Este trabalho foi apoiado pelo fundo de pesquisa interno da George Mason University.

1. Montagem de vírus e partículas virais
<ol><li>Vetores: Vetores de expressão de compra para SARS-CoV-2 M, E, ou N, bem como o SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2), e Omicron (B.1.1.529) comercialmente. Observação : sequências de proteína dos vetores de expressão são fornecidas no arquivo suplementar 1. O fornecedor desses vetores de expressão também pode ser encontrado na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Células e cultura celular: Manter HEK293T células em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor, 50 unidades/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina. NOTA: Todo o trabalho de cultura de células precisa ser feito em um gabinete de biossegurança de fluxo de ar laminar. A transfecção de polietilenoimina (PEI) normalmente requer 5-6 h de incubação. Os horários de início precisam ser considerados com cuidado antes.</li>
	<li>Montagem de vírus e cotransfecção baseada em PEI: Montar partículas de Ha-CoV-2 por cotransfecção de células HEK293T. Células de sementes em uma placa de Petri de cultura celular de 10 cm (4-5 x 106 células por placa) em 10 mL de meio DMEM completo no dia anterior à cotransfecção. Para este estudo, três placas de Petri são usadas para semear células para a montagem de Ha-CoV-2 selvagem, Delta e Omicron, respectivamente.</li>
	<li>Incubar placas de Petri durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 °C. Verifique os pratos na manhã seguinte para garantir que as células sejam 80% confluentes. Remover o meio completo e substituí-lo por 9 mL de meio sem soro DMEM.</li>
	<li>Para cada prato, prepare uma mistura de cotransfecção com 2,5 μg de cada um dos vetores de expressão de proteína estrutural do SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg de pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Genoma HaCoV2) e 2,5 μg do vetor de expressão da proteína S, variantes Delta ou Omicron S e 45 μL do reagente de transfecção baseado em PEI. Permitir que a mistura de cotransfecção forme complexos incubando por 13 min (não incubar por mais de 30 min).</li>
	<li>Após a incubação, adicione a mistura de cotransfecção a cada placa de Petri lentamente, gota a gota. Coloque os pratos dentro de uma incubadora de CO2 a 37 °C por 6 h. Após 6 h, remova o DMEM sem soro e substitua-o por meio DMEM completo. Vírus de colheita em 48-60 h pós-cotransfecção.</li>
	<li>Colheita e armazenamento do vírus: Colher partículas 48 h após a cotransfecção. Separar as células pipetando repetidamente sobre a superfície da monocamada e coletar células de cada placa, colocar em tubos de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 400 x g por 5 min. Recolher o sobrenadante e passá-lo através de um filtro de 0,22 μM. Conservar o pseudovírus Ha-CoV-2 a -80 °C.</li>
</ol>2. Ensaio de infectividade viral
<ol><li>Células e cultura celular: Manter células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de SFB inativado pelo calor, 50 unidades/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina.</li>
	<li>Semeadura de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Um dia antes do ensaio de infectividade viral, sementes HEK293T(ACE2/TMPRSS2) em uma placa de 96 poços em 50 μL de meio DMEM completo. Para cada placa de 96 poços, semeie 2,5 x 104 células em cada poço, e um total de 2,5 x 106 células são necessárias para uma placa. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora de CO2 a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Infecção de HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Use partículas variantes de Ha-CoV-2 para infectar células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Na manhã da infecção, remover 50 μL de DMEM da placa pré-semeada de 96 poços. Substitua o meio por 50 μL de Ha-CoV-2 Wild-type, Delta ou Omicron por 18 h a 37 °C. NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui até que a infecção tenha atingido 18 h de incubação e a placa esteja pronta para ser analisada via Luciferase Assay. O sucesso da infecção é determinado pelo ensaio Luciferase resultante do gene Luciferase expresso nas células infectadas, portanto, quanto mais sinal é produzido, mais bem-sucedida é a infecção da variante Ha-CoV-2.</li>
	<li>Ensaio de Luciferase: Após 18 h de incubação, adicionar 7,5 μL de tampão de lise celular diretamente a cada poço e misturar por agitação orbital por 2 min. Lise as células em tampão de lise por pelo menos 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução de ensaio de luciferase Firefly misturando a solução de D-luciferina com a solução de ensaio de luciferase Firefly numa proporção de 1:50. Para uma placa inteira de 96 poços, combinar 3 mL da solução de substrato de luciferase com 60 μL da solução de D-luciferina com 2940 μL da solução tampão de luciferase Firefly.</li>
	<li>Adicionar 25 μL da solução de ensaio de luciferase Firefly aos lisados celulares e misturar a placa por agitação orbital durante 1 min. Analise a atividade da luciferase usando um leitor comercial de microplacas de luciferase.</li>
</ol>3. Extração de RNA de Ha-CoV-2 e PCR quantitativo de transcriptase reversa (RT-qPCR)
<ol><li>Extração de RNA viral: Extraia o RNA viral do tipo Ha-CoV-2 Wild e das partículas variantes Delta e Omicron do Ha-CoV-2 usando um kit comercial de extração de RNA viral, seguindo as instruções do fabricante. Armazenar o RNA viral extraído a -80 °C ou usá-lo imediatamente para RT-qPCR.</li>
	<li>RT-qPCR: Realize RT-qPCR no RNA viral usando uma mistura mestre de uma etapa. Realizar a reação em uma máquina de PCR comercial. Observe que o alvo da amplificação é o RNA genômico do Ha-CoV-2. Use o DNA vetorial Ha-CoV-2 como padrão para criar uma curva padrão e calcular o número de cópias de RNA de cada variante.</li>
</ol>4. Ensaio de anticorpos neutralizantes
<ol><li>Semeadura de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2): No dia anterior ao ensaio, semear células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) em uma placa de 96 poços em 50 μL de meio DMEM completo. As células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) são compradas comercialmente.</li>
	<li>Para a contagem de células, obter 20 μL de células de um frasco T75 contendo células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) e misturar com 20 μL de solução de azul de tripano. Adicionar 20 μL desta mistura à câmara de contagem de células e contar o número de células por ml. Para semear uma placa de 96 poços para infecção, use 2,5 x 104 células por poço, e 2,5 x 106 células serão necessárias no total. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora de CO2 a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Ensaio de anticorpos neutralizantes: Em uma placa estéril de polipropileno de 96 poços, prepare o anticorpo neutralizante padrão 27BV e a mistura de Ha-CoV-2. Adicionar 8 μL de 27BV (45 mg/mL) à placa e realizar diluições seriadas do anticorpo com 6 μL de DMEM livre de soro. NOTA: Certifique-se de trocar as pontas da pipeta entre as transferências de poço e certifique-se de que o meio livre de anticorpos e soro seja misturado completamente para produzir resultados precisos.</li>
	<li>Ao anticorpo diluído em série, adicione 54 μL de partícula de Ha-CoV-2 e misture o vírus e o anticorpo. Pré-incubar partículas de Ha-CoV-2 com 27BV diluído em série por 1 h a 37 °C a 5% de CO2. Após 1 h de incubação, aplicar 50 μL da mistura de anticorpos e Ha-CoV-2 na placa de 96 poços contendo as células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 células por poço) semeadas no dia anterior.</li>
	<li>Para os controles, deixe pelo menos três poços contendo apenas as células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Adicionar 50 μL de meio completo a esses poços para servir como poços não infectados para o sinal de fundo das leituras do ensaio de luciferase. NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui até que a infecção tenha atingido 18 h de incubação a 37 °C e, em seguida, a placa esteja pronta para ser analisada via ensaio de luciferase.</li>
	<li>Ensaio de Luciferase: Após 18 h de incubação, adicionar 7,5 μL de tampão de lise diretamente a cada poço e misturar por agitação orbital por 2 min. Lise as células em tampão de lise por pelo menos 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução de ensaio de luciferase Firefly misturando a solução de D-luciferina com a solução de ensaio de luciferase Firefly numa proporção de 1:50. Para uma placa inteira de 96 poços, combinar 3 mL da solução de substrato de luciferase com 60 μL da solução de D-luciferina com 2940 μL da solução tampão de luciferase de vagalume.</li>
	<li>Adicionar 25 μL da solução de ensaio de luciferase Firefly aos lisados celulares e misturar a placa por agitação orbital durante 1 min. Analise a atividade da luciferase usando um leitor comercial de microplacas de luciferase.</li>
</ol>5. Quantificação e análise estatística
<ol><li>Coleta de dados: Realizar dosagens de infecção e luciferase em triplicata conforme indicado (Figura 1). Quantificar a expressão da luciferase com leituras de ensaio de luciferase. A média é o valor médio das três leituras do ensaio de luciferase. As leituras do sinal de fundo de poços não infectados são subtraídas desse valor médio. O desvio padrão (DP) é determinado a partir do valor médio das leituras do ensaio de luciferase.</li>
	<li>Análise dos dados: Plotar a atividade de neutralização de anticorpos e calcular os valores de ID50 (50% de dosagem de inibição) usando um software gráfico comercial. O valor de ID50 é definido como as diluições inibitórias de anticorpos nas quais se obtém uma redução de 50% na infecção de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (com base nas leituras do ensaio de luciferase).</li>
</ol>

Quantificando anticorpos neutralizantes induzidos por vacina em variantes do SARS-CoV-2

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+emerging+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2:+Impacts,+challenges+and+strategies.">Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies.</a> Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+Disease+2019-COVID-19.">Coronavirus Disease 2019-COVID-19.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).</li><li>El-Shabasy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+waves+changes,+new+variant+strains,+and+vaccination+effect+against+COVID-19+pandemic.">Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , (2021).</li><li>Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+biosafety+measures+involving+SARS-CoV-2+and+the+classification+as+a+Risk+Group+3+biological+agent.">Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent.</a> Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).</li><li>Vanderheiden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Rapid+Focus+Reduction+Neutralization+Test+Assay+for+Measuring+SARS-CoV-2+Neutralizing+Antibodies.">Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies.</a> Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).</li><li>Dieterle, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication-Competent+Vesicular+Stomatitis+Virus+for+Studies+of+SARS-CoV-2+Spike-Mediated+Cell+Entry+and+Its+Inhibition.">A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition.</a> Cell Host &amp; Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+a+pseudotyped+virus-based+assay.">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.</a> Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).</li><li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+a+pseudovirus+neutralization+assay+for+SARS-CoV-2.">Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 680-686 (2020).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+effectiveness+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+system+as+determined+by+neutralizing+efficiency+and+entry+inhibition+test+in+vitro.">Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro.</a> Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).</li><li>Hetrick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+hybrid+alphavirus-SARS-CoV-2+pseudovirion+for+rapid+quantification+of+neutralization+antibodies+and+antiviral+drugs.">Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs.</a> Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).</li><li>Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+SARS-CoV-2+entry+into+cells.">Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).</li><li>Jackson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA+Vaccine+against+SARS-CoV-2+-+Preliminary+Report.">An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).</li><li>Polack, F. 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H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+SARS-CoV-2+Omicron+(B.1.1.529)+variant+of+concern+and+its+global+perspective.">Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective.</a> Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).</li></ol>

Uma patente foi registrada pela Universidade George Mason e licenciada para a Virongy Biosciences Inc. Y.W. é fundador e membro do conselho consultivo da Virongy Biosciences. B. H é atualmente o CEO e Diretor Científico da Virongy Biosciences. Os autores não têm outros conflitos de interesse.

A plataforma Ha-CoV-2 fornece um fluxo de trabalho rápido, robusto e simples para quantificar variantes virais e neutralizar anticorpos. No entanto, existem algumas etapas críticas que precisam de atenção. A produção do pseudovírus Ha-CoV-2 deve ser realizada utilizando células HEK293T com alta viabilidade. A eficiência da cotransfecção pode ser monitorada 24 h após a transfecção usando o gene repórter GFP do genoma do Ha-CoV-2. O genoma do Ha-CoV-2 pode conter dois repórteres (GFP e Luc), e a GFP pode ser expressa durante a cotransfecção e após a infecção por Ha-CoV-2 de células-alvo12. As células GFP+ da infecção estão normalmente em uma porcentagem baixa (1% a 5%), mas cada célula infectada expressa fortes sinais de GFP (Figura 3). Essa baixa porcentagem de GFP pode limitar o uso de GFP como uma leitura robusta para quantificar a neutralização de anticorpos, em comparação com o repórter Luc, que quantifica toda a população de células infectadas.
Ao realizar o ensaio de neutralização, é essencial trocar as pontas da pipeta entre as transferências de poço e garantir que o meio livre de anticorpos e soro sejam misturados completamente para produzir resultados precisos. Além disso, ao conduzir o protocolo de ensaio de luciferase, as células devem ser totalmente lisadas por pelo menos 3 min para garantir a lise completa das células e a liberação da enzima luciferase. Isso garantirá a precisão do ensaio. Além disso, uma vez que a solução de ensaio de luciferase Firefly é adicionada às placas ópticas de 96 poços de paredes brancas, a placa deve ser analisada dentro de 10 min, pois a emissão inicial de luz é alta, mas diminui com o tempo à medida que o ATP é esgotado21.
À medida que mais variantes do SARS-CoV-2 continuam a evoluir, há uma necessidade maior de plataformas como o Ha-CoV-2 para rastrear rapidamente a infectividade da variante e a sensibilidade da variante aos anticorpos neutralizantes induzidos pela vacina. A plataforma Ha-CoV-2 oferece velocidade mais rápida, maior relação sinal-ruído e um protocolo simples em comparação com os ensaios de neutralização baseados em pseudovírus existentes 8,9,10,11. A plataforma Ha-CoV-2 também oferece a vantagem de poder ser usada em laboratórios BSL-2 e não requer o uso de instalações BSL-3. Isso permite que a pesquisa do SARS-CoV-2 seja realizada em laboratórios clínicos e de pesquisa comuns. Além disso, a plataforma Ha-CoV-2 produz resultados rápidos em comparação com outros sistemas. Por exemplo, o estudo de anticorpos neutralizantes contra o vírus SARS-CoV-2 infeccioso frequentemente faz uso do teste de neutralização de redução de placa (PRINT)22. Embora o PRINT produza resultados confiáveis, a contagem manual de unidades formadoras de placas (UFP) é lenta e requer de 3 a 5 dias para obter os resultados23,24. Outros sistemas de pseudotipos, como o lentivírus-pseudovírus, necessitam de 24-72 h para produzir um sinal de repórter detectável12. Em comparação, o ensaio de neutralização do Ha-CoV-2 pode gerar resultados em 18 h. O Ha-CoV-2 fornece uma ferramenta conveniente para triagem rápida e quantificação de variantes virais e anticorpos neutralizantes para monitoramento de pandemias.
O monitoramento da infectividade do SARS-CoV-2 é essencial à medida que mais variantes de preocupação (VOCs) continuam a surgir. O Ha-CoV-2 oferece a vantagem de determinar rapidamente a infectividade dos VOCs. Estudos anteriores usaram modelagem baseada em inteligência artificial (IA) para analisar quantitativamente a infectividade da subvariante Omicron e de outras variantes do SARS-CoV-2, como a variante Delta25. Esses estudos mostraram que a variante Omicron é mais contagiosa do que o vírus original e mais propensa a escapar de anticorpos neutralizantes25. Nesses estudos, utilizando Ha-CoV-2, fenótipos semelhantes foram observados. Além disso, nos ensaios de neutralização de anticorpos, a variante Omicron tem dez vezes menos probabilidade de ser neutralizada por 27BV do que as cepas de Wuhan e Delta. Esses resultados também são consistentes com a maior transmissibilidade relatada da variante Omicron, que tem pelo menos 15 mutações em seu domínio de ligação ao receptor (RBD), provavelmente aumentando a afinidade de ligação viral ao receptor ACE2 para maior transmissibilidade e maior escape imunológico26.

Até maio de 2023, já foram mais de 766 milhões de casos de COVID-191. Apesar das campanhas mundiais de vacinação, o SARS-CoV-2 circula e infecta continuamente as pessoas, em grande parte devido ao surgimento de novas variantes como Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529), que impulsionam novas ondas de infecção 2,3,4. Dado que o SARS-CoV-2 está em constante evolução, é importante desenvolver ensaios rápidos que possam medir com precisão a infectividade de variantes emergentes e a eficácia dos anticorpos neutralizantes induzidos pela vacina contra essas variantes. Esses ensaios são essenciais para a vigilância da pandemia e para determinar a eficácia das vacinas e seus reforços específicos de variantes.
Devido à natureza altamente contagiosa do SARS-CoV-2, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) exige que o estudo do SARS-CoV-2 e suas variantes seja conduzido em instalações de nível de biossegurança (BSL) 3 5,6. Este requisito BSL-3 limita o uso de vírus vivos para quantificar a infectividade de variantes virais e seus anticorpos neutralizantes em pesquisas comuns e laboratórios clínicos. Além disso, os ensaios tradicionais de neutralização do SARS-CoV-2, tais como os ensaios baseados no efeito da placa ou do cytopathic usando vírus vivos competentes da replicação, são demorados e requerem longos períodos de incubação7. Vários pseudovírus SARS-CoV-2 pseudotipados com proteína spike (S) foram desenvolvidos para quantificar a eficácia de anticorpos neutralizantes 8,9,10,11,12. No SARS-CoV-2, a proteína S é a proteína principal que medeia a entrada viral13, e é o antígeno principal usado em vacinas SARS-CoV-2 9,10,14,15,16. Os virions pseudotipados da proteína S, como os do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) ou lentivírus, têm sido utilizados para a quantificação de anticorpos neutralizantes 17,18,19. No entanto, o pseudovírus baseado em lentivírus normalmente requer 2 a 3 dias de infecção para quantificar os sinais do repórter. Sistemas pseudovírus baseados em VSV geralmente contêm vírus VSV residuais, que podem resultar em altas taxas de resultados falso-positivos e tipicamente requerem 24 h de infecção20.
Um novo sistema de pseudovírus SARS-CoV-2, o pseudovírus híbrido alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), foi recentemente desenvolvido por Hetrick et al12. O Ha-CoV-2 fornece uma nova ferramenta para a quantificação rápida da infectividade do vírus e da sensibilidade do vírus a anticorpos neutralizantes em laboratórios BSL-2 comuns. Estruturalmente, o Ha-CoV-2 se assemelha à partícula do virion do SARS-CoV-2, consistindo de proteínas estruturais do SARS-CoV-2, incluindo a proteína S (S), a membrana (M), o nucleocapsid (N) e o envelope (E), e não há nenhuma proteína estrutural de outros vírus. Além disso, a partícula Ha-CoV-2 contém um genoma de RNA de expressão rápida de um alfavírus para rápida expressão em células. Foi demonstrado que o Ha-CoV-2 mede rapidamente a atividade neutralizante de anticorpos no soro de indivíduos vacinados e convalescentes12. Como demonstrado por Hetrick et al., quando comparado com o pseudovírus SARS-CoV-2 baseado em lentivírus em um ensaio do curso do tempo, Ha-CoV-2 expressou o repórter de Luc tão cedo quanto 2-4 h pós-infecção, enquanto o pseudovirus do lentivirus expressou Luc após 24 h12. Além disso, a aplicação potencial de variantes do Ha-CoV-2 para quantificar anticorpos neutralizantes é demonstrada com o uso de um anticorpo neutralizante monoclonal padrão, o 27BV (ver Figura Suplementar 1)12. Este trabalho detalha o uso da plataforma Ha-CoV-2 para quantificação rápida da infectividade das variantes do SARS-CoV-2, usando as variantes Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529) como exemplos. Além disso, a aplicação potencial de variantes de Ha-CoV-2 para quantificar anticorpos neutralizantes é ainda demonstrada usando um anticorpo neutralizante monoclonal padrão, 27BV12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>27VB1 20 &#181;g SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>27VBI-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL - US Origin FBS</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat# 24-300&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2043-30-1158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlowMax Discover Microplate reader</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>GM3000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 E Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 M Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 N Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 WT S Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_WT S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hek293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays</td>
			<td>Gold Bio&#160;</td>
			<td>I-930-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, &#956;Clear White Flat Round, Chimney)&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>Cat# 82050-758&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&#936; (Ha-CoV-2 Genome) Vector&#160;</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-based Transfection Reagent</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Transfectin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A43163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Ready-To-Use-Cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S&#160; Omicron (B.1.1.529) Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2-B.1.1.529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&#160;Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2- B.1.617.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PES, 0.22&#181;m</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4444432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of ha-cov-2 pseudovirus for rapid quantification of sars-cov-2 variants and neutralizing antibodies

A pandemia da doença 2019 do coronavirus (COVID-19) destacou a necessidade de ensaios rápidos para medir com precisão a infectividade das variantes emergentes do SARS-CoV-2 e a eficácia dos anticorpos neutralizantes induzidos pela vacina contra variantes virais. Esses ensaios são essenciais para a vigilância da pandemia e validação de vacinas e reforços específicos de variantes. Este manuscrito demonstra a aplicação de um pseudovirus alfavirus-SARS-CoV-2 híbrido novo (Ha-CoV-2) para a quantificação rápida da infectividade da variante SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes vacina-induzidos às variantes virais. Ha-CoV-2 é uma partícula semelhante ao vírus SARS-CoV-2 que consiste em proteínas estruturais virais (S, M, N e E) e um genoma de RNA de expressão rápida derivado de um alfavírus, Semliki Forest Virus (SFV). O Ha-CoV-2 também contém proteína fluorescente verde (GFP) e genes repórteres de luciferase que permitem a quantificação rápida da infectividade viral. Como exemplo, a infectividade das variantes Delta do SARS-CoV-2 (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529) são quantificadas, e suas sensibilidades a um anticorpo neutralizante (27VB) também são medidas. Esses exemplos demonstram o grande potencial do Ha-CoV-2 como uma plataforma robusta para a quantificação rápida de variantes do SARS-CoV-2 e sua suscetibilidade a anticorpos neutralizantes.

As of May 2023, there have now been more than 766 million COVID-19 cases1. Despite worldwide vaccination campaigns, SARS-CoV-2 continuously circulates and infects people, largely due to the emergence of new variants such as Delta (B.1.617.2) and Omicron (B.1.1.529) that drive new waves of infection2,3,4. Given that SARS-CoV-2 is constantly evolving, it is important to develop quick assays that can accurately measure the infectivity of emerging variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against these variants. These assays are essential for pandemic surveillance and for determining the efficacy of vaccines and their variant-specific boosters.
Due to the highly contagious nature of SARS-CoV-2, the Center for Disease Control and Prevention (CDC) requires that the study of SARS-CoV-2 and its variants is conducted in biosafety level (BSL) 3 facilities5,6. This BSL-3 requirement limits the use of live viruses for quantifying the infectivity of viral variants and their neutralizing antibodies in common research and clinical laboratories. In addition, traditional SARS-CoV-2 neutralization assays, such as the plaque- or cytopathic effect-based assays using replication-competent live viruses, are time-consuming and require long incubation periods7. Several spike (S) protein-pseudotyped SARS-CoV-2 pseudoviruses have been developed to quantify the effectiveness of neutralizing antibodies8,9,10,11,12. In SARS-CoV-2, the S protein is the major protein that mediates viral entry13, and is the main antigen used in SARS-CoV-2 vaccines9,10,14,15,16. The S protein-pseudotyped virions, such as those of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) or lentivirus, have been used for the quantification of neutralizing antibodies17,18,19. Nevertheless, the lentivirus-based pseudovirus normally requires 2 to 3 days of infection in order to quantify reporter signals. VSV-based pseudovirus systems often contain residual VSV viruses, which can result in high rates of false-positive results and typically require 24 h of infection20.
A novel SARS-CoV-2 pseudovirus system, the hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), has been recently developed by Hetrick et al12. Ha-CoV-2 provides a new tool for the rapid quantification of virus infectivity and virus sensitivity to neutralizing antibodies in common BSL-2 laboratories. Structurally, Ha-CoV-2 resembles the SARS-CoV-2 virion particle, consisting of SARS-CoV-2 structural proteins including the S protein (S), the membrane (M), the nucleocapsid (N), and the envelope (E), and there is no structural protein from other viruses. Additionally, Ha-CoV-2 particle contains a rapid-expressing RNA genome from an alphavirus for fast reporter expression in cells. Ha- CoV-2 has been shown to quickly measure the neutralizing activity of antibodies in the sera of vaccinated and convalescent individuals12. As demonstrated by Hetrick et al., when compared with lentivirus-based SARS-CoV-2 pseudovirus in a time course assay, Ha-CoV-2 expressed the Luc reporter as early as 2-4 h post-infection while the lentivirus-pseudovirus expressed Luc after 24 h12. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a&#160; standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV (See Supplementary Figure 1)12. This work details the use of the Ha-CoV-2 platform for rapid quantification of the infectivity of SARS-CoV-2 variants, using the Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants as examples. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV12.

Autor em destaque: Um sistema de vírus de pseudotipo para avaliar subvariantes Omicron e anticorpos neutralizantes na pesquisa de SARS-CoV-2

Aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2 para quantificação rápida de variantes do SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes

We have established two main findings in this protocol. First, our Ha-CoV-2 platform demonstrates that the newly emerged Omicron subvariant is more infectious than the original Wuhan strain. Additionally, Omicron subvariants are more resistant to neutralizing antibodies induced by previous strains.SARS CoV-2 research requires BSL-3 facilities, making it difficult for common laboratories to monitor SARS-CoV-2 variants and to quantify neutralizing antibodies. Our Ha-CoV-2 system is a pseudotype virus that can be used in common laboratories and provides a faster way to quantify viral variants and their sensitivity to neutralizing antibodies. Ha-CoV-2 is a virus-like particle that has all the structural proteins of SARS-CoV-2 and resembles SARS-CoV-2.Also, Ha-CoV-2 uses and alpha viral vector for robust and rapid gene expression, producing fast results and a high signal to noise ratio for great reproducibility.

As partículas de Ha-CoV-2 foram montadas usando cinco vetores de DNA diferentes que expressam o genoma do RNA do Ha-CoV-2 e as proteínas estruturais (M, N, E e S) do SARS-CoV-2 em células HEK293T. O vetor da proteína S varia dependendo da variante S. A proteína S da cepa original Ha-CoV-2 de Wuhan (Wild-type, Wt) foi usada como controle positivo, e foi montada junto com a proteína S de cada uma das outras duas variantes: a Delta (B.1.617.2) ou a Omicron (B.1.1.529). Os mesmos M, N, E foram usados em todas as variantes. Ha-CoV-2(Wt) e partículas variantes foram coletadas 48 h após a cotransfecção e usadas para infectar células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). A infectividade foi medida pela expressão de luciferase 18 h após a infecção. Nesse sistema, níveis mais elevados de expressão do sinal da luciferase refletem uma maior infecção de células por Ha-CoV-2. O sinal da luciferase foi normalizado com cópias de RNA genômico por RT-qPCR para cada variante. Como mostrado na Figura 1, a variante Ha-CoV-2 Omicron gerou sinal 4 a 10 vezes maior do que o Ha-CoV-2 original (Wt), sugerindo uma maior infectividade.
Além disso, a capacidade do 27BV de neutralizar as variantes HaCoV-2(Wt), Delta e Omicron foi quantificada. 27BV é um anticorpo monoclonal do coelho que foi desenvolvido contra o domínio RBD da proteína SARS-COV-2 S1. Para os ensaios de neutralização, diluições seriadas de 27BV foram realizadas em uma placa de 96 poços, pré-incubada com Ha-CoV-2 e, em seguida, adicionadas às células-alvo de HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Os resultados demonstraram que o 27BV apresentou atividade neutralizante contra todas as variantes testadas (Figura 2). Curiosamente, o ID50 de 27VB para Omicron foi aproximadamente 10 vezes menos potente do que o ID50 para Ha-CoV-2(WT) e Ha-CoV-2(Delta; Gráfico 2). Esses resultados demonstram que a plataforma Ha-COV-2 pode ser usada como um método rápido para quantificar anticorpos neutralizantes induzidos por vacinas em variantes emergentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg"> Gráfico 1. Montagem e quantificação de variantes do Ha-CoV-2. (A) Ilustração da montagem do Ha-CoV-2 e partículas variantes. Os vetores que expressam o genoma do repórter Ha-CoV-2 e as proteínas estruturais (M, S, N e E) são cotransfectados em células HEK293T. As partículas foram colhidas 48 h após a cotransfecção (a imagem da partícula do virion e as células HEK293T foram criadas com Biorender.com). (B) Quantificação da infectividade das variantes do Ha-CoV-2. A infectividade relativa das duas variantes (Delta e Omicron) é quantificada e normalizada usando cópias de RNA genômico de variantes individuais do Ha-CoV-2 (Luc). O tipo selvagem é o Ha-COV-2 (Wt), que é usado como um controle para comparação. Os ensaios de infecção e luciferase foram realizados 3x. UR, unidade relativa. A média e o desvio padrão (DP) são mostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg"> Gráfico 2. Quantificação da atividade de neutralização do 27BV contra variantes do Ha-CoV-2(Luc) A atividade de neutralização do 27BV foi analisada 18 h após a infecção de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). O ID50 foi calculado usando a taxa de infecção relativa (atividade da luciferase) versus a concentração de 27BV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg"> Gráfico 3. Infecção de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) com Ha-CoV-2(GFP). Partículas de Ha-CoV-2 (GFP) foram montadas e usadas para infectar células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). A expressão de GFP foi observada 48 h após a infecção usando microscopia fluorescente. O campo branco das células infectadas é mostrado à esquerda, e a imagem da GFP é mostrada à direita. A barra branca representa 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1. Resumo Gráfico. A estrutura e aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2. Imagem criada com Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 1. Sequências de Proteínas. Lista das sequências das proteínas S, M, N e E do SARS-CoV-2. As sequências da proteína S também incluem as variantes do SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) e Delta (B.1.617.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies at JoVE.com

Este protocolo descreve a aplicação de um pseudovirus híbrido novo alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) como uma plataforma para a quantificação rápida da infecciosidade das variantes SARS-CoV-2 e sua sensibilidade aos anticorpos neutralizantes.

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Estabelecemos dois achados principais neste protocolo. Primeiro, nossa plataforma Ha-CoV-2 demonstra que a subvariante Omicron recém-emergida é mais infecciosa do que a cepa original de Wuhan. Além disso, as subvariantes de Omicron são mais resistentes a anticorpos neutralizantes induzidos por cepas anteriores.A pesquisa do SARS CoV-2 requer instalações BSL-3, tornando difícil para os laboratórios comuns monitorar as variantes do SARS-CoV-2 e quantificar os anticorpos neutralizantes. Nosso sistema Ha-CoV-2 é um vírus de pseudotipo que pode ser usado em laboratórios comuns e fornece uma maneira mais rápida de quantificar variantes virais e sua sensibilidade a anticorpos neutralizantes. Ha-CoV-2 é uma partícula semelhante a um vírus que tem todas as proteínas estruturais do SARS-CoV-2 e se assemelha ao SARS-CoV-2.Além disso, o Ha-CoV-2 utiliza vetor viral alfa para expressão gênica robusta e rápida, produzindo resultados rápidos e uma alta relação sinal/ruído para grande reprodutibilidade.

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

701 visualizações.  George Mason University. Estabelecemos dois achados principais neste protocolo. Primeiro, nossa plataforma Ha-CoV-2 demonstra que a subvariante Omicron recém-emergida é mais infecciosa do que a cepa original de Wuhan. Além disso, as subvariantes de Omicron são mais resistentes a anticorpos neutralizantes induzidos por cepas anteriores.A pesquisa do SARS CoV-2 requer instalações BSL-3, tornando difícil para os laboratórios comuns monitorar as variantes do SARS-CoV-2 e quantificar os anticorpos neutraliz...