Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32370135), Çin Tarım Bilimleri Akademisi İnovasyon Programı (CAAS-CSAL-202302), Jiangsu Tarım ve Ormancılık Meslek Yüksekokulu Bilim ve Teknoloji Projesi (2021kj29) tarafından finanse edilmiştir.

1. Steril hidroponik A. thaliana yetiştiriciliği
<ol><li>A. thaliana fidelerini hazırlayın.<ol><li>% 2 (ağırlıkça / hacim) sükroz ve% 0.9 (ağırlıkça / hacim) agar ile 1/2 MS ortamdan (Murashige ve Skoog) oluşan kültür A. thaliana fidanları ortamını hazırlayın.</li>
		<li>Hazırlanan sterilizasyon ortamını katılaşmadan önce steril kare Petri kaplarına (13 cm x 13 cm) dökün. Nemi korumak için havayla kurutmaktan kaçının.</li>
		<li> A. thaliana tohumlarını 1 mL steril su ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 4 ° C'de 12 saatten fazla daldırın ve ardından tohumları 1 mL% 2 (hacim / hacim) NaClO ile 2 dakika sterilize edin.</li>
		<li>NaClO çözeltisini çıkarmak için tohumları altı kez steril suyla iyice yıkayın. Tohumları, steril 1 mL uçlu MS agar ortamı ile Petri kaplarına ekin.</li>
		<li>Petri kaplarını nefes alabilen tıbbi bantla kapatın ve 1 hafta boyunca büyümeleri için hafif bir inkübatöre dikey olarak yerleştirin. Işık inkübatörünün gündüz/gece oranını 16 saat/8 saate ayarlayın, sıcaklığı 23 °C'de ve nemi %40-%60'ta tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Nakil A. thaliana.<ol><li>40 μm gözenek büyüklüğünde hücre boyayıcı üzerine 5 mm'lik delikler açın ve steril hale getirin.</li>
		<li>7 günlük üç A. thaliana bitkisini bir hücre süzgecinin deliklerinden nakledin ve bunları% 0.5 sükroz içeren 3 mL steril sıvı 1/2 MS ortamı içeren 6 oyuklu bir plakaya koyun.</li>
		<li>6 oyuklu plakaları hafif bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A) ve 10 gün boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bakteri yetiştirme ve aşılama
<ol><li>Aşılama için bakteri süspansiyonu hazırlayın.<ol><li>Bacillus velezensis için, bakteri hücrelerini steril LB ortamına aşılayın ve 37 ° C'de, 0.8-1.2 OD600'e ulaşana kadar 170 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.</li>
		<li>Bakteri hücrelerini 2 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri PBS tamponunda (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2.6 mM KCl) yeniden süspanse edin. LB ortamını ve bakteriyel metabolitleri çıkarmak için santrifüjleme ve yeniden süspanse etme adımlarını 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Bakteri hücrelerini, OD600 0.01'in nihai konsantrasyonunda taze 1/2 MS ortamında askıya alın. Bakteri süspansiyonlarını A. thaliana fidelerini yetiştiren 6 oyuklu plakalara aşılayın, 6 oyuklu plakaları ışık inkübatöre yerleştirin ve 2 gün boyunca yetiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Köklerde kolonize olan bakterilerin ölçülmesi
<ol><li>Kök dokusunu toplayın ve kolonize hücreleri plakalayın. NOT: Tüm adımlar gnotobiyotik koşullar altında yapılmalıdır<ol><li>2 mL'lik tüpleri tartın ve ağırlığı W0 olarak kaydedin.</li>
		<li>Birlikte kültürlenmiş A. thaliana kök dokularını hasat edin ve 3 kez steril suda yıkayın. Fazla suyu çıkarmak için kökü filtre kağıdına yerleştirin.</li>
		<li>Kökü tartılmış mikrosantrifüj tüpüne koyun, kökleri tüp ile birlikte tartın ve W1 olarak kaydedin.</li>
		<li>Her tüpe 1 mL PBS ekleyin ve tüpleri maksimum hızda 8 dakika boyunca girdaplayın.</li>
		<li>Süspansiyonları toplanan kök kolonize bakteri hücreleri ile 1 x 10-1-1 x 10-4'e seyreltin (bakteri kolonizasyon kabiliyetine göre). Seyreltilmiş bakteri süspansiyonlarını LB agar ortamı içeren plakalara yayın ve 37 ° C'de 10 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolonileri sayın ve verileri normalleştirin.<ol><li>LB plakalarındaki bakteri kolonilerini sayın.</li>
		<li>CFU'ları karşılık gelen seyreltmeye göre hesaplayın ve verileri kök taze ağırlığı (W1-W 0) ile normalleştirin. Nihai sonuçlar, aşılamadan 2 gün sonra bir gram kök başına kolonize edilen bakteri hücrelerinin sayısını göstermektedir (Şekil 1B).</li>
	</ol></li>
</ol>

Arabidopsis thaliana'da Rizobakteriyel Kolonizasyon Tespiti

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

İyi bir tekrarlanabilirlik elde etmek için, bu protokolün kolonizasyon tespit süreci için dört kritik adım vardır. İlk olarak, aşılanan bakteri hücrelerinin sayısının her deneyde tam olarak aynı olduğundan emin olmak gerekir. İkincisi, kolonize olmayan bakteri temizleme yoğunluğunu steril su ile kontrol etmek de gereklidir. Üçüncüsü, mikrosantrifüj tüpüne batması kolay olan bakterilerin özelliklerinden dolayı absorpsiyon hatalarını önlemek için numunenin tam bir karıştırma durumunda ...

Tek bir bakteri suşu ile rizosfer kolonizasyonunu tespit etmek için kantitatif ve kalitatif yöntemler vardır. Kalitatif yöntem için, floresansı yapısal olarak ifade eden bir suş kullanılmalı ve floresan dağılımı ve yoğunluğu floresan mikroskobu veya lazer konfokal aletler 1,2 altında incelenmelidir. Bu stratejiler, in situ 3'te bakteri kolonizasyonunu iyi bir şekilde yansıtabilir, ancak miktar belirlemede geleneksel plaka sayma yöntemleri kadar doğru değildir. Ayrıca, mikroskop altında sadece kısmi kök bölgelerinin gösterilmesinin sınırlılığı nedeniyle, bazen subjektif önyargıdan etkilenebilir.
Burada, kolonize bakteri hücrelerinin toplanmasını ve bakteriyel CFU'ların bir plaka üzerinde sayılmasını içeren kantitatif bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu yöntem, bitki köklerinden sıyrılan kolonize suşların sayılabildiği seyreltme ve kaplamaya dayanır ve kök üzerindeki toplam kolonize bakteri sayısı 4,5 olarak hesaplanabilir.
İlk olarak, A. thaliana hidroponik koşullarda kültürlendi ve daha sonra bakteri hücreleri rizosferde 0.01 OD600'lük bir nihai konsantrasyonda aşılandı. Enfekte kök dokuları aşılamadan 2 gün sonra toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini uzaklaştırmak için steril suda yıkandı. Ayrıca, kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri toplandı, fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda seyreltildi ve bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. 37 ° C'de 10 saat inkübasyondan sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve köklerde kolonize olan bakteri hücrelerini belirlemek için normalize edildi.
Bu yöntem son derece uygulanabilirdir, iyi tekrarlanabilirliğe sahiptir ve doğru rizosfer bakteri kolonizasyonu tayini için daha uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

Arabidopsis thaliana kökü üzerinde bakteri kolonizasyonunun ölçülmesi, bitki-mikrop etkileşimi çalışmalarında en sık yapılan deneylerden biridir. Tekrarlanabilirliği artırmak için rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. Önce steril A.thaliana'yı hidroponik koşullarda kültürledik ve daha sonra rizosferdeki bakteri hücrelerini 0.01'lik bir OD600 nihai konsantrasyonunda aşıladık. Aşılamadan 2 gün sonra, kök dokusu toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak için steril suda üç kez yıkandı. Kökler daha sonra tartıldı ve kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri girdap ile toplandı. Hücre süspansiyonu, bir fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile bir gradyan içinde seyreltildi, ardından bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. Plakalar 37 ° C'de 10 saat inkübe edildi ve daha sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve kökler üzerinde kolonize olan bakteri hücrelerini belirtmek için normalize edildi. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ile mono etkileşim koşullarında rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu tespit etmek için kullanılır.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Yazar Spotlight: Geliştirilmiş Mikrobiyal Gübre Verimliliği için Bitki Köklerinde Rizobakteri Kolonizasyonunun Geliştirilmesi

Hidroponik Durumdaki Arabidopsis thaliana Köklerinde Bakteri Kolonizasyonunun Ölçülmesi

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

A. thaliana rizosferinde bu yöntemle tespit edilen bakteri kolonizasyon yeteneğinin doğruluğunu test etmek için, Bacillus velezensis SQR9 WT ve türetilmiş bir mutant Δ8mcp'yi A. thaliana rhizosphere'e ayrı ayrı aşıladık. Δ8mcp, tüm kemoreseptör kodlayan genlerden yoksun bir mutanttır ve önemli ölçüde azalmış bir kolonizasyonasahiptir 6. Kolonizasyonlarını mevcut kök kolonizasyon testi ile aşılamadan 2 gün sonra ölçtük. So...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Rizosferde bitki büyümesini teşvik eden rizobakterilerin (PGPR) kolonizasyonu, büyümeyi teşvik edici etkisi için gereklidir. Bakteriyel rizosfer kolonizasyonunun tespit yöntemini standartlaştırmak gerekir. Burada, kök yüzeyindeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Araştırmamız, faydalı rizobakterilerin bitki kökleri ile etkileşimine odaklanmaktadır. Yararlı bakterilerin kolonizasyonunu arttırmak, böylece tarladaki mikrobiyal gübrelerin verimliliğini ve stabilitesini artırmak için temel mekanizmaları arıyoruz. Bitki köklerinin bakteri kolonizasyonu için yöntemler kapsamlı bir şekilde incelenmiştir, ancak hala problemler vardır.Örneğin, farklı bölgelerdeki kolonizasyonu belirgin bir şekilde ölçmek zordur, Gelecekte mikroskop ve yüksek verimli sayım uygulamanın sorunları çözmeye yardımcı olacağını düşünüyoruz. Protokolümüz iyi tekrarlanabilirlik ile son derece uygulanabilirdir ve doğru rizosfer bakteri kolonizasyonu tayini için daha uygundur.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

437 Görüntüleme.  Chinese Academy of Agricultural Sciences. Araştırmamız, faydalı rizobakterilerin bitki kökleri ile etkileşimine odaklanmaktadır. Yararlı bakterilerin kolonizasyonunu arttırmak, böylece tarladaki mikrobiyal gübrelerin verimliliğini ve stabilitesini artırmak için temel mekanizmaları arıyoruz. Bitki köklerinin bakteri kolonizasyonu için yöntemler kapsamlı bir şekilde incelenmiştir, ancak hala problemler vardır.Örneğin, farklı bölgelerdeki kolonizasyonu belirgin bir şekilde ölçmek zordur, Gelecekte mi...