Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32370135), dem Innovationsprogramm der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS-CSAL-202302) und dem Wissenschafts- und Technologieprojekt des Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29) finanziert.

1. Steriler hydroponischer Anbau von A. thaliana
<ol><li>Bereiten Sie A . thaliana-Sämlinge vor.<ol><li>Bereiten Sie Kulturmedium für A. thaliana vor, das aus 1/2 MS-Medium (Murashige und Skoog) mit 2 % (wt/vol) Saccharose und 0,9 % (wt/vol) Agar besteht.</li>
		<li>Gießen Sie das vorbereitete Sterilisationsmedium vor dem Erstarren in sterile quadratische Petrischalen (13 cm x 13 cm). Vermeiden Sie das Austrocknen an der Luft, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Tauchen Sie die Samen von A. thaliana für mehr als 12 Stunden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 1 mL sterilem Wasser bei 4 °C gefüllt ist, und sterilisieren Sie die Samen dann 2 Minuten lang mit 1 mL 2 % (vol/vol) NaClO.</li>
		<li>Waschen Sie die Samen sechsmal gründlich mit sterilem Wasser, um die NaClO-Lösung zu entfernen. Säen Sie die Samen auf Petrischalen mit MS-Agar-Medium mit einer sterilen 1-ml-Spitze.</li>
		<li>Verschließen Sie die Petrischalen mit atmungsaktivem medizinischem Klebeband und legen Sie sie vertikal in einen leichten Inkubator, um sie 1 Woche lang zu züchten. Stellen Sie das Tag-/Nachtverhältnis des Lichtinkubators auf 16 h/8 h ein, halten Sie die Temperatur auf 23 °C und die Luftfeuchtigkeit auf 40%-60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Transplantation von A. thaliana.<ol><li>Schneiden Sie 5 mm Löcher in einen 40 μm porengroßen Zellfärber und sterilisieren Sie sie.</li>
		<li>Transplantieren Sie drei 7 Tage alte A. thaliana-Pflanzen durch die Löcher eines Zellsiebs und geben Sie sie in eine 6-Well-Platte mit 3 ml sterilem flüssigem 1/2 MS-Medium mit 0,5 % Saccharose.</li>
		<li>Legen Sie die 6-Well-Platten in einen Lichtinkubator (Abbildung 1A) und inkubieren Sie sie 10 Tage lang.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bakterienkultivierung und Inokulation
<ol><li>Bereiten Sie die Bakteriensuspension für die Inokulation vor.<ol><li>Bei Bacillus velezensis werden die Bakterienzellen in steriles LB-Medium inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inkubiert, bis es einen OD600 von 0,8-1,2 erreicht.</li>
		<li>Sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 6000 x g für 2 min und resuspendieren Sie die Zellen in PBS-Puffer (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Resuspendierungsschritte 3 Mal, um das LB-Medium und die bakteriellen Metaboliten zu entfernen.</li>
		<li>Die Bakterienzellen werden in einem frischen 1/2 MS-Medium bei einer Endkonzentration von OD600 0,01 suspendiert. Impfen Sie die Bakteriensuspensionen auf die 6-Well-Platten, auf denen A . thaliana-Sämlinge wachsen, legen Sie die 6-Well-Platten in den Lichtinkubator und kultivieren Sie sie 2 Tage lang.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Messung von Bakterien, die sich auf Wurzeln ansiedeln
<ol><li>Ernten Sie das Wurzelgewebe und plattieren Sie die besiedelten Zellen. HINWEIS: Alle Schritte sollten unter gnotobiotischen Bedingungen durchgeführt werden<ol><li>Wiegen Sie die 2 mL Röhrchen und notieren Sie das Gewicht mit W0.</li>
		<li>Ernten Sie die co-kultivierten A. thaliana-Wurzelgewebe und waschen Sie sie 3 Mal in sterilem Wasser. Legen Sie die Wurzel auf Filterpapier, um das überschüssige Wasser zu entfernen.</li>
		<li>Geben Sie die Wurzel in das gewogene Mikrozentrifugenröhrchen, wiegen Sie die Wurzeln zusammen mit dem Röhrchen und notieren Sie es als W1.</li>
		<li>Geben Sie 1 mL PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen 8 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit durch.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Suspensionen mit den gesammelten wurzelbesiedelten Bakterienzellen auf 1 x 10-1-1 x 10-4 (je nach Besiedlungsfähigkeit der Bakterien). Die verdünnten Bakteriensuspensionen auf Platten mit LB-Agarmedium verteilen und 10 h bei 37 °C inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Zählen Sie die Kolonien und normalisieren Sie die Daten.<ol><li>Zählen Sie die Bakterienkolonien auf LB-Platten.</li>
		<li>Berechnen Sie die KBE entsprechend der entsprechenden Verdünnung und normalisieren Sie die Daten mit dem Wurzelfrischgewicht (W1-W 0). Die Endergebnisse zeigen die Anzahl der besiedelten Bakterienzellen pro Gramm Wurzel 2 Tage nach der Inokulation (Abbildung 1B).</li>
	</ol></li>
</ol>

Nachweis der Rhizobakterienbesiedlung auf Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit den Inhalten dieses Artikels haben.

Um eine gute Reproduzierbarkeit zu erreichen, gibt es vier kritische Schritte für den Besiedlungsnachweis dieses Protokolls. Zunächst muss sichergestellt werden, dass die Anzahl der geimpften Bakterienzellen in jedem Experiment genau gleich ist. Zweitens ist es auch notwendig, die Reinigungsintensität der unbesiedelten Bakterien mit sterilem Wasser zu kontrollieren. Drittens muss jeder Probenverdünnungsprozess vor der Durchführung vortexiert werden, damit sich die Probe in einem vollständigen Mischzustand befindet,...

Es gibt quantitative und qualitative Methoden, um die Rhizosphärenbesiedlung durch einen einzelnen Bakterienstamm nachzuweisen. Für die qualitative Methode sollte ein Stamm verwendet werden, der konstitutiv Fluoreszenz exprimiert, und die Fluoreszenzverteilung und -intensität sollte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokalen Laserinstrumenten untersucht werden 1,2. Diese Strategien können die bakterielle Besiedlung in situ3 gut widerspiegeln, aber sie sind bei der Quantifizierung nicht so genau wie herkömmliche Plattenzählmethoden. Aufgrund der Einschränkung, nur partielle Wurzelzonen unter dem Mikroskop anzuzeigen, kann dies manchmal durch subjektive Verzerrungen beeinflusst werden.
Hier beschreiben wir eine quantitative Methode, die das Sammeln der besiedelten Bakterienzellen und das Zählen der bakteriellen KBE auf einer Platte beinhaltet. Dieses Verfahren basiert auf einer Verdünnung und Plattierung, bei der die besiedelten Stämme, die von den Pflanzenwurzeln abgestreift wurden, gezählt und die Gesamtzahl der besiedelten Bakterien auf der Wurzel berechnet werdenkann 4,5.
Zuerst wurde A. thaliana unter hydroponischen Bedingungen kultiviert, und dann wurden Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von 0,01 OD600 inokuliert. Das infizierte Wurzelgewebe wurde 2 Tage nach der Inokulation entnommen und in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Des Weiteren wurden Bakterienzellen, die an der Wurzel besiedelt waren, gesammelt, in phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und auf ein Luria-Bertani (LB) Agarmedium aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 10 h wurden einzelne Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die auf den Wurzeln besiedelten Bakterienzellen zu bestimmen.
Diese Methode ist sehr gut anwendbar, hat eine gute Wiederholbarkeit und eignet sich besser für die genaue Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Rhizosphäre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

Die Messung der bakteriellen Besiedlung der Arabidopsis thaliana-Wurzel ist eines der häufigsten Experimente in Studien zur Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, ist eine standardisierte Methode zur Messung der bakteriellen Besiedlung in der Rhizosphäre notwendig. Wir kultivierten zunächst steriles A.thaliana unter hydroponischen Bedingungen und inokulierten dann die Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von OD600 von 0,01. 2 Tage nach der Inokulation wurde das Wurzelgewebe entnommen und dreimal in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Anschließend wurden die Wurzeln gewogen und die an der Wurzel besiedelten Bakterienzellen durch einen Wirbel gesammelt. Die Zellsuspension wurde in einem Gradienten mit einem phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und anschließend auf ein Luria-Bertani (LB)-Agarmedium aufgebracht. Die Platten wurden 10 h lang bei 37 °C inkubiert, und dann wurden die einzelnen Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die Bakterienzellen anzuzeigen, die auf den Wurzeln besiedelt waren. Diese Methode wird verwendet, um bakterielle Besiedlung in der Rhizosphäre unter Monointeraktionsbedingungen mit guter Reproduzierbarkeit nachzuweisen.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Rhizobakterienbesiedlung an Pflanzenwurzeln für eine verbesserte mikrobielle Düngemitteleffizienz

Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

Um die Genauigkeit der mit dieser Methode nachgewiesenen Besiedlungsfähigkeit der Bakterien in der Rhizosphäre von A. thaliana zu testen, inokulierten wir Bacillus velezensis SQR9 WT und eine abgeleitete Mutante Δ8mcp separat in die Rhizosphäre von A. thaliana . Das Δ8mcp ist eine Mutante, der alle Chemorezeptor-kodierenden Gene fehlen und die eine signifikant verringerte Besiedlung aufweist6. Wir haben ihre Besiedlung 2 Tage nach der Inokulation m...

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Die Besiedlung mit pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) in der Rhizosphäre ist essentiell für ihre wachstumsfördernde Wirkung. Es ist notwendig, die Methode zum Nachweis der bakteriellen Rhizosphärenbesiedlung zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Wurzeloberfläche.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Interaktion von nützlichen Rhizobakterien mit Pflanzenwurzeln. Wir suchen nach den Schlüsselmechanismen, um die Besiedlung von nützlichen Bakterien zu verbessern und so die Effizienz und Stabilität von mikrobiellen Düngemitteln auf dem Feld zu verbessern. Die Methoden zur bakteriellen Besiedlung von Pflanzenwurzeln wurden ausgiebig untersucht, aber es gibt immer noch Probleme.Zum Beispiel ist es schwierig, die Besiedlung an verschiedenen Stellen unterschiedlich zu messen. Wir glauben, dass der Einsatz von Mikroskopen und Hochdurchsatzzählungen in Zukunft helfen wird, die Probleme zu lösen. Unser Protokoll ist sehr gut anwendbar mit guter Wiederholbarkeit und eignet sich besser für die genaue Bestimmung der Besiedlung von Rhizosphärenbakterien.

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Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

413 Aufrufe.  Chinese Academy of Agricultural Sciences. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Interaktion von nützlichen Rhizobakterien mit Pflanzenwurzeln. Wir suchen nach den Schlüsselmechanismen, um die Besiedlung von nützlichen Bakterien zu verbessern und so die Effizienz und Stabilität von mikrobiellen Düngemitteln auf dem Feld zu verbessern. Die Methoden zur bakteriellen Besiedlung von Pflanzenwurzeln wurden ausgiebig untersucht, aber es gibt immer noch Probleme.Zum Beispiel ist es schwierig, die Besiedlung an verschiedenen ...