この研究は、中国国家自然科学基金会(81960226,81760223)からの助成金によって支援されました。雲南省自然科学財団(202001AS070045,202301AY070001-011)

実験プロトコルは、昆明医科大学の動物倫理および使用委員会(kmmu20220945)によって承認されました。本研究では、雌雄300〜350gのSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。
1. SAHモデルの誘導
<ol><li>2%イソフルランと100%酸素を使用してラットを麻酔します。イソフルラン(1%〜3%)を連続吸入麻酔に供給することにより、麻酔を維持します。.脳定位固定装置を使用してラットの頭を固定します( 材料表を参照)。</li>
	<li>以下の手順に従って SAH モデルを作成します。<ol><li>マイクロインジェクションニードルを上槽に挿入します。次に、シリンジポンプを使用して、ラットの尾動脈(抗凝固剤なし)から自家血液を上槽槽に注入します( 材料表を参照)。</li>
		<li>上記の座標を使用して、右外側脳室にマイクロ注射針を埋め込みます:ブレグマ、-0.8 mm;横方向、1.4 mm;奥行き、4 mm9。SAH群の場合、0.2 mLのラット尾動脈血を注入します。偽グループの場合、同じ量の等張生理食塩水を投与します(図1A)。</li>
	</ol></li>
</ol>2.脳スライスの準備と安定化
<ol><li>2%イソフルラン吸入を使用してラットに深く麻酔をかけます。.斬首後、脳全体を摘出し、氷冷した人工脳脊髄液(ACSF)に浸します。 注:134 mM NaCl、2.8 mM KCl、29 mM NaHCO3、1.1 mM NaH 2 PO 4、1.5 mM MgSO4、2.5 mM CaCl2、10.11 mM D-グルコースの組成で新たに調製したACSF溶液を使用してください(材料表を参照)。pHを7.3〜7.4に維持します。</li>
	<li>ビブラトーム(材料表参照)を使用して、5%CO2および95%O2で曝気した氷冷ACSF中のSDラットから厚さ200μmの急性脳スライスを調製します(図2)。</li>
	<li>厚さ200μmの急性脳スライスを、ACSFに浸したナイロンメッシュの保存チャンバーに入れます。ACSF溶液を95%O2 および5%CO2で平衡化し、35〜37°Cの温度範囲を維持します。 脳スライスを2時間安定させ、調整する時間を与えます(図3)。</li>
</ol>3. TO-PRO-3による急性脳切片の周皮細胞の標識
注:急性脳切片由来の周皮細胞は、トレーサーTO-PRO-310を用いて蛍光標識した。
<ol><li>蛍光色素TO-PRO-3をACSFに添加し、最終濃度1 μMにします。 急性期の脳スライスを室温で、TO-PRO-3を含むACSFとともに暗所で20分間インキュベートします。 注意: 保護のため、TO-PRO-3を取り扱うときは、ラテックス手袋を着用することを忘れないでください。</li>
	<li>脳スライスを運ぶナイロンメッシュストレーナーをローディングチャンバーから6ウェルプレートリンスチャンバーに移します( 材料表を参照)。脳スライスをすすぎチャンバーに10分間留置します(図4D)。 注:このすすぎステップは、染色プロセスを終了し、バックグラウンド標識を減らし、非特異的染色を防ぎます。</li>
	<li>5% CO 2 と 95% O2 の混合物で平衡化した ACSF 溶液を使用して、調製物を合計 15 分間すすぎます。このすすぎステップにより、色素の取り込みが停止され、バックグラウンド標識が最小限に抑えられます(図4C)。</li>
</ol>4. 急性脳切片における脳微小循環の非生命周皮細胞の染色
<ol><li>TO-PRO-3をプレロードした脳スライスを、イソレクチンB4をAlexa Fluor 488(FITC-ISOB4;5 μg/mL、 材料表参照)に結合させた状態で37°Cで暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、脳スライスをACSFで15分間すすぎます(図4E)。</li>
	<li>通常どおり、5%CO2および95%O2でガス化したACSFで脳スライスをインキュベートします。37°Cで両方の溶液に37μMの濃度のヨウ化プロピジウム(PI)を加えます。 これにより、非重要な脳周皮細胞がラベル付けされます。このACSF溶液中で調製物を暗所で60分間インキュベートします(図4F)。</li>
	<li>次に、調製物をACSF溶液で15分間すすぎ、色素の取り込みを停止し、バックグラウンド標識を最小限に抑えます。</li>
</ol>5. 急性期脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング
<ol><li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して、脳のスライスをガラス底の共焦点皿(材料表を参照)に静かに移します。5%CO2および95%O2で事前に平衡化したACSF溶液を皿に充填します。鉄のメッシュを使用して、ラットの脳スライスを所定の位置に固定します。</li>
	<li>ガラス底の共焦点ディッシュを共焦点顕微鏡のステージに移します。急性脳スライスを皿の底に配置し、共焦点顕微鏡イメージング中に95%O2と5%CO2の混合物で平衡化したACSF溶液で9を灌流します(図5Aおよび図5Ab')。</li>
	<li>大脳皮質微小血管系の壁細胞を40倍の対物レンズで可視化します。互換性のあるソフトウェアを使用して画像スタックをキャプチャします( 材料表を参照)。IB4(励起/発光 460 nm/520 nm)、PI(励起/発光 545 nm/595 nm)、TO-PRO-3(励起/発光 606 nm/666 nm)に適したフィルターを使用します(図5D)。 注:40× DIC N1対物レンズ、3×12ビット:512×512ピクセル(0.22 × 0.22 mm)、キャリブレーション:0.42 μm / px。</li>
	<li>脳微小血管系と周皮細胞を、そのネットワークと形態に基づいて同定します。各脳スライス上の脳微小血管系ネットワークを含む特定の領域を特定し、画像をキャプチャします。</li>
	<li>その後のキャプチャで一貫性を確保するために、イメージング位置を注意深くメモします(図5B、C)。さらなる処理と分析には、画像解析ソフトウェア(ImageJ)と写真編集ソフトウェア( 材料表を参照)を使用します。</li>
</ol>

くも膜下出血後の脳周皮細胞収縮性の可視化

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

重要な脳周皮細胞、非重要な脳周皮細胞、および脳スライスの微小血管系を視覚化するための高解像度共焦点イメージング技術を開発しました。急性ラットの脳切片では、このプロセスでは、TO-PRO-311による周皮細胞の最初の標識、続いてIB412による微小血管内皮細胞の標識が伴います。その後、PIを用いて死亡した周皮細胞の同定を行います。このプロト?...

脳周皮細胞は、細い隆起と突出した細胞体によって区別され、微小循環を取り囲んでいます1,2。脳血流増強は主に毛細血管拡張によって引き起こされるが、細い動脈は拡張速度が遅い3。ペリサイトの収縮性は、毛細血管径とペリサイトの形態に影響を与え、血管動態に影響を与えます4。脳周皮細胞の収縮は毛細血管収縮につながり、病理学的シナリオでは、過度の収縮が赤血球の流れを妨げる可能性があります5。座骨髄から放出されるノルエピネフリンを含むさまざまな要因が、毛細血管内の脳周皮細胞の収縮を誘発する可能性があります6。ペリサイトは、脳血流の調節に関与し、20-HETE合成を示し、高酸素症の際に酸素センサーとして機能します7。酸化的・硝化的ストレスによる脳周皮細胞の収縮は毛細血管に悪影響を及ぼす5.脳周皮細胞の収縮に関するin vivoおよびex vivoの両方の研究にもかかわらず8、脳スライス内の生存可能および非生存可能な脳周皮細胞のイメージングに関する限られた知識が残っています。
重要なことに、脳周皮細胞の組織固定後のイメージングは、それらの活力とその後の収縮性評価を損ないます。さらに、神経疾患(くも膜下出血など-SAH)などのシナリオでは、脳周皮細胞のトランスジェニック標識は、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別できないことが、予備的なSAH誘発性脳周皮細胞死研究によって確認されています9。 
これらの課題を克服するために、TO-PRO-3を使用して生きた周皮細胞を標識し、死亡したペリサイトはヨウ化プロピジウム(PI)で染色しました。高解像度の共焦点イメージング技術を使用して、イメージング中にスライス活性を維持しながら、脳スライス内の生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を視覚化しました。本稿は、SAH後の脳微小循環に対する脳周皮細胞の影響を調査するための貴重なツールとして役立つ、脳スライス中の生存可能および非生存の脳周皮細胞をイメージングするための再現性のある方法を提示することを目的としています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

周皮細胞は、脳の微小循環内に位置する重要な壁細胞であり、収縮性の調整を介して脳の血流を積極的に調節する上で極めて重要です。従来、それらの収縮性は、特定の状況下での形態学的変化と近くの毛細血管直径の変化を観察することによって測定されていました。しかし、組織固定後の活力の評価と、それに続く画像化された脳周皮細胞の周皮細胞の収縮性が損なわれます。同様に、脳周皮細胞の遺伝的標識は、特にくも膜下出血(SAH)などの神経学的状態において、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別するのに不十分であり、予備調査で脳周皮細胞の死が検証されています。これらの制約を克服するために信頼性の高いプロトコルが考案され、脳切片の機能的および非機能的な脳周皮細胞の両方の蛍光タグ付けが可能になりました。この標識法により、高解像度の共焦点顕微鏡による可視化が可能になり、同時に脳スライスの微小血管系をマーキングすることができます。この革新的なプロトコルは、脳周皮細胞の収縮性、毛細血管径への影響、および周皮皮構造を評価する手段を提供します。SAHの文脈の中で脳周皮細胞の収縮性を調べることで、脳微小循環に対するその影響についての洞察に満ちた理解が得られます。

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

著者スポットライト:げっ歯類におけるくも膜下出血後の周皮細胞のイメージング 

くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

通常の生理学的条件下では、脳周皮細胞は一般に細胞死を経験しません。 図6 はこの現象を示しており、黄色は重要な脳周皮細胞の存在を示しています。脳周皮細胞はPIによる染色を示さず、生存率を示しています。細胞死後も周皮細胞が微小血管系に付着したままであるかどうかをさらに調べるために、SAHラットモデルで方法を採用し、その後のイメージングを実施?...

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予備調査では、くも膜下出血(SAH)が脳周皮細胞の死にを引き起こすことが確認されています。SAH後の周皮細胞の収縮性を評価するには、生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を区別する必要があります。そこで、高分解能共焦点顕微鏡を用いた観察を容易にするために、脳切片で生存可能な脳周皮細胞と非生存脳周皮細胞を同時に標識する手順が開発されました。

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

私たちの研究では、周皮細胞の死亡が有意に増加していることが示されました。したがって、SAH後の病気の馬から開始すると、低生命力寄生虫の数とSAH後の経過時間との間に正の相関関係が示されました。SAHと寄生虫分離技術に従った脳スライス中の重要な脳寄生虫と非重要な脳寄生虫のイメージングは、私の分野の研究を前進させました。現在、寄生虫の死骸と内皮細胞の死骸を完全に区別することは非常に困難です。私たちの研究では、SAH後の寄生虫の収縮依存性アポトーシスを発見しました。私たちは、脳切片の機能的および非機能的な脳寄生虫の両方を同時に蛍光標識することを可能にする、非常に信頼性の高いプロトコルを開発しました。

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

702 ビュー.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. 私たちの研究では、周皮細胞の死亡が有意に増加していることが示されました。したがって、SAH後の病気の馬から開始すると、低生命力寄生虫の数とSAH後の経過時間との間に正の相関関係が示されました。SAHと寄生虫分離技術に従った脳スライス中の重要な脳寄生虫と非重要な脳寄生虫のイメージングは、私の分野の研究を前進させました。現在、寄生虫の死骸と?...

ビデオ: 著者スポットライト:げっ歯類におけるくも膜下出血後の周皮細胞のイメージング 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

神経科学

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

マウスくも膜下出血モデルの誘導と蛍光イメージングのための脳切片作製

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

蛍光イメージングのためのラット脳周皮細胞の標識と染色

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.