تم دعم هذا العمل من قبل صندوق الأبحاث الداخلية بجامعة جورج ميسون.

1. تجميع الفيروسات والجسيمات الفيروسية
<ol><li>المتجهات: شراء متجهات التعبير ل SARS-CoV-2 M أو E أو N بالإضافة إلى SARS-CoV-2 S (النوع البري ، بالوزن) ، دلتا (B.1.617.2) ، وأوميكرون (B.1.1.529) تجاريا. ملاحظة: يتم توفير تسلسلات البروتين لمتجهات التعبير في الملف التكميلي 1. يمكن أيضا العثور على بائع متجهات التعبير هذه ضمن جدول المواد.</li>
	<li>الخلايا وزراعة الخلايا: الحفاظ على الخلايا HEK293T في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) ، و 50 وحدة / مل من البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. ملاحظة: يجب أن تتم جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية لتدفق الهواء الرقائقي. يتطلب نقل البولي إيثيلين (PEI) عادة حضانة لمدة 5-6 ساعات. يجب النظر في أوقات البدء بعناية مسبقا.</li>
	<li>تجميع الفيروسات والنقل المشترك القائم على جزيرة الأمير إدوارد: تجميع جزيئات Ha-CoV-2 عن طريق النقل المشترك للخلايا HEK293T. خلايا البذور في طبق بتري لزراعة الخلايا 10 سم (4-5 × 106 خلايا لكل طبق) في 10 مل من وسط DMEM الكامل في اليوم السابق للنقل المشترك. في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاثة أطباق بتري لزرع الخلايا لتجميع النوع البري Ha-CoV-2 ودلتا وأوميكرون ، على التوالي.</li>
	<li>احتضان أطباق بتري طوال الليل في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية. تحقق من الأطباق في صباح اليوم التالي للتأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪. أزيلي الوسط الكامل واستبدليه ب 9 مل من الوسائط الخالية من مصل DMEM.</li>
	<li>لكل طبق ، قم بإعداد خليط cotransfection مع 2.5 ميكروغرام من كل من ناقلات التعبير البروتيني الهيكلي SARS-CoV-2 (N ، E ، M) ، و 10 ميكروغرام pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (جينوم HaCoV2) ، و 2.5 ميكروغرام من ناقل تعبير البروتين S ، إما متغيرات Delta أو Omicron S و 45 ميكرولتر من كاشف النقل القائم على PEI. اسمح لخليط النقل المشترك بتكوين مجمعات عن طريق الحضانة لمدة 13 دقيقة (لا تحتضن لمدة تزيد عن 30 دقيقة).</li>
	<li>بعد الحضانة ، أضف خليط النقل إلى كل طبق بتري ببطء ، قطرة قطرة. ضع الأطباق داخل حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. بعد 6 ساعات ، قم بإزالة DMEM الخالي من المصل واستبدله بوسط DMEM كامل. فيروس الحصاد في 48-60 ساعة بعد النقل.</li>
	<li>حصاد الفيروسات وتخزينها: حصاد الجسيمات في 48 ساعة بعد النقل. افصل الخلايا عن طريق السحب بشكل متكرر على سطح الطبقة الأحادية وجمع الخلايا من كل طبق ، ووضعها في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. جمع طاف وتمريره من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 في -80 درجة مئوية.</li>
</ol>2. مقايسة العدوى الفيروسية
<ol><li>الخلايا وزراعة الخلايا: الحفاظ على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ FBS معطل حراريا و 50 وحدة / مل من البنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.</li>
	<li>خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): في اليوم السابق لفحص العدوى الفيروسية ، HEK293T الخلايا (ACE2 / TMPRSS2) في صفيحة 96 بئرا في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM الكاملة. لكل صفيحة 96 بئرا ، بذرة 2.5 × 104 خلايا في كل بئر ، وما مجموعه 2.5 × 106 خلايا مطلوبة للوحة واحدة. ضع صفيحة البئر 96 في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.</li>
	<li>إصابة HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): استخدم جزيئات متغيرات Ha-CoV-2 لإصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). في صباح يوم الإصابة ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من DMEM من لوحة البئر 96 المصنفة مسبقا. استبدل الوسائط ب 50 ميكرولتر من النوع البري Ha-CoV-2 أو Delta أو Omicron لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا حتى تصل العدوى إلى 18 ساعة من الحضانة وتكون اللوحة جاهزة للتحليل عبر فحص Luciferase Assay. يتم تحديد نجاح العدوى من خلال مقايسة Luciferase الناتجة عن جين مراسل Luciferase المعبر عنه في الخلايا المصابة ، وبالتالي كلما تم إنتاج المزيد من الإشارات ، زادت نجاح عدوى متغير Ha-CoV-2.</li>
	<li>مقايسة لوسيفيراز: بعد 18 ساعة من الحضانة ، أضف 7.5 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية مباشرة إلى كل بئر واخلطه عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 2 دقيقة. خلايا التحلل في المخزن المؤقت للتحلل لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإعداد محلول فحص Firefly luciferase عن طريق خلط محلول D-luciferin مع محلول فحص Firefly luciferase بنسبة 1:50. للحصول على صفيحة كاملة من 96 بئرا ، ادمج 3 مل من محلول ركيزة لوسيفيراز مع 60 ميكرولتر من محلول D-luciferin مع 2940 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت Firefly luciferase .</li>
	<li>أضف 25 ميكرولتر من محلول فحص Firefly luciferase إلى تحلل الخلية واخلط اللوحة عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 1 دقيقة. تحليل نشاط لوسيفيراز باستخدام قارئ لوحة لوسيفيراز الميكروية التجارية.</li>
</ol>3. استخراج الحمض النووي الريبي ل Ha-CoV-2 والنسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR)
<ol><li>استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي: استخرج الحمض النووي الريبي الفيروسي من نوع Ha-CoV-2 Wild وجزيئات Ha-CoV-2 Delta و Omicron المتغيرة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي التجارية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتخزين الحمض النووي الريبي الفيروسي المستخرج عند -80 درجة مئوية أو استخدمه على الفور ل RT-qPCR.</li>
	<li>RT-qPCR: قم بإجراء RT-qPCR على الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام مزيج رئيسي من خطوة واحدة. قم بإجراء التفاعل في جهاز PCR تجاري. يرجى ملاحظة أن هدف التضخيم هو الحمض النووي الريبي الجينومي ل Ha-CoV-2. استخدم الحمض النووي المتجه Ha-CoV-2 كمعيار لإنشاء منحنى قياسي وحساب رقم نسخة الحمض النووي الريبي لكل متغير.</li>
</ol>4. تحييد مقايسة الأجسام المضادة
<ol><li>خلايا HEK293T البذر (ACE2 / TMPRSS2): في اليوم السابق للفحص ، HEK293T الخلايا الأولية (ACE2 / TMPRSS2) في صفيحة بئر 96 في 50 ميكرولتر من وسائط DMEM الكاملة. يتم شراء خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) تجاريا.</li>
	<li>لعد الخلايا ، احصل على 20 خلية ميكرولتر من قارورة T75 تحتوي على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) ، واخلطها مع 20 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق. أضف 20 ميكرولتر من هذا الخليط إلى غرفة عد الخلايا واحسب عدد الخلايا لكل مل. لزرع صفيحة بئر 96 للعدوى ، استخدم 2.5 × 104 خلايا لكل بئر ، وستكون هناك حاجة إلى 2.5 × 106 خلايا في المجموع. ضع 96 صفيحة بئر في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.</li>
	<li>مقايسة تحييد الأجسام المضادة: في صفيحة معقمة من مادة البولي بروبيلين 96 بئرا ، قم بإعداد الجسم المضاد المعادل القياسي 27BV وخليط Ha-CoV-2. أضف 8 ميكرولتر من 27BV (45 مجم / مل) إلى اللوحة وقم بإجراء التخفيفات التسلسلية للجسم المضاد باستخدام 6 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. ملاحظة: تأكد من تبادل أطراف الماصة بين عمليات نقل البئر وتأكد من خلط الجسم المضاد والوسط الخالي من المصل جيدا للحصول على نتائج دقيقة.</li>
	<li>إلى الجسم المضاد المخفف بشكل متسلسل ، أضف 54 ميكرولتر من جسيم Ha-CoV-2 وامزج الفيروس والجسم المضاد. احتضان جسيمات Ha-CoV-2 مسبقا باستخدام 27BV المخفف بشكل متسلسل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد وخليط Ha-CoV-2 على لوحة 96 بئرا تحتوي على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) (2.5 × 104 خلايا لكل بئر) المصنفة في اليوم السابق.</li>
	<li>بالنسبة للضوابط ، اترك ثلاثة آبار على الأقل تحتوي فقط على خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). أضف 50 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى هذه الآبار لتكون بمثابة آبار غير مصابة لإشارة الخلفية لقراءات فحص لوسيفيراز. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا حتى تصل العدوى إلى 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، ومن ثم تكون اللوحة جاهزة للتحليل عن طريق مقايسة لوسيفيراز.</li>
	<li>مقايسة لوسيفيراز: بعد 18 ساعة من الحضانة ، أضف 7.5 ميكرولتر من محلول التحلل مباشرة إلى كل بئر واخلطها عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 2 دقيقة. خلايا التحلل في المخزن المؤقت للتحلل لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإعداد محلول فحص Firefly luciferase عن طريق خلط محلول D-luciferin مع محلول فحص Firefly luciferase بنسبة 1:50. للحصول على صفيحة كاملة من 96 بئرا ، ادمج 3 مل من محلول ركيزة لوسيفيراز مع 60 ميكرولتر من محلول D-luciferin مع 2940 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت لوسيفيراز اليراع.</li>
	<li>أضف 25 ميكرولتر من محلول فحص Firefly luciferase إلى تحلل الخلية واخلط اللوحة عن طريق الاهتزاز المداري لمدة 1 دقيقة. تحليل نشاط لوسيفيراز باستخدام قارئ لوحة لوسيفيراز الميكروية التجارية.</li>
</ol>5. القياس الكمي والتحليل الإحصائي
<ol><li>جمع البيانات: إجراء مقايسات العدوى واللوسيفيراز في ثلاث نسخ كما هو موضح (الشكل 1). تحديد تعبير لوسيفيراز مع قراءات مقايسة لوسيفيراز. المتوسط هو متوسط قيمة قراءات مقايسة لوسيفيراز الثلاث. يتم طرح قراءات إشارة الخلفية من الآبار غير المصابة من هذه القيمة المتوسطة. يتم تحديد الانحراف المعياري (SD) من متوسط قيمة قراءات مقايسة لوسيفيراز.</li>
	<li>تحليل البيانات: رسم نشاط تحييد الأجسام المضادة وحساب قيم ID50 (جرعة تثبيط 50٪) باستخدام برنامج الرسوم البيانية التجارية. يتم تعريف قيمة ID50 على أنها التخفيفات المثبطة للأجسام المضادة التي يتم فيها تحقيق انخفاض بنسبة 50٪ في إصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) (بناء على قراءات فحص لوسيفيراز).</li>
</ol>

القياس الكمي للأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح في متغيرات SARS-CoV-2

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+emerging+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2:+Impacts,+challenges+and+strategies.">Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies.</a> Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+Disease+2019-COVID-19.">Coronavirus Disease 2019-COVID-19.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).</li><li>El-Shabasy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+waves+changes,+new+variant+strains,+and+vaccination+effect+against+COVID-19+pandemic.">Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , (2021).</li><li>Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+biosafety+measures+involving+SARS-CoV-2+and+the+classification+as+a+Risk+Group+3+biological+agent.">Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent.</a> Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).</li><li>Vanderheiden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Rapid+Focus+Reduction+Neutralization+Test+Assay+for+Measuring+SARS-CoV-2+Neutralizing+Antibodies.">Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).</li><li>Dieterle, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication-Competent+Vesicular+Stomatitis+Virus+for+Studies+of+SARS-CoV-2+Spike-Mediated+Cell+Entry+and+Its+Inhibition.">A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition.</a> Cell Host &amp; Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+a+pseudovirus+neutralization+assay+for+SARS-CoV-2.">Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 680-686 (2020).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+effectiveness+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+system+as+determined+by+neutralizing+efficiency+and+entry+inhibition+test+in+vitro.">Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro.</a> Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).</li><li>Hetrick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+hybrid+alphavirus-SARS-CoV-2+pseudovirion+for+rapid+quantification+of+neutralization+antibodies+and+antiviral+drugs.">Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs.</a> Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).</li><li>Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+SARS-CoV-2+entry+into+cells.">Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).</li><li>Jackson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA+Vaccine+against+SARS-CoV-2+-+Preliminary+Report.">An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).</li><li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+Vaccine.">Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+evolution+of+coronavirus+spike+proteins.">Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins.</a> Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).</li><li>Donofrio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+SARS-CoV-2+Pseudovirus+Neutralization+Assay.">A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay.</a> Vaccines. 9 (4), 389 (2021).</li><li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+and+Reagents+for+Pseudotyping+Lentiviral+Particles+with+SARS-CoV-2+Spike+Protein+for+Neutralization+Assays.">Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays.</a> Viruses. 12 (5), 513 (2020).</li><li>Zettl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+SARS-CoV-2-Neutralizing+Antibodies+Using+Propagation-Defective+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotypes.">Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes.</a> Vaccines. 8 (3), 386 (2020).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).</li><li>Lundin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+firefly+luciferase+reaction+for+analytical+purposes.">Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).</li><li>Deshpande, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+COVID-19+patients.">Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients.</a> The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 &#38; 2), 82-87 (2020).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+in+methods+for+detecting+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2.">Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).</li><li>Manischewitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+vaccinia-neutralization+assay+based+on+reporter-gene+expression.">Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).</li><li>Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omicron+Variant+(B.1.1.529):+Infectivity,+Vaccine+Breakthrough,+and+Antibody+Resistance.">Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).</li><li>Saxena, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+SARS-CoV-2+Omicron+(B.1.1.529)+variant+of+concern+and+its+global+perspective.">Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective.</a> Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).</li></ol>

تم تقديم براءة اختراع من قبل جامعة جورج ميسون ومرخصة لشركة Virongy Biosciences Inc. لتطوير المنتجات. YW هو مؤسس وعضو في المجلس الاستشاري لشركة Virongy Biosciences. يشغل B. H حاليا منصب الرئيس التنفيذي والمدير العلمي لشركة Virongy Biosciences. ليس لدى المؤلفين أي تضارب آخر في المصالح.

توفر منصة Ha-CoV-2 سير عمل سريع وقوي وبسيط لتحديد المتغيرات الفيروسية وتحييد الأجسام المضادة. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام. يجب إجراء إنتاج الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 باستخدام خلايا HEK293T ذات قابلية عالية للحياة. يمكن مراقبة كفاءة النقل المشترك بعد 24 ساعة من النقل باستخدام جين مراسل GFP من جينوم Ha-CoV-2. يمكن أن يحتوي جينوم Ha-CoV-2 على مراسلين (GFP و Luc) ، ويمكن التعبير عن GFP أثناء النقل المشترك وبعد عدوى Ha-CoV-2 للخلايا المستهدفة12. عادة ما تكون خلايا GFP + من العدوى بنسبة منخفضة (1٪ إلى 5٪) ، لكن كل خلية مصابة تعبر عن إشارات GFP قوية (الشكل 3). قد تحد هذه النسبة المئوية المنخفضة من GFP من استخدام GFP كقراءة قوية لقياس تحييد الأجسام المضادة ، مقارنة بمراسل Luc ، الذي يحدد عدد الخلايا المصابة بالكامل.
عند إجراء مقايسة التحييد ، من الضروري تغيير أطراف الماصة بين عمليات نقل البئر ولضمان خلط الجسم المضاد والوسط الخالي من المصل جيدا للحصول على نتائج دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، عند إجراء بروتوكول فحص لوسيفيراز ، يجب تحليل الخلايا بالكامل لمدة 3 دقائق على الأقل لضمان التحلل الكامل للخلايا وإطلاق إنزيم لوسيفيراز. هذا سيضمن دقة الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد إضافة محلول فحص Firefly luciferase إلى لوحات الآبار البصرية ذات الجدران البيضاء 96 ، يجب تحليل اللوحة في غضون 10 دقائق لأن انبعاث الضوء الأولي مرتفع ولكنه ينخفض بمرور الوقت مع استنفاد ATP21.
مع استمرار تطور المزيد من متغيرات SARS-CoV-2 ، هناك حاجة متزايدة لمنصات مثل Ha-CoV-2 للكشف بسرعة عن العدوى المتغيرة والحساسية المتغيرة للأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح. توفر منصة Ha-CoV-2 سرعة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى وبروتوكولا بسيطا مقارنة بفحوصات التحييد الحالية القائمة على الفيروسات الكاذبة8،9،10،11. توفر منصة Ha-CoV-2 أيضا ميزة أنه يمكن استخدامها في مختبرات BSL-2 ولا تتطلب استخدام مرافق BSL-3. وهذا يسمح ل SARS-CoV-2 بمتابعة الأبحاث في الأبحاث المشتركة والمختبرات السريرية. علاوة على ذلك ، تنتج منصة Ha-CoV-2 نتائج سريعة مقارنة بالأنظمة الأخرى. على سبيل المثال ، غالبا ما تستخدم دراسة تحييد الأجسام المضادة ضد فيروس SARS-CoV-2 المعدي اختبار تحييد تقليل البلاك (PRINT)22. على الرغم من أن PRINT ينتج نتائج موثوقة ، إلا أن العد اليدوي لوحدات تشكيل البلاك (PFUs) بطيء ويتطلب 3-5 أيام للحصول على النتائج23,24. تحتاج أنظمة النمط الكاذب الأخرى ، مثل الفيروس الكاذب lentivirus إلى 24-72 ساعة لإنتاج إشارة مراسل يمكن اكتشافها12. بالمقارنة ، يمكن أن يؤدي اختبار تحييد Ha-CoV-2 إلى نتائج في غضون 18 ساعة. يوفر Ha-CoV-2 أداة ملائمة للفحص السريع والقياس الكمي للمتغيرات الفيروسية وتحييد الأجسام المضادة لرصد الجائحة.
تعد مراقبة عدوى SARS-CoV-2 أمرا ضروريا مع استمرار ظهور المزيد من المتغيرات المثيرة للقلق (VOCs). يوفر Ha-CoV-2 ميزة تحديد عدوى المركبات العضوية المتطايرة بسرعة. استخدمت الدراسات السابقة النمذجة القائمة على الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) لتحليل عدوى المتغير الفرعي Omicron ومتغيرات SARS-CoV-2 الأخرى ، مثل متغير دلتا25. أظهرت هذه الدراسات أن متغير Omicron أكثر عدوى من الفيروس الأصلي ، وأكثر عرضة للهروب من الأجسام المضادة المعادلة25. في هذه الدراسات ، باستخدام Ha-CoV-2 ، لوحظت أنماط ظاهرية مماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، في مقايسات تحييد الأجسام المضادة ، تقل احتمالية تحييد متغير Omicron بعشر مرات بواسطة 27BV عن سلالات ووهان ودلتا. تتوافق هذه النتائج أيضا مع قابلية الانتقال العالية المبلغ عنها لمتغير Omicron ، والذي يحتوي على 15 طفرة على الأقل في مجال ربط المستقبلات (RBD) ، مما يعزز على الأرجح تقارب الارتباط الفيروسي بمستقبل ACE2 لزيادة قابلية الانتقال وزيادة الهروب المناعي26.

اعتبارا من مايو 2023 ، كان هناك الآن أكثر من 766 مليون حالة COVID-191. على الرغم من حملات التطعيم في جميع أنحاء العالم ، فإن SARS-CoV-2 يدور باستمرار ويصيب الناس ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى ظهور متغيرات جديدة مثل Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) التي تدفع موجات جديدة من العدوى 2,3,4. بالنظر إلى أن SARS-CoV-2 يتطور باستمرار ، فمن المهم تطوير فحوصات سريعة يمكنها قياس عدوى المتغيرات الناشئة بدقة وفعالية الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح ضد هذه المتغيرات. هذه المقايسات ضرورية لترصد الجائحة ولتحديد فعالية اللقاحات ومعززاتها الخاصة بالمتغيرات.
نظرا للطبيعة شديدة العدوى ل SARS-CoV-2 ، يتطلب مركز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) إجراء دراسة SARS-CoV-2 ومتغيراته في مرافق مستوى السلامة البيولوجية (BSL)3 5,6. يحد متطلب BSL-3 هذا من استخدام الفيروسات الحية لتحديد عدوى المتغيرات الفيروسية وأجسامها المضادة المعادلة في الأبحاث الشائعة والمختبرات السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقايسات تحييد SARS-CoV-2 التقليدية ، مثل المقايسات القائمة على تأثير البلاك أو الاعتلال الخلوي باستخدام الفيروسات الحية ذات الكفاءة المتماثلة ، تستغرق وقتا طويلا وتتطلب فترات حضانة طويلة7. تم تطوير العديد من الفيروسات الكاذبة من النوع الكاذب لبروتين SARS-CoV-2 لتحديد فعالية تحييد الأجسام المضادة8،9،10،11،12. في SARS-CoV-2 ، بروتين S هو البروتين الرئيسي الذي يتوسط دخول الفيروس13 ، وهو المستضد الرئيسي المستخدم في لقاحات SARS-CoV-29،10،14،15،16. تم استخدام الفيروسات ذات النمط الكاذب للبروتين S ، مثل فيروسات التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) أو lentivirus ، لتحديد كمية الأجسام المضادة المعادلة17،18،19. ومع ذلك ، فإن الفيروس الكاذب القائم على lentivirus يتطلب عادة 2 إلى 3 أيام من العدوى من أجل تحديد إشارات المراسل. غالبا ما تحتوي أنظمة الفيروسات الكاذبة القائمة على VSV على فيروسات VSV المتبقية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى معدلات عالية من النتائج الإيجابية الكاذبة وتتطلب عادة 24 ساعة من العدوى20.
تم مؤخرا تطوير نظام فيروس كاذب جديد ل SARS-CoV-2 ، وهو الفيروس الكاذب الهجين alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) ، بواسطة Hetrick etal 12. يوفر Ha-CoV-2 أداة جديدة للقياس الكمي السريع لعدوى الفيروس وحساسية الفيروس لتحييد الأجسام المضادة في مختبرات BSL-2 الشائعة. من الناحية الهيكلية ، يشبه Ha-CoV-2 جسيم virion SARS-CoV-2 ، الذي يتكون من بروتينات هيكلية ل SARS-CoV-2 بما في ذلك بروتين S (S) ، والغشاء (M) ، و nucleocapsid (N) ، والغلاف (E) ، ولا يوجد بروتين هيكلي من فيروسات أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي جسيم Ha-CoV-2 على جينوم RNA سريع التعبير من فيروس ألفا للتعبير السريع في الخلايا. ثبت أن Ha- CoV-2 يقيس بسرعة النشاط المعادل للأجسام المضادة في أمصال الأفراد الذين تم تطعيمهم والنقاهة12. كما أوضح Hetrick et al. ، عند مقارنته بالفيروس الكاذب SARS-CoV-2 القائم على فيروس lentivirus في فحص الدورة الزمنية ، أعرب Ha-CoV-2 عن مراسل Luc في وقت مبكر من 2-4 ساعات بعد الإصابة بينما عبر الفيروس الكاذب lentivirus عن Luc بعد 24 ساعة12. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح التطبيق المحتمل لمتغيرات Ha-CoV-2 لقياس الأجسام المضادة المعادلة بشكل أكبر باستخدام جسم مضاد معادل وحيد النسيلة قياسي ، 27BV (انظر الشكل التكميلي 1)12. يفصل هذا العمل استخدام منصة Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لعدوى متغيرات SARS-CoV-2 ، باستخدام متغيرات Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) كأمثلة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح التطبيق المحتمل لمتغيرات Ha-CoV-2 لتحديد الأجسام المضادة المعادلة باستخدام جسم مضاد قياسي وحيد النسيلة ، 27BV12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>27VB1 20 &#181;g SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>27VBI-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL - US Origin FBS</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat# 24-300&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2043-30-1158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlowMax Discover Microplate reader</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>GM3000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 E Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 M Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 N Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 WT S Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_WT S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hek293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays</td>
			<td>Gold Bio&#160;</td>
			<td>I-930-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, &#956;Clear White Flat Round, Chimney)&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>Cat# 82050-758&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&#936; (Ha-CoV-2 Genome) Vector&#160;</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-based Transfection Reagent</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Transfectin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A43163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Ready-To-Use-Cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S&#160; Omicron (B.1.1.529) Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2-B.1.1.529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&#160;Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2- B.1.617.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PES, 0.22&#181;m</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4444432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of ha-cov-2 pseudovirus for rapid quantification of sars-cov-2 variants and neutralizing antibodies

سلطت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) الضوء على الحاجة إلى فحوصات سريعة لقياس عدوى متغيرات SARS-CoV-2 الناشئة بدقة وفعالية الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح ضد المتغيرات الفيروسية. هذه المقايسات ضرورية لترصد الجائحة والتحقق من صحة اللقاحات والمعززات الخاصة بالمتغيرات. توضح هذه المخطوطة تطبيق فيروس كاذب هجين جديد لفيروس ألفا-سارس-كوف-2 (Ha-CoV-2) من أجل القياس الكمي السريع للعدوى المتغيرة ل SARS-CoV-2 والأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح للمتغيرات الفيروسية. Ha-CoV-2 هو جسيم يشبه فيروس SARS-CoV-2 يتكون من بروتينات هيكلية فيروسية (S و M و N و E) وجينوم RNA سريع التعبير مشتق من فيروس ألفا ، فيروس غابة Semliki (SFV). يحتوي Ha-CoV-2 أيضا على كل من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وجينات مراسل luciferase التي تسمح بالقياس الكمي السريع للعدوى الفيروسية. على سبيل المثال ، يتم تحديد عدوى متغيرات SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) ، كما يتم قياس حساسياتها تجاه الجسم المضاد المعادل (27VB). توضح هذه الأمثلة الإمكانات الكبيرة ل Ha-CoV-2 كمنصة قوية للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وقابليتها لتحييد الأجسام المضادة.

As of May 2023, there have now been more than 766 million COVID-19 cases1. Despite worldwide vaccination campaigns, SARS-CoV-2 continuously circulates and infects people, largely due to the emergence of new variants such as Delta (B.1.617.2) and Omicron (B.1.1.529) that drive new waves of infection2,3,4. Given that SARS-CoV-2 is constantly evolving, it is important to develop quick assays that can accurately measure the infectivity of emerging variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against these variants. These assays are essential for pandemic surveillance and for determining the efficacy of vaccines and their variant-specific boosters.
Due to the highly contagious nature of SARS-CoV-2, the Center for Disease Control and Prevention (CDC) requires that the study of SARS-CoV-2 and its variants is conducted in biosafety level (BSL) 3 facilities5,6. This BSL-3 requirement limits the use of live viruses for quantifying the infectivity of viral variants and their neutralizing antibodies in common research and clinical laboratories. In addition, traditional SARS-CoV-2 neutralization assays, such as the plaque- or cytopathic effect-based assays using replication-competent live viruses, are time-consuming and require long incubation periods7. Several spike (S) protein-pseudotyped SARS-CoV-2 pseudoviruses have been developed to quantify the effectiveness of neutralizing antibodies8,9,10,11,12. In SARS-CoV-2, the S protein is the major protein that mediates viral entry13, and is the main antigen used in SARS-CoV-2 vaccines9,10,14,15,16. The S protein-pseudotyped virions, such as those of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) or lentivirus, have been used for the quantification of neutralizing antibodies17,18,19. Nevertheless, the lentivirus-based pseudovirus normally requires 2 to 3 days of infection in order to quantify reporter signals. VSV-based pseudovirus systems often contain residual VSV viruses, which can result in high rates of false-positive results and typically require 24 h of infection20.
A novel SARS-CoV-2 pseudovirus system, the hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), has been recently developed by Hetrick et al12. Ha-CoV-2 provides a new tool for the rapid quantification of virus infectivity and virus sensitivity to neutralizing antibodies in common BSL-2 laboratories. Structurally, Ha-CoV-2 resembles the SARS-CoV-2 virion particle, consisting of SARS-CoV-2 structural proteins including the S protein (S), the membrane (M), the nucleocapsid (N), and the envelope (E), and there is no structural protein from other viruses. Additionally, Ha-CoV-2 particle contains a rapid-expressing RNA genome from an alphavirus for fast reporter expression in cells. Ha- CoV-2 has been shown to quickly measure the neutralizing activity of antibodies in the sera of vaccinated and convalescent individuals12. As demonstrated by Hetrick et al., when compared with lentivirus-based SARS-CoV-2 pseudovirus in a time course assay, Ha-CoV-2 expressed the Luc reporter as early as 2-4 h post-infection while the lentivirus-pseudovirus expressed Luc after 24 h12. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a&#160; standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV (See Supplementary Figure 1)12. This work details the use of the Ha-CoV-2 platform for rapid quantification of the infectivity of SARS-CoV-2 variants, using the Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants as examples. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV12.

تسليط الضوء على المؤلف: نظام فيروس من النمط الكاذب لتقييم المتغيرات الفرعية لأوميكرون وتحييد الأجسام المضادة في أبحاث SARS-CoV-2

تطبيق الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وتحييد الأجسام المضادة

We have established two main findings in this protocol. First, our Ha-CoV-2 platform demonstrates that the newly emerged Omicron subvariant is more infectious than the original Wuhan strain. Additionally, Omicron subvariants are more resistant to neutralizing antibodies induced by previous strains.SARS CoV-2 research requires BSL-3 facilities, making it difficult for common laboratories to monitor SARS-CoV-2 variants and to quantify neutralizing antibodies. Our Ha-CoV-2 system is a pseudotype virus that can be used in common laboratories and provides a faster way to quantify viral variants and their sensitivity to neutralizing antibodies. Ha-CoV-2 is a virus-like particle that has all the structural proteins of SARS-CoV-2 and resembles SARS-CoV-2.Also, Ha-CoV-2 uses and alpha viral vector for robust and rapid gene expression, producing fast results and a high signal to noise ratio for great reproducibility.

تم تجميع جسيمات Ha-CoV-2 باستخدام خمسة ناقلات مختلفة للحمض النووي تعبر عن جينوم Ha-CoV-2 RNA والبروتينات الهيكلية (M و N و E و S) ل SARS-CoV-2 في خلايا HEK293T. يختلف ناقل البروتين S اعتمادا على متغير S. تم استخدام بروتين S من سلالة Ha-CoV-2 Wuhan الأصلية (النوع البري ، Wt) كعنصر تحكم إيجابي ، وتم تجميعه مع بروتين S من كل من المتغيرين الآخرين: دلتا (B.1.617.2) أو Omicron (B.1.1.529). تم استخدام نفس M و N و E في جميع المتغيرات. تم جمع Ha-CoV-2 (Wt) والجسيمات المتغيرة بعد 48 ساعة من النقل المشترك ثم استخدمت لإصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). تم قياس العدوى عن طريق التعبير عن لوسيفيراز في 18 ساعة بعد الإصابة. في هذا النظام ، تعكس مستويات التعبير الأعلى لإشارة لوسيفيراز عدوى أعلى للخلايا بواسطة Ha-CoV-2. تم تطبيع إشارة لوسيفيراز بنسخ الحمض النووي الريبي الجينومي بواسطة RT-qPCR لكل متغير. كما هو موضح في الشكل 1 ، ولد متغير Ha-CoV-2 Omicron إشارة أعلى من 4 إلى 10 أضعاف من Ha-CoV-2 (Wt) الأصلي ، مما يشير إلى ارتفاع العدوى.
علاوة على ذلك ، تم تحديد قدرة 27BV على تحييد متغيرات HaCoV-2 (Wt) و Delta و Omicron. 27BV هو جسم مضاد أحادي النسيلة للأرانب تم تطويره ضد مجال RBD لبروتين SARS-COV-2 S1. بالنسبة لمقايسات التحييد ، تم إجراء التخفيفات التسلسلية ل 27BV في صفيحة 96 بئرا ، تم تحضينها مسبقا باستخدام Ha-CoV-2 ، ثم إضافتها إلى الخلايا المستهدفة HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). أظهرت النتائج أن 27BV كان له نشاط تحييد ضد جميع المتغيرات التي تم اختبارها (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام أن المعرف50 ل 27VB ل Omicron كان أقل قوة بحوالي 10 مرات من المعرف50 ل Ha-CoV-2 (WT) و Ha-CoV-2 (Delta; الشكل 2). توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام منصة Ha-COV-2 كطريقة سريعة لقياس الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح في المتغيرات الناشئة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg"> الشكل 1. تجميع وقياس متغيرات Ha-CoV-2. (أ) رسم توضيحي لتجميع Ha-CoV-2 والجسيمات المتغيرة. يتم نقل النواقل التي تعبر عن جينوم مراسل Ha-CoV-2 والبروتينات الهيكلية (M و S و N و E) في خلايا HEK293T. تم حصاد الجسيمات بعد 48 ساعة من النقل المشترك (تم إنشاء تصوير جسيمات virion والخلايا HEK293T باستخدام Biorender.com). (ب) التحديد الكمي لعدوى متغيرات Ha-CoV-2. يتم تحديد العدوى النسبية للمتغيرين (دلتا وأوميكرون) وتسطيعها باستخدام نسخ الحمض النووي الريبي الجينومي لمتغيرات Ha-CoV-2 (Luc) الفردية. النوع البري هو Ha-COV-2 (Wt) ، والذي يستخدم كعنصر تحكم للمقارنة. تم إجراء فحوصات العدوى و luciferase 3x. RU ، الوحدة النسبية. يتم عرض المتوسط والانحراف المعياري (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg"> الشكل 2. القياس الكمي لنشاط تحييد 27BV ضد متغيرات Ha-CoV-2 (Luc) تم تحليل نشاط التحييد ل 27BV بعد 18 ساعة من إصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). تم حساب معرف50 باستخدام معدل الإصابة النسبي (نشاط لوسيفيراز) مقابل تركيز 27BV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg"> الشكل 3. إصابة HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) ب Ha-CoV-2 (GFP). تم تجميع جزيئات Ha-CoV-2 (GFP) ثم استخدامها لإصابة خلايا HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). لوحظ تعبير GFP في 48 ساعة بعد الإصابة باستخدام المجهر الفلوري. يظهر الحقل الأبيض للخلايا المصابة على اليسار ، ويظهر تصوير GFP على اليمين. يمثل الشريط الأبيض 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الشكل التكميلي 1. ملخص رسومي. بنية الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 وتطبيقه. تم إنشاء الصورة باستخدام Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1. تسلسل البروتين. قائمة تسلسل بروتينات SARS-CoV-2 S و M و N و E. تتضمن تسلسلات البروتين S أيضا متغيرات SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) و Delta (B.1.617.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول تطبيق فيروس كاذب هجين جديد من فيروس ألفا-سارس-كوف-2 (Ha-CoV-2) كمنصة للقياس الكمي السريع لعدوى متغيرات SARS-CoV-2 وحساسيتها لتحييد الأجسام المضادة.

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

لقد وضعنا نتيجتين رئيسيتين في هذا البروتوكول. أولا، توضح منصة Ha-CoV-2 الخاصة بنا أن متغير Omicron الفرعي الناشئ حديثا أكثر عدوى من سلالة ووهان الأصلية. بالإضافة إلى ذلك، تعد متغيرات أوميكرون الفرعية أكثر مقاومة لتحييد الأجسام المضادة التي تسببها السلالات السابقة.تتطلب أبحاث SARS CoV-2 مرافق BSL-3 ، مما يجعل من الصعب على المختبرات الشائعة مراقبة متغيرات SARS-CoV-2 وتحديد كمية الأجسام المضادة المعادلة. نظام Ha-CoV-2 الخاص بنا هو فيروس من النوع الكاذب يمكن استخدامه في المختبرات الشائعة ويوفر طريقة أسرع لتحديد المتغيرات الفيروسية وحساسيتها لتحييد الأجسام المضادة. Ha-CoV-2 هو جسيم شبيه بالفيروس يحتوي على جميع البروتينات الهيكلية ل SARS-CoV-2 ويشبه SARS-CoV-2.أيضا ، يستخدم Ha-CoV-2 ناقل ألفا الفيروسي للتعبير الجيني القوي والسريع ، مما ينتج عنه نتائج سريعة ونسبة إشارة عالية إلى الضوضاء لاستنساخ كبير.

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

713 Views.  George Mason University. لقد وضعنا نتيجتين رئيسيتين في هذا البروتوكول. أولا، توضح منصة Ha-CoV-2 الخاصة بنا أن متغير Omicron الفرعي الناشئ حديثا أكثر عدوى من سلالة ووهان الأصلية. بالإضافة إلى ذلك، تعد متغيرات أوميكرون الفرعية أكثر مقاومة لتحييد الأجسام المضادة التي تسببها السلالات السابقة.تتطلب أبحا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: نظام فيروس من النمط الكاذب لتقييم المتغيرات الفرعية لأوميكرون وتحييد الأجسام المضادة في أبحاث SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Assembling Ha-CoV-2 Particles by Cotransfection of HEK293T Cells for Quantification of SARS-CoV-2 Variants

Begin by maintaining HEK293T cells and DMEM containing heat inactivated FBS, Penicillin, and Streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of trypan blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber and count the number of cells per milliliter.Seed HEK293T cells and 10 milliliters of complete DMEM in a 10 centimeter cell culture Petri dish. Incubate the cells overnight in a carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. The next day, remove the complete medium and replace it with nine milliliters of DMEM serum-free medium.Using the given compounds of viral particle assembly, prepare a cotransfection mixture. Slowly add the mixture to the Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius for six hours. After incubation, replace the serum-free DMEM with a complete DMEM medium and continue incubation for cotransfection for up to 48 hours.Then detach the cells by repeatedly pipetting over the surface of the monolayer and transfer the suspension into a 15 milliliter tube. Centrifuge the cell suspension at 400G for five minutes. Collect the supernatant and pass it through a 0.22 micron filter.Store the filtrate containing Ha-CoV-2 pseudovirus at 80 degrees Celsius.

تجميع جسيمات Ha-CoV-2 عن طريق النقل المشترك للخلايا HEK293T لتحديد كمية متغيرات SARS-CoV-2

Quantification of Ha-CoV-2 Variants and 27BV Neutralization Activity Against Ha-CoV-2(Luc) Variants

Begin by maintaining HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in DMEM containing heated activated FBS, penicillin, and streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of Trypan Blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber, and count the number of cells per milliliter.Seed 2.5 times 10 to the power of four HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in 50 microliters of complete DMEM medium into each well of a 96-well plate. Incubate the cells in a carbon dioxide incubator overnight at 37 degrees Celsius. The next day, replace the 50 microliters of DMEM with 50 microliters of virus suspension, and incubate for 18 hours at 37 degrees Celsius.After incubation, add 7.5 microliters of cell lysis buffer to each well, and mix on an orbital shaker for two minutes. Once the cells are lysed, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix them on an orbital shaker for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.For neutralizing antibody assay, seed HEK-293T cells in 50 microliters of complete DMEM as demonstrated previously. In a 96-well plate, add eight microliters of 27 BV neutralizing antibody, and perform serial dilutions with six microliters of serum-free DMEM. Add 54 microliters of Ha-CoV-2 virus particle to the serially diluted antibody, and mix the suspension.Incubate for one hour at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. Then add 50 microliters of virus suspension to the wells containing HEK-293T cells. For controls, add 50 microliters of complete DMEM medium into the wells containing only HEK-293T cells.Place the plate in an incubator at 37 degrees Celsius for 18 hours. After lysing the cells as demonstrated previously, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix by orbital shaking for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.Ha-CoV-2 Omicron and Omicron variants generated four to tenfold higher signal than the Wild-type Ha-CoV-2, suggesting higher infectivity. The antibody 27 BV demonstrated neutralizing activity against both Delta and Omicron variants. The ID50 of 27 BV for Omicron was approximately 10 times less potent than the ID50 for Wild-type and Delta.