この研究は、中国国家自然科学基金会(32370135)、中国農業科学院のイノベーションプログラム(CAAS-CSAL-202302)、江蘇省農林職業学院科学技術プロジェクト(2021kj29)から資金提供を受けました。

1.無菌水耕栽培A.thaliana栽培
<ol><li>A. thalianaの苗を準備します。<ol><li>2%(wt/vol)のスクロースと0.9%(wt/vol)の寒天を含む1/2MS培地(MurashigeおよびSkoog)からなる培養 A.thaliana 苗培地を調製します。</li>
		<li>調製した滅菌培地を滅菌正方形のペトリ皿(13 cm x 13 cm)に注ぎ、固化させます。湿度を保つために風乾は避けてください。</li>
		<li> A. thalianaの種子を、1 mLの滅菌水で満たした2 mLの微量遠心チューブに4°Cで12時間以上浸漬し、次いで種子を1 mLの2%(vol/vol)NaClOで2分間滅菌します。</li>
		<li>種子を滅菌水で6回完全に洗浄し、NaClO溶液を除去します。滅菌チップ1mLのMS寒天培地でペトリ皿に種をまきます。</li>
		<li>通気性のある医療用テープでシャーレを密封し、軽いインキュベーターに垂直に置いて1週間成長させます。ライトインキュベーターの昼夜比を16時間/ 8時間に設定し、温度を23°C、湿度を40%〜60%に保ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>A.thalianaを移植します。<ol><li>孔径40 μmの細胞染色剤に5 mmの穴を開け、滅菌します。</li>
		<li>生後7日齢の A. thaliana 植物3本を細胞ストレーナーの穴に移植し、0.5%スクロースを含む3mLの滅菌液体1/2MS培地を含む6ウェルプレートに入れます。</li>
		<li>6ウェルプレートを軽いインキュベーター(図1A)に入れ、10日間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
</ol>2.細菌の培養と接種
<ol><li>接種用の細菌懸濁液を準備します。<ol><li>Bacillus velezensisの場合、細菌細胞を滅菌LB培地に接種し、OD600が0.8〜1.2になるまで170rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。</li>
		<li>6000 x g で2分間遠心分離して細菌細胞を回収し、PBSバッファー(2 mM KH2PO4、8 mM Na2HPO4、136 mM NaCl、2.6 mM KCl)に再懸濁します。遠心分離と再懸濁のステップを3回繰り返して、LB培地と細菌代謝物を除去します。</li>
		<li>細菌細胞を新鮮な1/2 MS培地に最終濃度OD600 0.01で懸濁します。 A. thaliana の苗を育てる6ウェルプレートにバクテリア懸濁液を接種し、6ウェルプレートをライトインキュベーターに入れ、2日間培養します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 根に定着した細菌の測定
<ol><li>根組織を採取し、コロニーを形成した細胞をプレートします。 注:すべてのステップは、ノトバイオティクス条件下で実行する必要があります<ol><li>2 mLチューブの重量を量り、重量をW0として記録します。</li>
		<li>共培養した A.thaliana 根組織を収穫し、滅菌水で3回洗浄します。根を濾紙の上に置き、余分な水分を取り除きます。</li>
		<li>計量した微量遠心チューブに根を入れ、チューブと一緒に根を計量し、W1として記録します。</li>
		<li>各チューブに1mLのPBSを加え、チューブを最大速度で8分間ボルテックスします。</li>
		<li>回収した根コロニー形成細菌細胞で懸濁液を1 x 10-1-1 x 10-4に希釈します(細菌のコロニー形成能力に応じて)。希釈した細菌懸濁液をLB寒天培地を含むプレートに広げ、37°Cで10時間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>コロニーをカウントし、データを正規化します。<ol><li>LBプレート上の細菌コロニーを数えます。</li>
		<li>対応する希釈率に従ってCFUを計算し、ルートフレッシュ重量(W1-W 0)でデータを正規化します。最終結果は、接種後2日目の根のグラム当たりのコロニー形成された細菌細胞の数を示しています(図1B)。</li>
	</ol></li>
</ol>

シロイヌナズナにおける根圏細菌コロニー形成の検出

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

著者は、この記事の内容と利益相反がないことを宣言します。

良好な再現性を達成するために、このプロトコルのコロニー形成検出プロセスには4つの重要なステップがあります。まず、各実験で接種した細菌細胞の数がまったく同じになるようにする必要があります。第二に、コロニー化されていない細菌の洗浄強度を滅菌水で制御することも必要です。第三に、マイクロ遠心チューブに沈みやすいバクテリアの特性による吸収誤差を避けるために、サ...

単一の細菌株による根圏のコロニー形成を検出するための定量的および定性的な方法があります。定性的方法には、蛍光を構成的に発現する株を使用し、蛍光分布と強度を蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点装置1,2で調べる必要があります。これらの戦略は、in situ3 で細菌のコロニー形成をよく反映できますが、定量化における従来のプレート計数方法ほど正確ではありません。また、顕微鏡下では部分的な根域しか表示できないという制限があるため、主観的な偏見の影響を受けることがあります。
ここでは、コロニーを形成した細菌細胞を収集し、プレート上の細菌CFUをカウントすることを含む定量的方法について説明します。この方法は、植物の根から取り除かれたコロニー化された株を数えることができ、根上のコロニー化された細菌の総数を計算することができる希釈とプレーティングに基づいています4,5。
まず、 A. thaliana を水耕栽培条件で培養し、次いで細菌細胞を根圏に最終濃度0.01OD600で接種した。感染した根組織は、接種後2日で採取され、滅菌水で洗浄されて、コロニー化されていない細菌細胞を除去した。さらに、根にコロニーを形成した細菌細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で希釈し、Luria-Bertani(LB)寒天培地に播種しました。37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントして標準化し、根にコロニーを形成した細菌細胞を決定しました。
この方法は、適用性が高く、再現性が高く、根圏細菌のコロニー形成を正確に測定するのに適しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

シロイヌナズナの根の細菌のコロニー形成を測定することは、植物と微生物の相互作用研究において最も頻繁な実験の1つです。根圏における細菌のコロニー形成を測定するための標準化された方法は、再現性を向上させるために必要です。まず、無菌のA.thalianaを水耕栽培状態で培養し、根圏の細菌細胞を最終濃度OD60000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000接種後2日目に、根組織を採取し、滅菌水で3回洗浄して、コロニーを形成していない細菌細胞を除去しました。次に、根の重量を量り、根にコロニーを形成した細菌細胞を渦によって収集しました。細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液でグラジエントで希釈した後、Luria-Bertani(LB)寒天培地にプレーティングしました。プレートを37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントし、根にコロニーを形成した細菌細胞を示すために正規化しました。この方法は、単相互作用条件で根圏内の細菌のコロニー形成を良好な再現性で検出するために使用されます。

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

著者スポットライト:微生物肥料効率を改善するための植物根の根茎形成の強化

水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

この方法で検出される細菌の定着能の精度を調べるために、Bacillus velezensis SQR9 WTと誘導型変異体Δ8mcpを別々にA. thaliana根圏に接種した。Δ8mcpは、化学受容器をコードする遺伝子をすべて欠いた変異体であり、コロニー形成が著しく減少しています6。我々は、本根コロニー形成アッセイにより、接種後2日目のコロニー形成を測定した。その結...

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根圏における植物成長促進根圏細菌(PGPR)のコロニー形成は、その成長促進効果に不可欠です。細菌の根圏コロニー形成の検出方法を標準化する必要があります。ここでは、根の表面での細菌のコロニー形成を定量化するための再現性のある方法について説明します。

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

私たちの研究は、有益な根圏細菌と植物の根との相互作用に焦点を当てています。私たちは、有益なバクテリアのコロニー形成を促進し、畑の微生物肥料の効率と安定性を向上させるための重要なメカニズムを探しています。植物の根の細菌のコロニー形成の方法は広く研究されてきましたが、まだ問題があります。例えば、異なる部位のコロニー形成を明確に測定することは困難ですが、将来的には顕微鏡やハイスループットカウンティングを応用することで、問題の解決に役立つと考えています。当社のプロトコルは、再現性が高く、正確な根圏細菌のコロニー形成測定に適しています。

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Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

417 ビュー.  Chinese Academy of Agricultural Sciences. 私たちの研究は、有益な根圏細菌と植物の根との相互作用に焦点を当てています。私たちは、有益なバクテリアのコロニー形成を促進し、畑の微生物肥料の効率と安定性を向上させるための重要なメカニズムを探しています。植物の根の細菌のコロニー形成の方法は広く研究されてきましたが、まだ問題があります。例えば、異なる部位のコロニー形成を明確に測?...