Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (32370135), dal Programma di innovazione dell'Accademia cinese delle scienze agricole (CAAS-CSAL-202302), dal Progetto scientifico e tecnologico del Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).

1. Coltivazione idroponica sterile di A. thaliana
<ol><li>Prepara le piantine di A. thaliana .<ol><li>Preparare il terreno di coltura delle piantine di A. thaliana , che consiste in 1/2 terreno MS (Murashige e Skoog) con il 2% (wt/vol) di saccarosio e lo 0,9% (wt/vol) di agar.</li>
		<li>Versare il terreno di sterilizzazione preparato in piastre di Petri quadrate sterili (13 cm x 13 cm) prima della solidificazione. Evitare l'asciugatura all'aria per mantenere l'umidità.</li>
		<li>Immergere i semi di A. thaliana in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con 1 ml di acqua sterile a 4 °C per oltre 12 ore, quindi sterilizzare i semi con 1 ml di NaClO al 2% (vol/vol) per 2 minuti.</li>
		<li>Lavare accuratamente i semi con acqua sterile sei volte per rimuovere la soluzione di NaClO. Semina i semi su piastre di Petri con terreno di coltura MS agar con punta sterile da 1 ml.</li>
		<li>Sigilla le piastre di Petri con nastro medico traspirante e mettile verticalmente in un'incubatrice leggera per crescere per 1 settimana. Impostare il rapporto giorno/notte dell'incubatrice luminosa a 16 h/8 h, mantenere la temperatura a 23 °C e l'umidità al 40%-60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Trapiantare A. thaliana.<ol><li>Tagliare fori da 5 mm su un coloratore per cellule con pori da 40 μm e sterilizzarli.</li>
		<li>Trapiantare tre piante di A. thaliana di 7 giorni attraverso i fori di un colino cellulare e metterle in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 ml di terreno liquido sterile 1/2 MS con saccarosio allo 0,5%.</li>
		<li>Posizionare le piastre a 6 pozzetti in un'incubatrice leggera (Figura 1A) e incubare per 10 giorni.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coltivazione e inoculazione di batteri
<ol><li>Preparare la sospensione batterica per l'inoculazione.<ol><li>Per il Bacillus velezensis, inoculare le cellule batteriche in terreno LB sterile e incubare a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere OD600 di 0,8-1,2.</li>
		<li>Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 6000 x g per 2 min e risospendere le cellule in tampone PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione 3 volte per rimuovere il terreno LB e i metaboliti batterici.</li>
		<li>Sospendere le cellule batteriche in un terreno fresco di 1/2 MS ad una concentrazione finale di OD600 0,01. Inoculare le sospensioni batteriche nelle piastre a 6 pozzetti che coltivano piantine di A. thaliana , posizionare le piastre a 6 pozzetti nell'incubatrice leggera e coltivarle per 2 giorni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Misurazione dei batteri colonizzati sulle radici
<ol><li>Raccogliere il tessuto radicale e placcare le cellule colonizzate. NOTA: Tutti i passaggi devono essere condotti in condizioni gnotobiotiche<ol><li>Pesare le provette da 2 ml e registrare il peso come W0.</li>
		<li>Raccogliere i tessuti radicali di A. thaliana co-coltivati e lavarli in acqua sterile 3 volte. Metti la radice su carta da filtro per rimuovere l'acqua in eccesso.</li>
		<li>Mettere la radice nella provetta da microcentrifuga pesata, pesare le radici insieme alla provetta e registrarla come W1.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS a ciascuna provetta e far vorticare le provette per 8 minuti alla massima velocità.</li>
		<li>Diluire le sospensioni con le cellule batteriche colonizzate dalle radici raccolte a 1 x 10-1-1 x 10-4 (in base alla capacità di colonizzazione batterica). Stendere le sospensioni batteriche diluite su piastre contenenti terreno di agar LB e incubare a 37 °C per 10 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Contare le colonie e normalizzare i dati.<ol><li>Contare le colonie batteriche sulle piastre LB.</li>
		<li>Calcolare i CFU in base alla diluizione corrispondente e normalizzare i dati con peso fresco radicale (W1-W 0). I risultati finali indicano il conteggio delle cellule batteriche colonizzate per grammo di radice a 2 giorni dall'inoculazione (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
</ol>

Rilevamento della colonizzazione rizobatterica su Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.

Per ottenere una buona riproducibilità, ci sono quattro passaggi critici per il processo di rilevamento della colonizzazione di questo protocollo. In primo luogo, è necessario assicurarsi che il numero di cellule batteriche inoculate sia esattamente lo stesso in ogni esperimento. In secondo luogo, è necessario anche controllare l'intensità di pulizia dei batteri non colonizzati con acqua sterile. In terzo luogo, ogni processo di diluizione del campione deve essere agitato prima di essere eseguito per lasciare che il ...

Esistono metodi quantitativi e qualitativi per rilevare la colonizzazione della rizosfera da parte di un singolo ceppo batterico. Per il metodo qualitativo, dovrebbe essere utilizzato un ceppo che esprime costitutivamente la fluorescenza e la distribuzione e l'intensità della fluorescenza dovrebbero essere esaminate al microscopio a fluorescenza o con strumenti confocali laser 1,2. Queste strategie possono riflettere bene la colonizzazione batterica in situ3, ma non sono accurate come i metodi tradizionali di conteggio su piastra nella quantificazione. Inoltre, a causa della limitazione di visualizzare solo zone radicali parziali al microscopio, a volte può essere influenzato da pregiudizi soggettivi.
Qui descriviamo un metodo quantitativo, che include la raccolta delle cellule batteriche colonizzate e il conteggio delle CFU batteriche su una piastra. Questo metodo si basa sulla diluizione e sulla placcatura mediante la quale è possibile contare i ceppi colonizzati che sono stati strappati dalle radici delle piante e calcolare il numero totale di batteri colonizzati sulla radice 4,5.
In primo luogo, A. thaliana è stata coltivata in condizioni idroponiche, quindi le cellule batteriche sono state inoculate nella rizosfera a una concentrazione finale di 0,01 OD600. I tessuti radicali infetti sono stati raccolti 2 giorni dopo l'inoculazione e lavati in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Inoltre, le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte, diluite in tampone salino tamponato con fosfato (PBS) e piastrate su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Dopo l'incubazione a 37 °C per 10 ore, le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per determinare le cellule batteriche colonizzate sulle radici.
Questo metodo è altamente applicabile, ha una buona ripetibilità ed è più adatto per un'accurata determinazione della colonizzazione batterica della rizosfera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

La misurazione della colonizzazione batterica sulla radice di Arabidopsis thaliana è uno degli esperimenti più frequenti negli studi di interazione pianta-microbi. Un metodo standardizzato per misurare la colonizzazione batterica nella rizosfera è necessario per migliorare la riproducibilità. Abbiamo prima coltivato A.thaliana sterile in condizioni idroponiche e poi abbiamo inoculato le cellule batteriche nella rizosfera a una concentrazione finale di OD600 di 0,01. A 2 giorni dall'inoculazione, il tessuto radicale è stato raccolto e lavato tre volte in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Le radici sono state quindi pesate e le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte a vortice. La sospensione cellulare è stata diluita in un gradiente con un tampone salino tamponato con fosfato (PBS), seguito da una placcatura su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Le piastre sono state incubate a 37 °C per 10 ore, quindi le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per indicare le cellule batteriche colonizzate sulle radici. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la colonizzazione batterica nella rizosfera in condizioni di mono-interazione, con una buona riproducibilità.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Autore in primo piano: Migliorare la colonizzazione dei rizobatteri sulle radici delle piante per migliorare l'efficienza dei fertilizzanti microbici

Misurazione della colonizzazione batterica sulle radici di Arabidopsis thaliana in condizioni idroponiche

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

Per testare l'accuratezza della capacità di colonizzazione batterica rilevata con questo metodo nella rizosfera di A. thaliana, abbiamo inoculato separatamente Bacillus velezensis SQR9 WT e un mutante derivato Δ8mcp nella rizosfera di A. thaliana . Il Δ8mcp è un mutante che manca di tutti i geni codificanti i chemocettori e ha una colonizzazione significativamente ridotta6. Abbiamo misurato la loro colonizzazione a 2 giorni dopo l'inoculazione con l...

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La colonizzazione dei rizobatteri che promuovono la crescita delle piante (PGPR) nella rizosfera è essenziale per il suo effetto di promozione della crescita. È necessario standardizzare il metodo di rilevamento della colonizzazione batterica della rizosfera. Qui descriviamo un metodo riproducibile per quantificare la colonizzazione batterica sulla superficie della radice.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

La nostra ricerca si concentra sull'interazione dei rizobatteri benefici con le radici delle piante. Stiamo cercando i meccanismi chiave per migliorare la colonizzazione dei batteri benefici, migliorando così l'efficienza e la stabilità dei fertilizzanti microbici in campo. I metodi per la colonizzazione batterica delle radici delle piante sono stati ampiamente studiati, ma ci sono ancora problemi.Ad esempio, è difficile misurare la colonizzazione in siti diversi in modo distintivo, in futuro pensiamo che l'applicazione del microscopio e del conteggio ad alta produttività aiuterà a risolvere i problemi. Il nostro protocollo è altamente applicabile con una buona ripetibilità ed è più adatto per un'accurata determinazione della colonizzazione batterica della rizosfera.

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Research

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Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

411 Views.  Chinese Academy of Agricultural Sciences. La nostra ricerca si concentra sull'interazione dei rizobatteri benefici con le radici delle piante. Stiamo cercando i meccanismi chiave per migliorare la colonizzazione dei batteri benefici, migliorando così l'efficienza e la stabilità dei fertilizzanti microbici in campo. I metodi per la colonizzazione batterica delle radici delle piante sono stati ampiamente studiati, ma ci sono ancora problemi.Ad esempio, è difficile misurare la colonizzazione in siti diversi in modo distintivo,...

Video: Autore in primo piano: Migliorare la colonizzazione dei rizobatteri sulle radici delle piante per migliorare l'efficienza dei fertilizzanti microbici