原稿の批判的レビューをしてくれたL.Brockmannに感謝します。この研究は、NIH 1R01EB030352およびUL1 TR001873によってサポートされました。

すべての動物処置は、体重20〜25gの6〜8週齢の雌のBALB / cまたはCF57BL / 6マウスを使用して、施設動物管理および使用委員会(コロンビア大学、プロトコルAC-AABQ5551およびAC-AAAZ4470)から承認を得て実施されました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。このプロトコルはマウスT細胞の「活性化後の日数」のまわりで構成され、ウイルスの生産は日-2に始まる。レトロウイルスは、最初の産生後-80°Cで保存することができ、このプロトコルを将来使用するために、0日目にステップ2のT細胞の単離と活性化を開始することができます。
1. レトロウイルスベクターの作製
注:ウイルス産物は、パッケージング遺伝子を2つの別々のプラスミドに分離することにより複製欠陥があり( 材料表を参照)、組換えイベントの可能性や複製能力のあるウイルスの不注意な産生を大幅に低減します。
<ol><li>トランスフェクションの1日前にPhoenix Eco細胞を調製します(2日目の手順)。<ol><li>30 mLの培地(Phoenix Eco培地、表1に詳述)を使用して、15 cmのTC処理プレートまたはT150培養フラスコに約1 x 107細胞を播種します。</li>
		<li>37°Cで一晩インキュベートします。 18〜24時間後、細胞は約70%コンフルエントで均一に分布し、増殖することなく高いウイルス収量を確保する必要があります。 注:最適な結果を得るには、継代の少ない細胞を使用し、ウイルス産生のためにプレーティングする前日に継代します。ルーチン培養中にPhoenix Eco細胞が過剰に増殖しないようにしてください。</li>
	</ol></li>
	<li>リポフェクションおよびエンハンサー試薬、pCL-Eco(Gag/Pol)、およびpMSCV発現プラスミド(pMSCV_PGK_mGFP28z)を含むトランスフェクションミックスを、還元血清培地( 材料表を参照)で調製します(Day -1手順)。 注:コトランスフェクションは、pMSCVとpCL-Ecoの1:1の比率で実施する必要があります。<ol><li>チューブAの調製:トランスフェクション試薬105 μLを15 cmプレートあたり3.75 mLの還元血清培地で希釈し、ボルテックスまたはピペッティングで上下させて完全に混合します。</li>
		<li>チューブBを調製:pMSCV発現プラスミド(21 μg)およびpCL-Eco(21 μg)を90 μLのエンハンサー試薬とともに希釈し、15 cmプレートあたり3.75 mLの還元血清培地に浸します。ピペッティングで上下させてよく混ぜます。 注:複数のウイルス産物を生成する場合は、pCL-Ecoとエンハンサー試薬を含むマスターミックスをセットアップしてください。</li>
		<li>チューブAをチューブBに加え、ピペッティングで十分に混合します。室温で10〜20分間インキュベートすると、総容量は約7.5 mLになります。</li>
		<li>Phoenix Ecoプレートから10 mLの細胞培養培地を慎重に取り出し、プレートを傾けてピペッティングし、滴下してトランスフェクションミックスの全容量を残りの培地に加えます。細胞を37°Cのインキュベーターに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>トランスフェクションの16〜20時間後にトランスフェクションしたPhoenix Eco細胞の培地を交換します(0日目の手順)。<ol><li>水浴またはビーズ浴を使用して、血清およびβ-メルカプトエタノール(2-ME、 材料表を参照)を含まないマウスT細胞培地(mTCMウイルス採取、 表1に記載)を37°Cに予熱します。</li>
		<li>可能であれば真空を使用して、プレートを傾け、ピペットチップを下隅に置いて、Phoenix Eco培地を慎重に取り除きます。細胞を過度に乾燥させないでください。</li>
		<li>加温したmTCMウイルス回収培地を、最も遅い設定で30 mLをピペッティングして、傾斜したプレートの側面に静かに加えます。細胞を37°Cのインキュベーターに戻します。 注:このステップにより、Phoenix Eco細胞がプレートから剥離し、ウイルス力価が低下する可能性があります。あらかじめ温められた培地と穏やかなピペッティングにより、中断を最小限に抑えることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を回収します(1日目の手順)。<ol><li>ウイルス上清を回収し、0.45 μmのPVDFフィルター( 材料表を参照)でろ過して、細胞や破片を除去します。ウイルスを分注して-80°Cで凍結するか、フレッシュウイルスを使用する場合はステップ3の1日目に直接進んでください。</li>
		<li>前述のように、ウイルス力価(形質導入単位/mL)をフローサイトメトリーで決定します9。この手順は省略可能です。<ol><li>レトロネクチン(材料表を参照)でプレコートし、最終容量100 μLのmTCMウイルス採取培地にレトロウイルス上清の3倍段階希釈液をロードした非組織培養(TC)処理96ウェルプレート中で、1 x 10 5活性化マウスT細胞を小規模形質導入することにより、ウイルス力価を測定します。 注:T細胞の単離、活性化、形質導入に関する詳細な手順については、以下のステップ2およびステップ3を参照してください。</li>
			<li>形質導入後4〜5日でCAR表面発現をフローサイトメトリーで決定します。</li>
			<li>式10に従ってウイルス力価を計算します:(N x F x D)/V(Nは形質導入された細胞の数、FはCAR陽性細胞の頻度、Dは希釈係数、Vは形質導入量(mL)で、形質導入単位(TU)/mLを取得します。 注:ウイルス力価は凍結/融解時に低下する可能性があります。したがって、ウイルス力価は、凍結およびその後融解されたウイルスで理想的に決定されます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. マウスT細胞の単離
<ol><li>マウスT細胞を単離して活性化します(0日目の手順)。 注意: これらのステップは、室温(RT)または4°Cで実行でき、無菌環境で実行する必要があります。<ol><li>前述のように 、目的のマウス株(例:Balb/c、C57BL/6)から脾臓を採取し、機械的解離により単一細胞懸濁液を得る。</li>
		<li>滅菌シリンジの裏側を使用して、70〜100μmのセルストレーナーを介して脾臓を50mLのコニカルチューブに押しつぶします。</li>
		<li>シリンジを脇に置いた後、5 mLのT細胞分離バッファー(リン酸緩衝生理食塩水、PBS、2%ウシ胎児血清、FBS)でストレーナーを洗浄します。</li>
		<li>マッシングステップを繰り返し、5 mLのT細胞分離バッファーでストレーナーをもう一度洗浄します。最終容量を T 細胞単離バッファーで 50 mL にします。</li>
		<li>手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、1:20の比率で希釈し、トリパンブルーと1:1で混合することにより、生細胞をカウントします。</li>
		<li>450 x g、4°C(または室温)で10分間遠心分離して細胞をペレット化し、推奨されるT細胞分離キットを使用する場合は、1 x 108/mLで脾細胞を再懸濁します( 材料表を参照)。 注:この段階で脾細胞を40〜70μmのストレーナーで再ひずみし、凝集塊を除去することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>メーカーの指示に従ってネガティブセレクションによりCD3+ T細胞を単離します( 材料表を参照)。磁気分離後、単離液を 15 mL コニカルチューブに移し、最終的な生細胞計数を行います。</li>
	<li>単離したT細胞を450 x g、4°C(または室温)で10分間遠心分離してペレット化し、mTCM活性化培地に1 x 106/mLで再懸濁します(表1)。</li>
	<li>マウス抗CD3/抗CD28モノクローナル抗体被覆磁気ビーズ( 材料表参照)を、25 μL/1 x10 6 T細胞と100 U/mLのIL-2の比率で添加してT細胞を活性化します。</li>
	<li>細胞を37°Cのインキュベーターに入れ、一晩放置します。 注:T細胞のサイズが小さいため、1:10〜1:20の比率で希釈し、血球計算盤を使用して手動でカウントするためにトリパンブルーと1:1で混合することにより、より正確な生T細胞数を達成できます。純度は、細胞を蛍光標識αCD3抗体で染色することにより、フローサイトメトリーによって決定できます。各脾臓は、マウスの年齢と株に応じて、7〜10 x 106 T 細胞を産生します。</li>
</ol>3. マウスT細胞形質導入
<ol><li>形質導入用のプレートを準備します(0日目の手順)。<ol><li>未処理の滅菌24ウェルプレートを0.5 mLのヒトフィブロネクチン形質導入促進剤試薬( 材料表を参照)で滅菌PBSで希釈して最終濃度20〜40 μg/mLにプレコートし、4°Cで一晩保存します。 注:このステップは、未処理の24ウェルプレートを形質導入試薬でコーティングし、室温で2時間インキュベートすることにより、1日目に実行することもできます。</li>
	</ol></li>
	<li>T細胞形質導入を行います(1日目の手順)。<ol><li>形質導入のためにプレコートプレートを準備します。プレコートした 24 ウェルプレートの各ウェルから形質導入試薬を取り出し、等量の滅菌ろ過済み PBS + 2% ウシ血清アルブミン(BSA)(0.5 mL)で室温で 30 分間ブロックします。</li>
		<li>0.5〜1mLのPBSで1回洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ1のニートレトロウイルス0.5〜1 mLを、またはウイルス力価に基づいて希釈したものを、プレコートされた各ウェルに加え、2,000 x g および32°Cで90分間遠心分離します。</li>
	<li>1 mLの活性化T細胞を各ウイルス負荷ウェルに加え、450 x g 、32°Cで10分間遠心分離します。 細胞を37°Cのインキュベーターに一晩戻します。</li>
	<li>形質導入後24時間で、1〜1.5 mLの細胞培養培地を除去し、1〜1.5 mLのmTCM完全および10 ng/mLの組換えヒトIL-7およびIL-15と交換します( 材料表を参照)。細胞を37°Cのインキュベーターに戻します(2日目の手順)。 注: ex vivo 培養中は、48時間ごとに10 ng/mLのサイトカインを培養に添加し、T細胞を1 x 106/mLを超えて希釈しないでください。</li>
	<li>形質導入の48時間後、細胞を形質導入プレートから新しい24ウェルまたは6ウェルプレートに移し、細胞を37°Cのインキュベーターに戻します(3日目の手順)。 注:T細胞の生存率は、開始T細胞の生存率とウイルス力価に応じて、形質導入後24時間から2日に細胞を移植することで改善する可能性があります。</li>
	<li>T細胞を脱ビーズし、CAR発現を確認します(5〜6日目の手順)。<ol><li>細胞を完全に再懸濁して、αCD3/CD28でコーティングされたビーズから活性化T細胞を解離させ( 材料表を参照)、細胞懸濁液を磁石上に30秒間置きます。細胞懸濁液を目的の ex vivo 培養容器に移し、37°Cのインキュベーターに戻します。 注:T細胞は、培養フラスコまたはディープウェル培養プレートで培養できます。6ウェルフォーマットプレートのディープウェルで、ウェルあたり30 mLのmTCM完全培地に最低5 x 106 T細胞を播種することが推奨されます( 材料表を参照)。</li>
		<li>フローサイトメトリーによるCAR発現の決定8. 注:GFP-CARの発現は、100 ng/mLの精製GFPとのインキュベーションにより決定しました。N末端エピトープタグを組み込むことで、代替CARコンストラクトの検出が容易になります。</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T細胞の ex vivo 培養を行います(7〜10日目の手順)。<ol><li>ex vivo培養中は、培地の50%を除去し、48時間ごとに新鮮なmTCMコンプリート+2x 10 ng/mLのIL-7およびIL-15と交換して細胞を維持します。 注:マウスCAR-T細胞は、活性化後7日で下流アプリケーションに使用できる状態になりますが、融解後の生存率が低いため、凍結保存しないでください。</li>
	</ol></li>
</ol>

同系モデルにおけるマウスCAR-T細胞生成のための合理化されたプロトコール

<ol>
	<li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy.">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li><li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies.">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li><li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment.">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li><li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine.">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).</li><li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression.">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li><li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+new+roads+for+cars.">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li><li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade.">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li><li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression.">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).</li><li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus.">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li><li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells.">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299 (2021).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.">Lab Animal Research.</a> Sterile Tissue Harvest. , (2023).</li><li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy.">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li><li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response.">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li><li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers.">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li><li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function.">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li><li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy:+Challenges+and+ways+forward.">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702 (2020).</li><li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy.">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li><li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics.">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li><li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells.">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).</li><li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8++T+lymphocytes.">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li></ol>

利益相反の宣言はありません。

このプロトコルは生体 内の 調査のためのCAR-Tのセルを発生させるためにマウスT細胞のretroviralのtransductionに必要なステップおよび試薬を記述する。レトロウイルスの形質導入条件を最適化することで、超遠心分離や追加の試薬によるウイルス濃縮を必要とせずに、堅牢なCAR発現を実現します。ただし、この手法に適用できる変更は複数あります。
このプロトコル?...

キメラ抗原受容体(CAR)を発現する養子T細胞療法は、適応免疫系の力を利用して抗原陽性がん細胞を特異的に標的化して排除することにより、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました1。B細胞悪性腫瘍を標的とするCAR-T細胞療法の成功は臨床的に検証されていますが、固形腫瘍を標的とする新しいCARの開発には、動物モデルで実施される前臨床試験が依然として不可欠です。しかし、これまでの固形腫瘍の適応症では臨床効果は限定的であり、個々の前臨床モデルでは生体医薬品の薬力学や臨床効果を正確に予測できないことがますます明らかになっています2,3。したがって、研究者らは、CAR-T細胞製品の前臨床試験を拡大し始めており、ヒトおよびマウスがんの異種移植モデルおよび同系モデルにおける並行評価をそれぞれ含めています。
ヒト腫瘍とT細胞を免疫不全マウスに生着させる異種移植モデルとは異なり、同系モデルでは、機能的な免疫系の文脈でCAR-T細胞応答を調べることができます。具体的には、同系腫瘍を有する免疫能力のあるマウスは、養子移植されたT細胞と、腫瘍微小環境(TME)におけるT細胞機能を抑制することが知られている腫瘍関連マクロファージ(TAM)および制御性T細胞(Treg)を含む状況特異的環境との間の相互作用を研究するシステムを提供します4,5,6.さらに、同系モデルは、オンターゲット、オフ腫瘍毒性、およびサイトカイン放出症候群などの追加の毒性につながる可能性のある宿主因子とのCAR-T細胞相互作用を評価するための追加のプラットフォームを提供します7。
これらの利点にもかかわらず、同系CAR-T細胞研究の数は依然として限られています。特に、同系モデルでは、同じマウス株由来のCAR-T細胞の自家工学が必要であり、効率的なマウスT細胞の形質導入とex vivo増殖のための方法論がないため、さらなる課題となっています2,8。このプロトコルはretroviralベクトルおよび最大限に活用されたT細胞のtransductionの生産によって安定したCARの表現を達成する方法を概説する。プロセス全体の概略図を図1に示します。このアプローチの使用は、マウスCAR-T細胞の効率的なレトロウイルス形質導入と、超遠心分離によるウイルス濃度を必要とせずに高いCAR発現を達成することを実証しています。CARコンストラクトの抗原特異性を変化させる戦略は、追加の導入遺伝子の共発現に加えて議論されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filters</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-408-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm TC treated cell culture dishes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>130183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C, 6-8 week old&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-321-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet&#160;</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse T cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex6</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>80240M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-15&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-453-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD4 BV605</td>
			<td>BD</td>
			<td>563151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD44 APC&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD62L PE-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 60-0621-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD8 APC-Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>SKU 25-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2 with Prime 95B camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31-985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Eco cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG.2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV_PGK_GFP28z</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified sfGFP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Produced by R.LV.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (&#39;transduction reagent&#39;)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of murine chimeric antigen receptor (car)-t cells

キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞を用いた改変細胞治療は、血液悪性腫瘍患者に対して目覚ましい効果を発揮し、現在、多様な固形腫瘍の治療のために開発が進められています。これまでのところ、新規CAR-T細胞産物の予備評価は、主に免疫不全マウスを用いた異種移植腫瘍モデルで行われてきた。このアプローチは、実験環境でヒトCAR-T細胞の生着を成功させるために選択されます。しかし、腫瘍とCAR-T細胞が同じマウス株に由来する同系マウスモデルでは、機能的な免疫系と包括的な腫瘍微小環境(TME)の文脈で新しいCAR技術を評価することができます。ここで説明するプロトコルは、レトロウイルス形質導入と ex vivo T細胞培養のための標準化された方法を提示することにより、マウスCAR-T細胞生成のプロセスを合理化することを目的としています。このプロトコルに記載されている方法は、この研究で使用されたもの以外の他のCARコンストラクトに適用して、免疫コンピテントシステムにおける新しいCARテクノロジーのルーチン評価を可能にします。

ここに記述されているプロトコルはマウスCAR-Tのセルの生成のためのマウスT細胞のtransductionのプロセスを標準化することを向ける。 図 1 は、関連する手順の詳細な説明を示しています。このプロセスは、ウイルス成分をPhoenix Eco細胞に同時トランスフェクション することにより、 レトロウイルスベクターを製造することから始まります。 図 2</str...

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著者スポットライト:同系腫瘍モデルにおけるCAR-T細胞機能の増強 

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。

マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

私たちの研究は、固形腫瘍治療のための遺伝子組換え細菌とCAR-T細胞の効果的な組み合わせを探求しています。卵巣がんの同系モデルを用いて、これら2つの細胞療法が完全な免疫系の中でどのように機能するかを研究することは重要です。同系腫瘍モデルにおけるCAR-T細胞の機能の研究は、マウスCAR-T細胞を作製するための標準化されたプロトコルの欠如によって制限されてきました。マウスT細胞は、従来の方法を用いたex vivoでの培養に形質導入することが特に困難です。このプロトコルは、マウスCAR-T細胞の生産を合理化し、新しいCAR技術の活性を評価するための重要なコンテキストを提供する同系モデルでの研究を可能にするために開発されました。

efficient-generation-of-murine-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

2.5K ビュー.  Columbia University. 私たちの研究は、固形腫瘍治療のための遺伝子組換え細菌とCAR-T細胞の効果的な組み合わせを探求しています。卵巣がんの同系モデルを用いて、これら2つの細胞療法が完全な免疫系の中でどのように機能するかを研究することは重要です。同系腫瘍モデルにおけるCAR-T細胞の機能の研究は、マウスCAR-T細胞を作製するための標準化されたプロトコルの欠如によって制限さ?...

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Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

生物工学

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately burdensome to those living in low- and middle-income countries (LMICs), where the majority of deadly exposures to rabies occur. Different drug delivery strategies have been explored to condense vaccine regimens to a single injection by encapsulating antigens into polymeric particles. However, harsh stressors during the encapsulation process can cause denaturation of the encapsulated antigen. This article describes a method for encapsulating the rabies virus (RABV) antigen into polymeric microparticles that exhibit tunable pulsatile release. This method, termed Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), generates microparticles using soft lithography to create inverse polydimethylsiloxane (PDMS) molds from a multi-photon, 3D-printed master mold. Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) films are then compression-molded into the PDMS molds to generate open-faced cylinders that are filled with concentrated RABV using a piezoelectric dispensing robot. These microstructures are then sealed by heating the top of the particles, allowing the material to flow and form a continuous, nonporous polymeric barrier. Post-fabrication, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specific to the detection of intact trimeric rabies virus glycoprotein is used to confirm the high recovery of immunogenic antigen from the microparticles.

This method describes the encapsulation of the rabies antigen into biodegradable polymeric microparticles with structural and material properties that enable pulsatile release after a predetermined delay. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assessment of the antigen retrieved from the particle core confirms the presence of intact trimeric rabies virus glycoprotein through particle fabrication.

狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately ...

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cells. These modified cells have shown remarkable clinical responses in patients with hematologic malignancies. However, the high cost of producing these therapies and conducting extensive quality control assessments has limited their accessibility to a broader range of patients. To address this issue, many academic institutions are exploring the feasibility of in-house manufacturing of genetically modified cells, while adhering to guidelines set by national and international regulatory agencies.
Manufacturing genetically modified T cell products on a large scale presents several challenges, particularly in terms of the institution's production capabilities and the need to meet infusion quantity requirements. One major challenge involves producing large-scale viral vectors under Good Manufacturing Practice (GMP) guidelines, which is often outsourced to external companies. Additionally, simplifying the T cell transduction process can help minimize variability between production batches, reduce costs, and facilitate personnel training. In this study, we outline a streamlined process for lentiviral transduction of primary human T cells with a fluorescent marker as the gene of interest. The entire process adheres to GMP-compliant standards and is implemented within our academic institution.

This protocol outlines the process of transducing primary human T cells with a gene of interest, ensuring compatibility with Good Manufacturing Practice (GMP) standards.

遺伝子改変T細胞の作製のためのGMP準拠手順

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...