輸液後に増殖し、増殖し、柑内尿活性を有する機能能力を有するCAR T細胞産物を脱-lib-er-ating効果的な養子免疫療法の重要な構成要素である。例えば、固形腫瘍では、CAR T細胞は固形腫瘍に浸透し、最適な抗原刺激を受けるが、全体的な生着および増殖は人々に妨げられる。このアプローチの主な利点は、CAR T細胞の品質を保持することができるか、または、最終的に分化または疲れ果てたT細胞を生成することなくCAR T細胞の分化状態を維持することができ、これは、拡散能力を低下させたか、注入後の有効な機能が低下するであろう。
T細胞は細胞濃度や培養した血管の表面積に非常に敏感であるため、この技術は困難な場合があります。彼らの代謝ニーズと同様に。本質的にT細胞は、プロセス全体を通して幸せに保たれる必要があります, そうでなければ、彼らは成長しません.
この手順を開始するには、6ウェルの文化料理を用意します。新鮮なまたは凍結保存された一次ヒトT細胞を、培養皿のウェル内のT細胞当たり3個のビーズの割合で抗CD3 CD28磁気ビーズと混合することによって活性化する。T細胞を通常のヒトAB血清、L-グルタミン、ヘピーおよびIL2を添加したX-Vivo15培地中の培養。
膨張中に1ミリリットル当たり100万個のT細胞の濃度でT細胞を活性化する。そして、20%の酸素、5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度でそれらを培養します。一晩刺激した後、活性化されたT細胞にレンチウイルス上清を加える。
3と5の間の感染の多重度を達成するために必要な上清の量を計算します。同じ条件を使用して細胞を培養し続けます。3日目に、凍結保存の細胞の代表的なアリコートを収集する。
凍結保存の前に、穏やかにピペットと磁気分離によって磁気ビーズを除去します。0.5%DMSOのPBSを含む凍結培地を準備します。そして、使用する準備ができるまで摂氏4度で保管してください。
次に、T細胞をGの300倍で5分間遠心する。上清を捨て、PBSを5ミリリットル加えます。細胞をGの300倍に5分間再び遠心分離し、PBSを捨てる。
冷たい凍結保存培地の1ミリリットルでペラントを吊るします。冷蔵凍結容器内のT細胞を凍結します。そして、48時間マイナス80度で保存します。
この後、凍結した細胞を液体窒素に移します。残りのT細胞をPBSの5ミリリットルに1回洗浄して、残留ベクターを排除します。5分間Gの300倍で遠心分離機。
次いで、PBSをデカントし、1ミリリットル当たり500,000個の細胞の濃度でT細胞培養培地中の細胞ペラントを再懸濁する。T細胞を45と9の2つの培養物に分割する。ヒトCD4およびCD8に対するカウントビーズおよびモノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーによってT細胞をカウントする。
生菌性染料と同様に。1日おきに培養液を再供給し、1ミリリットル当たり500,000個の細胞の濃度で維持する。5日目には、前に述べたように5日目の文化を数え、クライオ保存します。
7日目に、PBSで500,000個の細胞を洗浄します。そして、蛍光活性化細胞選別バッファーの100マイクロリットルでそれらを再中断します。次に、フローサイトメトリーにより蛍光コンジュ化抗CAR19イディオ型で免疫染色によりCAR表面タンパク質発現を検出する。
9日目には、前述のように9日目の文化をカウントしてクライオ保存します。本研究では、X-Vivo培養中に様々な間隔で収穫されるCAR T細胞の機能および有効性を測定する。このビデオで説明した方法を使用して、T細胞は刺激され、3日または9日間拡張されます。
ここで示す格言戦略で示される細胞分化プロファイルは、細胞表面に発現する別個の糖タンパク質の存在量を測定することによって分析される。エフェクター分化への漸進的なシフトは、X-Vivo培養中に時間の経過とともに見られる。抗原に応答したCAR T細胞のエフェクター機能および増殖能力を評価する。
より少なく拡大される細胞は、より長い期間にわたって広範囲に培養されるものよりも機能的に優れている。ヒト異種移植マウスモデルでは、異なる期間に収穫されたCAR T細胞の効力が比較される。9日間の細胞は、300万の高用量の価値がある完全な応答と500,000の低用量の有効性の喪失を有する用量依存性抗lukemic応答を示す。
しかし、3日目の細胞は、高用量と低用量の両方で持続的な腫瘍対照を示した。この応答は、マウスの末梢血におけるCAR−T19の絶対数と関連している。全体として、これらの結果は、CAR T細胞が以前に収穫され、後で収穫されたものを上回る証拠を提供する。
この手順に従って、タツノオトシゴアッセイなどの追加機能アッセイを行い、酸素消費量またはスピルイットの容量などの代謝特性を測定することができる。CAR T細胞の分化と持続性に関する洞察を提供するために、再刺激のいくつかのラウンドを行うこともできます。この研究を基礎として、私たちや他の研究者は、培養プロセスをさらに短縮する研究に従事しています。
また、他の癌抗原のコアアプローチ設計で拡張することができます。レンチウイルスを扱うときは、常に注意が必要です。しかし、レンチウイルスが複製無能であると設計されている場合でも。
