します。培地を完全に取り出し、9 mLのDMEM無血清培地と交換します。</li>
	<li>各ディッシュについて、SARS-CoV-2構造タンパク質発現ベクター(N、E、M)2.5 μg、pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ(HaCoV2ゲノム)10 μg、Sタンパク質発現ベクター2.5 μg(デルタまたはオミクロンS変異株)、および45 μLのPEIベースのトランスフェクション試薬を含むコトランスフェクション混合物を調製します。コトランスフェクション混合物を13分間インキュベートして複合体を形成します(30分以上インキュベートしないでください)。</li>
	<li>インキュベーション後、コトランスフェクション混合物を各ペトリ皿にゆっくりと一滴ずつ加えます。皿を37°CのCO2 インキュベーター内に6時間入れます。6時間後、無血清DMEMを除去し、完全なDMEM培地と交換します。コトランスフェクション後48〜60時間でウイルスを回収します。</li>
	<li>ウイルスの回収と保存:コトランスフェクション後48時間で粒子を回収します。単分子膜の表面で繰り返しピペッティングして細胞を剥離し、各ディッシュから細胞を回収し、15 mLの遠心チューブに入れ、400 x g で5分間遠心分離します。上清を回収し、0.22μMフィルターに通します。Ha-CoV-2偽ウイルスは-80°Cで保存します。</li>
</ol>2. ウイルス感染性アッセイ
<ol><li>細胞および細胞培養:10%熱不活化FBS、50ユニット/mLのペニシリン、および50μg/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でHEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を維持します。</li>
	<li>HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞の播種:ウイルス感染性アッセイの前日に、50 μLの完全DMEM培地中の96ウェルプレートにHEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を播種します。各 96 ウェルプレートについて、各ウェルに 2.5 x 104 セルを播種し、1 つのプレートに合計 2.5 x 106 セルが必要です。96ウェルプレートを37°CのCO2 インキュベーターに一晩置きます。</li>
	<li>HEK293T(ACE2/TMPRSS2)の感染:Ha-CoV-2変異株粒子を使用して、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞に感染します。感染の朝に、播種済みの96ウェルプレートから50μLのDMEMを除去します。培地を50 μLのHa-CoV-2野生型、デルタ型、またはオミクロンのいずれかと交換し、37°Cで18時間放置します。 注:感染が18時間のインキュベーションに達し、プレートをルシフェラーゼアッセイで分析する準備が整うまで、プロトコルはここで停止できます。感染の成功は、感染細胞に発現するルシフェラーゼレポーター遺伝子から生じるルシフェラーゼアッセイによって決定されるため、より多くのシグナルが生成されるほど、Ha-CoV-2変異株の感染が成功します。</li>
	<li>ルシフェラーゼアッセイ:18時間のインキュベーション後、7.5 μLの細胞溶解バッファーを各ウェルに直接添加し、2分間オービタル振とうして混合します。細胞を溶解緩衝液中で室温で少なくとも5分間溶解します。</li>
	<li>D-ルシフェリン溶液とFireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を1:50の比率で混合して、Fireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を調製します。96ウェルプレート全体について、3 mLのルシフェラーゼ基質溶液と60 μLのD-ルシフェリン溶液、および2940 μLのFireflyルシフェラーゼバッファー溶液を混合します。</li>
	<li>25 μL の Firefly ルシフェラーゼアッセイ溶液を細胞ライセートに加え、1 分間オービタル振とうしてプレートを混合します。市販のルシフェラーゼマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を分析します。</li>
</ol>3. Ha-CoV-2のRNA抽出と定量的逆転写酵素PCR(RT-qPCR)
<ol><li>ウイルス RNA 抽出: 製造元の指示に従い、市販のウイルス RNA 抽出キットを使用して、Ha-CoV-2 野生型および Ha-CoV-2 デルタおよびオミクロン変異株の粒子からウイルス RNA を抽出します。抽出したウイルスRNAを-80°Cで保存するか、RT-qPCRにすぐに使用してください。</li>
	<li>RT-qPCR:ワンステップマスターミックスを使用して、ウイルス RNA に対して RT-qPCR を実行します。市販のPCR装置で反応を行います。なお、増幅対象はHa-CoV-2のゲノムRNAです。Ha-CoV-2ベクターDNAを標準試料として使用し、検量線を作成し、各バリアントのRNAコピー数を計算します。</li>
</ol>4. 中和抗体アッセイ
<ol><li>HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞の播種:アッセイの前日に、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を96ウェルプレートに播種し、50 μLの完全DMEM培地に入れます。HEK293T(ACE2/TMPRSS2)セルは市販されています。</li>
	<li>細胞をカウントするには、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞を含むT75フラスコから20 μLの細胞を入手し、20 μLのトリパンブルー溶液と混合します。この混合物20 μLを細胞計数チャンバーに加え、mLあたりの細胞数をカウントします。感染のために96ウェルプレートを播種するには、ウェルあたり2.5 x 104 細胞を使用し、合計で2.5 x 106 細胞が必要になります。96ウェルプレートをCO2 インキュベーターに37°Cで一晩置きます。</li>
	<li>中和抗体アッセイ:滅菌ポリプロピレン製96ウェルプレートで、標準27BV中和抗体とHa-CoV-2混合物を調製します。8 μL の 27BV (45 mg/mL) をプレートに加え、6 μL の無血清 DMEM で抗体を段階希釈します。 注:正確な結果が得られるように、ウェル移送の合間にピペットチップを交換し、抗体と無血清培地が十分に混合されていることを確認してください。</li>
	<li>段階希釈した抗体に、54 μLのHa-CoV-2粒子を加え、ウイルスと抗体を混合します。段階希釈した 27BV の Ha-CoV-2 粒子を 37 °C、5% CO2 で 1 時間プレインキュベートします。1時間のインキュベーション後、前日に播種したHEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞(ウェルあたり2.5 x 104 細胞)を含む96ウェルプレートに、50 μLの抗体とHa-CoV-2混合物を塗布します。</li>
	<li>コントロールの場合は、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞のみを含むウェルを少なくとも3つ残します。これらのウェルに50 μLの完全培地を添加し、ルシフェラーゼアッセイの読み取り値のバックグラウンドシグナルの非感染ウェルとして使用します。 注:感染が37°Cで18時間のインキュベーションに達するまで、ここでプロトコルを停止し、その後、プレートをルシフェラーゼアッセイで分析する準備が整います。</li>
	<li>ルシフェラーゼアッセイ:18時間のインキュベーション後、7.5 μLの溶解緩衝液を各ウェルに直接添加し、2分間オービタル振とうして混合します。細胞を溶解緩衝液中で室温で少なくとも5分間溶解します。</li>
	<li>D-ルシフェリン溶液とFireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を1:50の比率で混合して、Fireflyルシフェラーゼアッセイ溶液を調製します。96ウェルプレート全体について、3 mLのルシフェラーゼ基質溶液と60 μLのD-ルシフェリン溶液、および2940 μLのホタルルシフェラーゼバッファー溶液を混合します。</li>
	<li>25 μL の Firefly ルシフェラーゼアッセイ溶液を細胞ライセートに加え、1 分間オービタル振とうしてプレートを混合します。市販のルシフェラーゼマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性を分析します。</li>
</ol>5. 定量化と統計分析
<ol><li>データ収集:感染アッセイとルシフェラーゼアッセイを、示されているように3回に分けて実施します(図1)。ルシフェラーゼアッセイの測定値でルシフェラーゼの発現を定量します。平均値は、3 つのルシフェラーゼ アッセイ測定値の平均値です。感染していないウェルからのバックグラウンドシグナルの読み取り値は、この平均値から差し引かれます。標準偏差(SD)は、ルシフェラーゼアッセイの読み取り値の平均値から決定されます。</li>
	<li>データ解析:市販のグラフ作成ソフトウェアを使用して、抗体中和活性をプロットし、ID50 (50%阻害投与量)値を計算します。ID50 値は、HEK293T(ACE2/TMPRSS2) 細胞の感染が 50% 減少する抗体阻害希釈液として定義されます (ルシフェラーゼアッセイの測定値に基づく)。</li>
</ol>

SARS-CoV-2変異株におけるワクチン誘導中和抗体の定量(英語)

<ol>
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ジョージ・メイソン大学が特許を申請し、製品開発のためにVirongy Biosciences Inc.にライセンス供与されました。Y.W.は、Virongy Biosciencesの創設者であり、諮問委員会のメンバーです。B. Hは現在、Virongy BiosciencesのCEO兼最高科学責任者です。著者には他の利益相反はありません。

Ha-CoV-2プラットフォームは、ウイルス変異体を定量し、抗体を中和するための迅速で堅牢かつシンプルなワークフローを提供します。ただし、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。Ha-CoV-2偽ウイルスの産生は、生存率の高いHEK293T細胞を用いて行う必要があります。コトランスフェクション効率は、Ha-CoV-2ゲノム由来のGFPレポーター遺伝子を用いて、トランスフェクションの24時間後にモニターすることができます。Ha-CoV-2ゲノムは2つのレポーター(GFPとLuc)を含むことができ、GFPはコトランスフェクション中および標的細胞のHa-CoV-2感染後に発現することができる12。感染によるGFP+細胞は通常低い割合(1%から5%)ですが、各感染細胞は強いGFPシグナルを発現します(図3)。この低いGFPパーセンテージは、感染細胞の全集団を定量化するLucレポーターと比較して、抗体中和を定量化するための堅牢な読み出しとしてGFPの使用を制限する可能性があります。
中和アッセイを実施する際には、ウェル移送の合間にピペットチップを交換し、正確な結果を得るために抗体と無血清培地を完全に混合することが不可欠です。さらに、ルシフェラーゼアッセイプロトコルを実施する場合、細胞の完全な溶解とルシフェラーゼ酵素の放出を確実にするために、細胞を少なくとも3分間完全に溶解する必要があります。これにより、アッセイの精度が保証されます。さらに、ホタルルシフェラーゼアッセイ溶液を光学白壁の96ウェルプレートに添加すると、最初の発光は高いが、ATPが枯渇するにつれて時間の経過とともに減少するため、プレートは10分以内に分析する必要があります21。
SARS-CoV-2の変異株が進化し続ける中、Ha-CoV-2のようなプラットフォームでは、変異株の感染力やワクチン誘発性中和抗体に対する変異株の感受性を迅速にスクリーニングする必要性が高まっています。Ha-CoV-2プラットフォームは、既存の偽ウイルスベースの中和アッセイと比較して、より高速で、より高いS/N比、およびシンプルなプロトコルを提供します8,9,10,11。また、Ha-CoV-2プラットフォームは、BSL-2ラボで使用でき、BSL-3施設を使用する必要がないという利点もあります。これにより、SARS-CoV-2の研究を一般的な研究や臨床検査室で進めることができます。さらに、Ha-CoV-2プラットフォームは、他のシステムと比較して迅速な結果を生み出します。例えば、感染性SARS-CoV-2ウイルスに対する中和抗体の研究には、プラーク減少中和試験(PRINT)がよく利用されます22。PRINTは信頼性の高い結果を生成しますが、プラーク形成ユニット(PFU)の手動カウントは遅く、結果を得るのに3〜5日かかります23,24。レンチウイルス−偽ウイルスのような他の疑似型システムは、検出可能なレポーターシグナル12を生成するために24〜72時間を必要とする。これに対し、Ha-CoV-2中和アッセイは18時間以内に結果を得ることができます。Ha-CoV-2は、ウイルス変異体の迅速なスクリーニングと定量化、およびパンデミックモニタリングのための中和抗体のための便利なツールを提供します。
SARS-CoV-2の感染力を監視することは、懸念される変異株(VOC)が出現し続ける中、不可欠です。Ha-CoV-2には、VOCの感染力を迅速に測定できるという利点があります。これまでの研究では、人工知能(AI)ベースのモデリングを用いて、オミクロン株の亜種やデルタ株などのSARS-CoV-2の変異株の感染力を定量的に分析していた25。これらの研究により、オミクロン株は元のウイルスよりも感染力が強く、中和抗体を逃れる可能性が高いことが示されています25。Ha-CoV-2を用いたこれらの研究では、同様の表現型が観察されました。さらに、抗体中和アッセイでは、オミクロン株は武漢株やデルタ株よりも27BVによって中和される可能性が10倍低い。これらの結果は、オミクロン株の受容体結合ドメイン(RBD)に少なくとも15の変異があり、ACE2受容体へのウイルス結合親和性を高めて、より高い伝染性と免疫逃避性を高める可能性が高いと報告されていることとも一致しています26。

2023年5月現在、COVID-19の感染者数は7億6,600万人を超えています1。世界的なワクチン接種キャンペーンにもかかわらず、SARS-CoV-2は、デルタ株(B.1.617.2)やオミクロン株(B.1.1.529)などの新たな変異株の出現により、感染の新たな波を引き起こし、継続的に循環し、人々に感染しています2,3,4。SARS-CoV-2は常に進化しているため、新たな変異株の感染力と、これらの変異株に対するワクチン誘導中和抗体の有効性を正確に測定できる迅速なアッセイを開発することが重要です。これらのアッセイは、パンデミックのサーベイランスや、ワクチンとその変異株特異的なブースターの有効性を判断するために不可欠です。
SARS-CoV-2は感染力が強いため、米国疾病管理予防センター(CDC)は、SARS-CoV-2とその変異株の研究をバイオセーフティレベル(BSL)3施設で実施することを義務付けています5,6。このBSL-3要件は、一般的な研究および臨床検査室におけるウイルス変異体とその中和抗体の感染力を定量化するための生きたウイルスの使用を制限します。さらに、複製能力のある生ウイルスを用いたプラークまたは細胞変性効果に基づくアッセイなど、従来のSARS-CoV-2中和アッセイは時間がかかり、長い潜伏期間を必要とします7。中和抗体の有効性を定量化するために、いくつかのスパイク(S)タンパク質偽型SARS-CoV-2偽ウイルスが開発されています8,9,10,11,12。SARS-CoV-2では、Sタンパク質はウイルスの侵入を媒介する主要なタンパク質であり13、SARS-CoV-2ワクチンで使用される主要な抗原である9,10,14,15,16。水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)やレンチウイルスなどのSタンパク質偽型ビリオンは、中和抗体の定量に使用されています17,18,19。それにもかかわらず、レンチウイルスベースの偽ウイルスは、レポーターシグナルを定量化するために通常2〜3日間の感染を必要とします。VSVベースの疑似ウイルスシステムには、VSVウイルスが残留していることが多く、偽陽性率が高くなる可能性があり、通常、24時間の感染が必要です20。
新しいSARS-CoV-2偽ウイルスシステムであるハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)が、Hetrickらによって最近開発されました12。Ha-CoV-2は、一般的なBSL-2ラボにおける中和抗体に対するウイルス感染力とウイルス感受性を迅速に定量化するための新しいツールを提供します。構造的には、Ha-CoV-2はSARS-CoV-2ウイルス粒子に似ており、Sタンパク質(S)、膜(M)、ヌクレオカプシド(N)、エンベロープ(E)などのSARS-CoV-2構造タンパク質で構成されており、他のウイルスの構造タンパク質はありません。さらに、Ha-CoV-2粒子には、細胞内でのレポーター発現を高速化するために、アルファウイルス由来の高速発現RNAゲノムが含まれています。Ha-CoV-2は、ワクチン接種者および回復期の個人の血清中の抗体の中和活性を迅速に測定することが示されています12。Hetrickらによって実証されたように、経時的アッセイにおいてレンチウイルスベースのSARS-CoV-2偽ウイルスと比較した場合、Ha-CoV-2は感染後2〜4時間という早い時期にLucレポーターを発現し、レンチウイルス偽ウイルスは24時間後にLucを発現しました12。さらに、標準的なモノクローナル中和抗体27BVを用いることで、中和抗体の定量化にHa-CoV-2変異体が応用できる可能性がさらに実証されています( 補足図1参照)12。この研究では、デルタ株(B.1.617.2)とオミクロン株(B.1.1.529)を例に、SARS-CoV-2変異株の感染力を迅速に定量化するためのHa-CoV-2プラットフォームの使用について詳述しています。さらに、標準的なモノクローナル中和抗体である27BV12を使用することで、中和抗体の定量化にHa-CoV-2変異体が応用できる可能性がさらに実証されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>27VB1 20 &#181;g SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>27VBI-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL - US Origin FBS</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat# 24-300&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2043-30-1158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlowMax Discover Microplate reader</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>GM3000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 E Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 M Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 N Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 WT S Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_WT S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hek293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays</td>
			<td>Gold Bio&#160;</td>
			<td>I-930-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, &#956;Clear White Flat Round, Chimney)&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>Cat# 82050-758&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&#936; (Ha-CoV-2 Genome) Vector&#160;</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-based Transfection Reagent</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Transfectin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A43163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Ready-To-Use-Cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S&#160; Omicron (B.1.1.529) Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2-B.1.1.529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&#160;Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2- B.1.617.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PES, 0.22&#181;m</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4444432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of ha-cov-2 pseudovirus for rapid quantification of sars-cov-2 variants and neutralizing antibodies

2019年のコロナウイルス病パンデミック(COVID-19)は、SARS-CoV-2の新たな変異株の感染力と、ウイルス変異株に対するワクチン誘導中和抗体の有効性を正確に測定するための迅速なアッセイの必要性を浮き彫りにしました。これらのアッセイは、パンデミックのサーベイランスや、ワクチンや変異株特異的なブースターの検証に不可欠です。この論文では、SARS-CoV-2変異株の感染力とウイルス変異株に対するワクチン誘導性中和抗体の迅速な定量化のための新規ハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)の応用を実証しています。 Ha-CoV-2は、SARS-CoV-2ウイルス様粒子で、ウイルス構造タンパク質(S、M、N、E)とアルファウイルスであるセムリキフォレストウイルス(SFV)由来の高速発現RNAゲノムで構成されています。Ha-CoV-2には、緑色蛍光タンパク質(GFP)とルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方が含まれており、ウイルスの感染力を迅速に定量化することができます。一例として、SARS-CoV-2デルタ株(B.1.617.2)とオミクロン株(B.1.1.529)の感染力を定量化し、中和抗体(27VB)に対する感受性も測定します。これらの例は、SARS-CoV-2変異株とその中和抗体に対する感受性を迅速に定量するための堅牢なプラットフォームとしてのHa-CoV-2の大きな可能性を示しています。

As of May 2023, there have now been more than 766 million COVID-19 cases1. Despite worldwide vaccination campaigns, SARS-CoV-2 continuously circulates and infects people, largely due to the emergence of new variants such as Delta (B.1.617.2) and Omicron (B.1.1.529) that drive new waves of infection2,3,4. Given that SARS-CoV-2 is constantly evolving, it is important to develop quick assays that can accurately measure the infectivity of emerging variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against these variants. These assays are essential for pandemic surveillance and for determining the efficacy of vaccines and their variant-specific boosters.
Due to the highly contagious nature of SARS-CoV-2, the Center for Disease Control and Prevention (CDC) requires that the study of SARS-CoV-2 and its variants is conducted in biosafety level (BSL) 3 facilities5,6. This BSL-3 requirement limits the use of live viruses for quantifying the infectivity of viral variants and their neutralizing antibodies in common research and clinical laboratories. In addition, traditional SARS-CoV-2 neutralization assays, such as the plaque- or cytopathic effect-based assays using replication-competent live viruses, are time-consuming and require long incubation periods7. Several spike (S) protein-pseudotyped SARS-CoV-2 pseudoviruses have been developed to quantify the effectiveness of neutralizing antibodies8,9,10,11,12. In SARS-CoV-2, the S protein is the major protein that mediates viral entry13, and is the main antigen used in SARS-CoV-2 vaccines9,10,14,15,16. The S protein-pseudotyped virions, such as those of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) or lentivirus, have been used for the quantification of neutralizing antibodies17,18,19. Nevertheless, the lentivirus-based pseudovirus normally requires 2 to 3 days of infection in order to quantify reporter signals. VSV-based pseudovirus systems often contain residual VSV viruses, which can result in high rates of false-positive results and typically require 24 h of infection20.
A novel SARS-CoV-2 pseudovirus system, the hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), has been recently developed by Hetrick et al12. Ha-CoV-2 provides a new tool for the rapid quantification of virus infectivity and virus sensitivity to neutralizing antibodies in common BSL-2 laboratories. Structurally, Ha-CoV-2 resembles the SARS-CoV-2 virion particle, consisting of SARS-CoV-2 structural proteins including the S protein (S), the membrane (M), the nucleocapsid (N), and the envelope (E), and there is no structural protein from other viruses. Additionally, Ha-CoV-2 particle contains a rapid-expressing RNA genome from an alphavirus for fast reporter expression in cells. Ha- CoV-2 has been shown to quickly measure the neutralizing activity of antibodies in the sera of vaccinated and convalescent individuals12. As demonstrated by Hetrick et al., when compared with lentivirus-based SARS-CoV-2 pseudovirus in a time course assay, Ha-CoV-2 expressed the Luc reporter as early as 2-4 h post-infection while the lentivirus-pseudovirus expressed Luc after 24 h12. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a&#160; standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV (See Supplementary Figure 1)12. This work details the use of the Ha-CoV-2 platform for rapid quantification of the infectivity of SARS-CoV-2 variants, using the Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants as examples. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV12.

著者スポットライト:SARS-CoV-2研究におけるオミクロン亜種の評価と中和抗体のための疑似型ウイルスシステム

SARS-CoV-2変異株の迅速定量と中和抗体へのHa-CoV-2偽ウイルスの応用

We have established two main findings in this protocol. First, our Ha-CoV-2 platform demonstrates that the newly emerged Omicron subvariant is more infectious than the original Wuhan strain. Additionally, Omicron subvariants are more resistant to neutralizing antibodies induced by previous strains.SARS CoV-2 research requires BSL-3 facilities, making it difficult for common laboratories to monitor SARS-CoV-2 variants and to quantify neutralizing antibodies. Our Ha-CoV-2 system is a pseudotype virus that can be used in common laboratories and provides a faster way to quantify viral variants and their sensitivity to neutralizing antibodies. Ha-CoV-2 is a virus-like particle that has all the structural proteins of SARS-CoV-2 and resembles SARS-CoV-2.Also, Ha-CoV-2 uses and alpha viral vector for robust and rapid gene expression, producing fast results and a high signal to noise ratio for great reproducibility.

Ha-CoV-2粒子は、HEK293T細胞内のSARS-CoV-2のHa-CoV-2 RNAゲノムと構造タンパク質(M、N、E、S)を発現する5つの異なるDNAベクターを使用して組み立てられました。Sタンパク質ベクターは、S変異体によって異なります。元のHa-CoV-2武漢株(野生型、Wt)のSタンパク質をポジティブコントロールとして使用し、他の2つの変異株(デルタ株(B.1.617.2)またはオミクロン株(B.1.1.529)のそれぞれ由来のSタンパク質とともに組み立てました。すべてのバリエーションで同じM、N、Eが使用されました。Ha-CoV-2(Wt)および変異体粒子をコトランスフェクションの48時間後に回収し、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞への感染に使用しました。感染力は、感染後18時間でのルシフェラーゼの発現によって測定されました。この系では、ルシフェラーゼシグナルの発現レベルが高いほど、Ha-CoV-2による細胞の感染率が高いことを反映しています。ルシフェラーゼシグナルは、各バリアントのRT-qPCRによりゲノムRNAコピーで正規化しました。 図1に示すように、Ha-CoV-2オミクロン変異株は、元のHa-CoV-2(Wt)よりも4倍から10倍高いシグナルを生成し、より高い感染力を示唆しています。
さらに、HaCoV-2(Wt)、デルタ株、オミクロン株を中和する27BVの能力を定量化しました。27BVは、SARS-COV-2 S1タンパク質のRBDドメインに対して開発されたウサギモノクローナル抗体です。中和アッセイでは、27BVの段階希釈を96ウェルプレートで行い、Ha-CoV-2とプレインキュベートした後、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)標的細胞に添加しました。その結果、27BVは試験したすべての変異株に対して中和活性を有することが実証されました(図2)。興味深いことに、オミクロン株の27VBのID50は、Ha-CoV-2(WT)およびHa-CoV-2(Delta;図2)です。これらの結果は、Ha-COV-2プラットフォームが、新たな変異株におけるワクチン誘導性中和抗体の迅速な定量法として使用できることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg"> 図 1.Ha-CoV-2変異株の組み立てと定量。 (A)Ha-CoV-2と変異粒子の集合体の図。Ha-CoV-2レポーターゲノムおよび構造タンパク質(M、S、N、E)を発現するベクターは、HEK293T細胞でコトランスフェクションされます。粒子は、コトランスフェクションの48時間後に回収しました(ビリオン粒子のイメージングとHEK293T細胞は Biorender.com で作成しました)。(B)Ha-CoV-2変異株の感染力の定量化。2つの変異株(デルタ株とオミクロン株)の相対的な感染力は、個々のHa-CoV-2(Luc)変異株のゲノムRNAコピーを使用して定量化され、正規化されます。野生型はHa-COV-2(Wt)で、比較のためのコントロールとして使用されます。感染およびルシフェラーゼアッセイは、3回実施しました。 RU、相対単位。平均と標準偏差(SD)が表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg"> 図 2.Ha-CoV-2(Luc)変異株に対する27BV中和活性の定量化 27BVの中和活性は、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞の感染から18時間後に分析されました。ID50 は、相対感染率 (ルシフェラーゼ活性) と 27BV 濃度を使用して計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg"> 図 3.HEK293T(ACE2/TMPRSS2)のHa-CoV-2(GFP)への感染。 Ha-CoV-2(GFP)粒子を組み立て、HEK293T(ACE2/TMPRSS2)細胞に感染させるために使用しました。GFPの発現は、感染後48時間で蛍光顕微鏡を用いて観察された。左が感染細胞の白色、右がGFPイメージングです。白いバーは100μmを表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1.グラフィカルアブストラクト。 Ha-CoV-2偽ウイルスの構造と応用画像は Biorender.com で作成されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1.蛋白質シーケンス。 SARS-CoV-2のS、M、N、Eタンパク質の配列一覧。Sタンパク質の配列には、SARS-CoV-2の変異株であるオミクロン(B.1.1.529)とデルタ(B.1.617.2)も含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies at JoVE.com

このプロトコルでは、SARS-CoV-2変異体の感染力と中和抗体に対する感受性を迅速に定量化するためのプラットフォームとして、新しいハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)のアプリケーションについて説明します。

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

このプロトコルでは、主に2つの知見が確立されています。まず、Ha-CoV-2プラットフォームは、新たに出現したオミクロン株の亜種が元の武漢株よりも感染力が強いことを示しています。さらに、オミクロン株の亜種は、以前の株によって誘導された中和抗体に対してより耐性があります。SARS CoV-2の研究にはBSL-3施設が必要であり、一般的な検査室ではSARS-CoV-2の変異株をモニタリングし、中和抗体を定量することは困難です。当社のHa-CoV-2システムは、一般的な実験室で使用できる偽型ウイルスであり、ウイルス変異体とその中和抗体に対する感受性をより迅速に定量化する方法を提供します。Ha-CoV-2は、SARS-CoV-2のすべての構造タンパク質を持ち、SARS-CoV-2に類似したウイルス様粒子です。また、Ha-CoV-2は、アルファウイルスベクターを使用して堅牢で迅速な遺伝子発現を実現し、迅速な結果と高いS/N比を実現し、優れた再現性を実現します。

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

711 ビュー.  George Mason University. このプロトコルでは、主に2つの知見が確立されています。まず、Ha-CoV-2プラットフォームは、新たに出現したオミクロン株の亜種が元の武漢株よりも感染力が強いことを示しています。さらに、オミクロン株の亜種は、以前の株によって誘導された中和抗体に対してより耐性があります。SARS CoV-2の研究にはBSL-3施設が必要であり、一般的な検査室ではSARS-CoV-2の変異...

ビデオ: 著者スポットライト:SARS-CoV-2研究におけるオミクロン亜種の評価と中和抗体のための疑似型ウイルスシステム

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

免疫・感染学

Assembling Ha-CoV-2 Particles by Cotransfection of HEK293T Cells for Quantification of SARS-CoV-2 Variants

Begin by maintaining HEK293T cells and DMEM containing heat inactivated FBS, Penicillin, and Streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of trypan blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber and count the number of cells per milliliter.Seed HEK293T cells and 10 milliliters of complete DMEM in a 10 centimeter cell culture Petri dish. Incubate the cells overnight in a carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. The next day, remove the complete medium and replace it with nine milliliters of DMEM serum-free medium.Using the given compounds of viral particle assembly, prepare a cotransfection mixture. Slowly add the mixture to the Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius for six hours. After incubation, replace the serum-free DMEM with a complete DMEM medium and continue incubation for cotransfection for up to 48 hours.Then detach the cells by repeatedly pipetting over the surface of the monolayer and transfer the suspension into a 15 milliliter tube. Centrifuge the cell suspension at 400G for five minutes. Collect the supernatant and pass it through a 0.22 micron filter.Store the filtrate containing Ha-CoV-2 pseudovirus at 80 degrees Celsius.

SARS-CoV-2変異株の定量化のためのHEK293T細胞のコトランスフェクションによるHa-CoV-2粒子の組み立て

Quantification of Ha-CoV-2 Variants and 27BV Neutralization Activity Against Ha-CoV-2(Luc) Variants

Begin by maintaining HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in DMEM containing heated activated FBS, penicillin, and streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of Trypan Blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber, and count the number of cells per milliliter.Seed 2.5 times 10 to the power of four HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in 50 microliters of complete DMEM medium into each well of a 96-well plate. Incubate the cells in a carbon dioxide incubator overnight at 37 degrees Celsius. The next day, replace the 50 microliters of DMEM with 50 microliters of virus suspension, and incubate for 18 hours at 37 degrees Celsius.After incubation, add 7.5 microliters of cell lysis buffer to each well, and mix on an orbital shaker for two minutes. Once the cells are lysed, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix them on an orbital shaker for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.For neutralizing antibody assay, seed HEK-293T cells in 50 microliters of complete DMEM as demonstrated previously. In a 96-well plate, add eight microliters of 27 BV neutralizing antibody, and perform serial dilutions with six microliters of serum-free DMEM. Add 54 microliters of Ha-CoV-2 virus particle to the serially diluted antibody, and mix the suspension.Incubate for one hour at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. Then add 50 microliters of virus suspension to the wells containing HEK-293T cells. For controls, add 50 microliters of complete DMEM medium into the wells containing only HEK-293T cells.Place the plate in an incubator at 37 degrees Celsius for 18 hours. After lysing the cells as demonstrated previously, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix by orbital shaking for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.Ha-CoV-2 Omicron and Omicron variants generated four to tenfold higher signal than the Wild-type Ha-CoV-2, suggesting higher infectivity. The antibody 27 BV demonstrated neutralizing activity against both Delta and Omicron variants. The ID50 of 27 BV for Omicron was approximately 10 times less potent than the ID50 for Wild-type and Delta.