この研究は、中国国家自然科学基金会(81960226、81760223年)、雲南省自然科学基金会(202001AS070045、202301AY070001-011)、雲南省教育局科学研究基金会(2023Y0784)からの助成金によって支援されました。

本研究成果は、昆明医科大学動物実験倫理委員会(kmmu20220945)の承認を得ました。すべての実験は、確立された動物管理ガイドラインに従っていました。軟髄膜リンパ管内皮細胞(LREC)は、6〜8週齢、体重20〜25gの雄のC57Bl/6Jマウスから採取した。これらのマウスは、中国の昆明にある昆明医科大学から調達しました。実験手順全体は、厳格な無菌条件下で実施されました。遠心分離工程は、特に指定のない限り、室温で行います。
1. 試薬・器具の調製
注意: ソリューションに関連するすべてのステップは、クラスIIバイオハザードキャビネット内で実施する必要があります。
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をカルシウムおよびマグネシウム、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)と混合して、洗浄バッファーを調製します( 材料表を参照)。このバッファーを4°Cで冷たく保ちます。 使用当日に新鮮な状態で調製し、緩衝液を脱気することが不可欠です。</li>
	<li>10 mLのPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)と2 mLの0.25%トリプシン、1 mLの20 mg/mLパパイン、および200 μLの1 mg/mLコラゲナーゼIを組み合わせて消化酵素を調製します( 材料表を参照)。 注意: 凍結融解サイクルが繰り返されないように、適切な容量のアリコートを使用してください。これらのアリコートは-20°Cで保管してください。</li>
	<li>VEGF-C(100 ng/mL)および1% P/Sを含む市販の内皮細胞増殖培地キットを利用して培地を調製します( 材料表を参照)。</li>
	<li>ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に10%FBSを添加して停止バッファーを調製し、消化プロセスを停止させます。</li>
	<li>滅菌手術器具を準備する:これらの器具には、はさみ、鋸歯状の先端ピンセット、および細かいピンセットを含める必要があります。</li>
</ol>2.フラスココーティング
<ol><li>T25フラスコに100 μg/mLのフィブロネクチン溶液( 材料表を参照)をコーティングし、37°Cで一晩インキュベートします。 使用前にピペットで塗布液を除去してください。</li>
	<li>フラスコをPBSで3回洗浄し、続いてPBSを吸引し、T25フラスコを風乾させます。</li>
</ol>3.軟髄膜の解離
注:常に4°Cで予冷したバッファーと溶液を使用してください。
<ol><li>4%イソフルランを過剰に吸入してマウスに麻酔をかけ、70%エタノールで洗浄したハサミを使用して迅速に斬首してマウスを犠牲にします。</li>
	<li>頭蓋骨の後ろの開口部から始めて、前頭部に向かって伸びる正中線に沿って皮膚を慎重に切開します。</li>
	<li>頭蓋骨を繊細に取り外し、はさみでそっと持ち上げて軟髄膜を損傷しないようにし、軟髄膜を含む脳全体を確実に取得します。</li>
	<li>脳全体を洗浄バッファーに浸し、静かに洗い流して表面の血液を取り除きます。</li>
	<li>脳を刻まずに滅菌シャーレに移し、顕微鏡下で細かいピンセットを使用して脳の表面から軟髄膜を抽出します。</li>
	<li>滅菌マイクロハサミを使用して、軟髄膜組織を断片に切断します。</li>
</ol>4.軟髄膜酵素消化
<ol><li>酵素ミックス(ステップ1.2)10 mLをフラグメントに加え、37°Cで15分間インキュベートします。静かに攪拌して、破片がチューブの底から剥がれるようにします。その後、10 mLの停止バッファー(ステップ1.4)を添加して消化を停止します。</li>
	<li>4°Cで5分間、300 x g で遠心分離し、ピペットを使用して上清を慎重に除去します。</li>
	<li>10 mLの冷たいPBSを加え、混合物を70 μmのストレーナーに通して滅菌済みの50 mLチューブに通し、凝集塊をろ過します。</li>
</ol>5.セルの拡張
<ol><li>1 x 105 cells per cm 2をフィブロネクチンでコーティングしたT25フラスコ(ステップ2 )に5 mLの培地とともにプレーティングします。</li>
	<li>細胞を37°Cで5%CO2 で24時間インキュベートします。その後、培地を除去して、付着していない細胞を取り除きます。</li>
	<li>培地の50%を2日ごとに交換することで、培養を維持します。このプロセスを2〜3回繰り返します。</li>
</ol>6. 磁性セルの選択
注:迅速に作業し、細胞の冷たさを維持し、予冷溶液を利用して非特異的な細胞標識を防ぎます。
<ol><li>器具と試薬の調製:磁気セパレーターを磁気セパレータースタンドに取り付けます( 材料表を参照)。選択カラムを磁気分離器に接続し、選択カラムの上に70 μmのセルストレーナーを配置します。選択カラムの下に 50 mL チューブを置き、フローを収集します。</li>
	<li>酵素消化:細胞が80%コンフルエントに達したら、培地を吸引し、細胞をPBSで洗い流します。0.25%トリプシンを添加して接着細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートします。停止バッファーを添加して消化を停止します。細胞を室温で300 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>抗体インキュベーション:100 μLのPBSに1 x 10 7個の細胞を再懸濁し、10 μLのLYVE-1抗体を添加します( 材料表を参照)。十分に混合し、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。<ol><li>細胞を300 x g で5分間回転させ、上清を廃棄します。1 mLのPBSを導入し、300 x g で5分間遠心分離して細胞をすすぎます。上澄みを完全に取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロビーズ標識:細胞を100 μLのPBSに再懸濁し、20 μLのマイクロビーズを加えます( 材料表を参照)。よく混合し、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。<ol><li>細胞を300 x g で5分間回転させ、上清をデカントします。続いて、1 mLのPBSで300 x g で5分間遠心分離し、細胞を洗浄します。最後に、上澄みを完全に取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>磁気陰性排除:細胞を4 mLのPBSに再懸濁します。細胞を70μmのセルストレーナーに通し、凝集塊を除去します。3 mLのPBSで洗い流して選択カラム( 材料表を参照)を調製し、細胞懸濁液を選択カラムに塗布します。<ol><li>3 mL の PBS で洗浄ステップを行い、LYVE-1 陰性細胞を選択カラムの下に配置した 50 mL チューブに集めて通過させます。</li>
	</ol></li>
	<li>磁気ポジティブセレクション:6 mLのPBSを選択カラムにピペットで移します。プランジャーを選択カラムにしっかりと押し込むことで、磁気標識された細胞を即座に洗い流し、LYVE-1陽性LLECを取得します。 注:次の手順に進む前に、必ず選択列リザーバーが空になるまで待ってください。</li>
</ol>7. LLECの文化
<ol><li>LYVE-1陽性LLECを300 x g で5分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。</li>
	<li>1 x 105 cells/cm2 をフィブロネクチンでコーティングしたT25フラスコに5mLの培地とともにプレーティングします。</li>
	<li>培地の50%を1日おきに交換して培養を維持します。細胞が80%のコンフルエントに達したら、0.25%トリプシンで細胞を剥離し、細胞継代を行います。2〜3継代後のその後の実験に細胞を利用します。</li>
</ol>8. フローサイトメトリー解析
注:フローサイトメトリー解析は、前述の手順15に従って実施した。
<ol><li>0.25%トリプシンを添加して接着細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートします。次に、停止バッファーを添加して消化を停止します。</li>
	<li>細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。1 x 106 細胞を100 μLのPBSに再懸濁します。</li>
	<li>LYVE-1抗体1 μLを添加します。完全に混合し、室温で暗所で10分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を適切な量のPBSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーおよびFlowJoソフトウェアを使用して分析します( 材料表を参照)。</li>
</ol>9. 免疫蛍光染色
注:免疫蛍光染色は、前述の手順に従って行いました16。
<ol><li>細胞をPBSで3回洗浄します。セルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で10分間固定します。PFAを廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄します。</li>
	<li>ブロックバッファーを室温で1時間アプライします。カバーガラスからブロックバッファーを取り外します。</li>
	<li>染色バッファー中のLYVE-1抗体を細胞に添加し、暗所でインキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄します。</li>
	<li>染色バッファー中の適切な二次抗体( 材料表を参照)を細胞に添加し、暗所でインキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄します。</li>
	<li>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)による対比染色。これで、細胞は免疫蛍光顕微鏡検査の準備が整いました。</li>
</ol>

磁気細胞選択法を用いたIn vitro RHEC培養法の樹立

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium.">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

著者らは、開示すべき利益相反がないことを宣言します。

in vitroでLLECを採取および培養するための既存のプロトコルは、以前に報告されていません。この研究では、マウス軟髄膜からLLECを採取および培養するための再現性のあるマルチプロシージャルプロトコルを紹介します。
このマルチプロシージャルプロトコルは再現可能ですが、いくつかの重要な考慮事項があります。例えば、フィブロネクチンでコーティングさ?...

新たに発見された軟髄膜リンパ管内皮細胞(LLEC)は、軟髄膜内の個々の細胞の網目構造を形成し、末梢リンパ管内皮細胞と比較して明確な分布パターンを示します1,2。LLECに関連する細胞機能と臨床的意味合いは、ほとんど未知の領域のままです。LLECの機能研究への道を開くためには、その研究のためのin vitroモデルを確立することが不可欠です。したがって、この研究では、LLECの単離と初代培養のための包括的なプロトコルを考案しました。
マウスは、疾患研究における遺伝子操作に適しているため、好ましい動物モデルです。これまでの研究では、リンパ節3、腸間膜組織4、真皮組織5、採取リンパ管6、肺組織7など、さまざまなマウス組織からリンパ内皮細胞を単離することに成功しています。これらの単離手順は、主に磁気活性化細胞選別(MACS)やフローサイトメトリーソーティングなどの技術に依存してきました8,9,10。さらに、研究努力により、ラットくも膜細胞株およびラットリンパ毛細血管細胞株が確立されました11,12。軟髄膜13の外植片培養技術が存在するにもかかわらず、LLECの単離と培養のための標準化されたプロトコルが緊急に必要とされています。その結果、本研究では、顕微鏡のガイド下で細髄膜を細心の注意を払って解離させ、血管内皮増殖因子-C(VEGF-C)を用いてLLECの増殖を促進することで、LLECの採取と培養に成功しました。リンパ管内皮細胞の特徴的なマーカーは、リンパ管ヒアルロン酸受容体-1(LYVE-1)14である。このマルチステッププロトコルでは、MACSを用いてLYVE-1陽性LLECを選択的に単離し、その後、フローサイトメトリー解析と免疫蛍光染色によってその純度を検証します。
この多段階のプロトコルの主なステップは次の通り要約することができる:フラスコのコーティング、leptomeningesの解離、leptomeningesの酵素の消化力、細胞拡張、磁気細胞の選択およびそれに続くLLECsの培養。最後に、単離されたLLECの純度は、フローサイトメトリー分析および免疫蛍光染色によって確認されます。この研究の包括的な目的は、マウス軟髄膜およびその後の in vitro 培養からLLECを単離するための再現性のある多段階プロトコルを提示することです。このプロトコルはLLECsの細胞機能そして臨床含意に調査を非常に促進するために態勢を整える。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

軟髄膜リンパ内皮細胞(LREC)は、末梢リンパ内皮細胞とは明らかに異なる独特の分布を持つ、最近発見された頭蓋内細胞集団です。それらの細胞機能と臨床的意味は、ほとんど不明のままです。したがって、LLECの供給は、in vitroで機能研究を行うために不可欠です。しかし、現在、in vitroでLLECを収穫および培養するための既存のプロトコルはありません。
この研究では、フラスコをフィブロネクチンでコーティングし、顕微鏡の助けを借りて軟髄膜を解剖し、軟髄膜を酵素的に消化して単一細胞懸濁液を調製し、血管内皮増殖因子-C(VEGF-C)でLLECの増殖を誘導し、磁気活性化細胞選別(MACS)によるリンパ管ヒアルロン酸受容体-1(LYVE-1)陽性細胞を選択するなど、多段階のプロトコルを使用してLLECを採取することに成功しました。このプロセスは、最終的に一次文化の確立につながりました。LLECの純度は、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー解析によって確認され、純度レベルは95%を超えました。この多段階プロトコルは、再現性と実現可能性を実証しており、LLECの細胞機能と臨床的意味の探求を大幅に促進します。

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

著者スポットライト:軟髄膜リンパ内皮細胞の細胞機能と潜在的な臨床的意味を明らかにする 

軟髄膜リンパ管内皮細胞の採取と初代培養

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

この研究は、マウスからリンパ管内皮細胞(LLECs)を採取し、その後in vitroで初代培養を確立するための再現性のある多段階プロトコルを提示します。重要なステップには、フラスコの調製とフィブロネクチンコーティング、軟髄膜の解離、酵素消化による単一細胞懸濁液の取得、およびVEGF-CによるLLECの増殖の誘導が含まれます。次に、LYVE-1陽性LLECは、磁気活性化セルソーティング(MACS)?...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Cellular Functions and Potential Clinical Implications of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

最近同定された頭蓋内細胞タイプである軟髄膜リンパ内皮細胞(LREC)は、機能が十分に理解されていません。この研究は、マウスからLLECを採取し、 in vitro 初代培養を確立するための再現性のあるプロトコルを提示します。このプロトコルは、研究者がLLECの細胞機能と潜在的な臨床的意味を掘り下げることができるように設計されています。

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

このプロトコルは、他の研究者によってのみ関心のある領域のために設計されており、文化的な一次領域にマルチ手順を確立し、文化的な一次領域私たちのプロトコルは、最終的に95%を超える純度レベルでエリアCSの一次培養の確立につながりました収穫と培養のための既存のプロトコルは現在ありません私たちの結果は、仮想でのLLECSの同様の機能をさらに調査するための道を開きました。RUCでは、最近発見した頭蓋内細胞集団、RUCの生物学的意義細胞機能についてさらに研究を行い、その臨床的意味合いを検討します。

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

871 ビュー.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. このプロトコルは、他の研究者によってのみ関心のある領域のために設計されており、文化的な一次領域にマルチ手順を確立し、文化的な一次領域私たちのプロトコルは、最終的に95%を超える純度レベルでエリアCSの一次培養の確立につながりました収穫と培養のための既存のプロトコルは現在ありません私たちの結果は、仮想でのLLECSの同様の機能をさらに調査するた?...

ビデオ: 著者スポットライト:軟髄膜リンパ内皮細胞の細胞機能と潜在的な臨床的意味を明らかにする 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

神経科学

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

マウス軟髄膜細胞の効率的な培養のための軟髄膜解離と酵素消化

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.