간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

종양 재발은 분만 절제술의 매우 두드러진 문제입니다. 이 연구에서는 재생 환경에서의 종양 성장에 대해 더 많이 이해하려고 합니다. 종양 오가노이드는 환자의 종양을 조직학적으로나 유전적으로 재현하는 것으로 나타났지만, 생체 내 모델은 부족하고 안정성이 부족합니다.

우리는 환자에서 파생된 오가노이드를 쥐의 간에 성공적으로 이식했습니다. 두 가지 예시 사례에 대해 이를 보여주었습니다. 조직학 면역조직화학적 염색은 오가노이드와 이종이식편이 원래 환자의 종양과 유사하다는 것을 보여줍니다.

원래 종양에서 오가노이드의 발달은 2D 세포 배양과 같은 다른 가능성에 비해 환자 종양에 대한 더 정확한 모델과 유사합니다. 이 모델을 간 재생의 복잡한 환경에 포함시키면 종양 세포와 재생 환경 사이의 기존 상호 작용에 대해 더 많이 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 우리는 간 절제술의 간세포암 재발에 대한 이해에 관한 지식을 우리 분야에 얻기를 희망합니다.

따라서 이 모델을 통해 향후 연구 프로젝트의 기초를 만들고자 합니다. 먼저 메스와 집게를 사용하여 적출된 간암 조직을 1-2제곱밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 조직 조각을 5ml의 해리 완충액이 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다.

튜브를 섭씨 37도의 회전 장치에 놓습니다. 배양 후 50ml 튜브 위에 놓인 100마이크로미터 세포 여과기에 세포 혼합물을 통과시킵니다. 5ml 주사기 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직 조각을 부수십시오.

이제 필터 위에 5ml의 고급 DMEM을 추가하여 세척합니다. 여과액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 상등액을 흡인시킨 후, 펠릿을 5ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다.

300g에서 5분 동안 서스펜션을 다시 원심분리합니다. 그런 다음 계산하기 전에 펠릿을 1밀리리터의 PBS에 재현탁시킵니다. 세포 도금 전에 원심분리기 세포 현탁액에서 상층액을 제거합니다.

약 1ml의 기저막 매트릭스를 튜브에 재현탁하고 얼음 위에 놓습니다. 20마이크로리터의 세포 현탁액을 예열 6웰 플레이트의 웰에 피펫팅하여 방울을 생성합니다. 2-3분 동안 기다린 후 플레이트를 5분 동안 흐름 캐비닛의 거꾸로 된 위치에 놓습니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 응고시킵니다. 마지막으로, 각 웰에 2ml의 오가노이드 배양 배지를 추가합니다. 환자 유래 오가노이드 계통은 원래 환자 종양의 형태학적 특징을 나타냈습니다.

시작하려면 마취된 마우스를 팔다리를 테이프로 감은 상태에서 누운 자세로 놓습니다. 집게와 미세수술용 가위를 사용하여 하복부에서 xiphoid 연골까지 선형 알바를 따라 고갈된 수술 부위를 절개합니다. 견인기를 절개 부위에 삽입하고 견인 방향을 조정하여 상복부에 최적으로 노출됩니다.

절개 부위 바로 옆에 식염수로 적신 깨끗한 냅킨을 놓습니다. 이제 젖은 냅킨에 소장과 맹장을 외부로 내뿜습니다. 주사가 가능할 때까지 오른쪽 상엽을 노출시킵니다.

오가노이드 혼합물을 Hamilton 주사기라고 표시된 린스에 넣습니다. 바늘을 움직이지 않고 표시가 될 때까지 마우스에 서스펜션을 꾸준히 주입합니다. 면봉으로 주사 부위에 압력을 가합니다.

그런 다음 복부에 엽 파열이나 역류가 있는지 확인합니다. 0.5ml의 멸균 식염수로 복부를 헹굽니다. 복부를 닫기 위해 재흡수성 봉합사와 함께 흐르는 봉합사를 놓습니다.

쥐에서 발생한 종양은 환자 유래 오가노이드와 원래 환자 종양과 유사했습니다. 경미한 간 절제술을 시작하려면 누운 자세로 마취된 마우스에 개복술을 시행합니다. 촉촉한 면봉으로 내측을 두개골 방향으로 밀어 수술 부위에 더 많은 공간을 확보합니다.

왼쪽 측면 간엽을 두개골로 뒤집어 미상엽과 인대를 노출시킵니다. 인대를 완전히 자릅니다. 그런 다음 외측 간엽 아래에 결찰을 삽입합니다.

이제 왼쪽 측면 간엽을 꼬리 방향으로 뒤집고 합자의 왼쪽 자유 끝을 왼쪽 측면 간엽의 왼쪽 끝 주위로 안내합니다. 오른쪽 자유 끝을 다른 쪽 끝으로 안내합니다. 면봉을 사용하여 로브에 견인력을 가하고 합자가 중앙에 위치하도록 합니다.

그런 다음 더블 하프 매듭을 묶습니다. 완전히 조이지 않고 다른 방향으로 묶은 다른 후반 매듭으로 이 매듭을 고정합니다. 합자가 제대로 배치되면 끝이 뭉툭한 집게로 합자의 두개골 자유 끝을 잡고 다른 집게로 꼬리 끝을 당깁니다.

반대 방향으로 묶인 두 번째 매듭으로 매듭을 고정합니다. 간을 절제하기 위해 절단하지 않고 결찰 가까이로 자릅니다. 왼쪽 외측 간엽을 경미하게 절제한 후 팔시폼 인대를 절제합니다.

두개골 방향으로 엽을 뒤집은 다음 그 아래에 합자를 삽입하고 꼬리 방향으로 뒤집습니다. 이제 순순 주위에 합자의 자유 ens를 반복합니다. 합자가 올바르게 배치되면 이중 반 매듭을 천천히 묶습니다.

반대 방향으로 두 번째 절반 매듭을 완전히 조인 다음 반대 방향으로 세 번째 절반 매듭을 추가합니다. 엽을 절제하고 멸균 식염수로 복부를 씻어냅니다. 장을 해부학적 위치에 다시 놓습니다.

복부를 닫으려면 집게를 사용하여 피부와 복막을 잡습니다. 절개 라인의 상단 끝에 재흡수성 봉합사가 있는 스티치를 놓습니다. 절개 부위의 반대쪽에서 피부 쪽으로 나오는 두 번째 봉합을 수행합니다.

바늘이 짧지 않도록 자유 끝을 남겨두고 매듭을 단단히 묶습니다. 스티치의 바늘 끝을 길게 두십시오. 절개 부위 아래쪽 끝에 매듭을 지어 러닝 봉합사를 마무리합니다.

복부에 남아 있는 피를 청소하십시오. 간엽의 상대적 기여도는 동일한 균주의 다른 마우스 간에 비슷합니다. 경미한 절제 후 우측 하엽의 평균 체중은 전체 체중의 0.82%로 증가했다.

주요 절제술은 전체 체중의 0.99% 증가를 가져왔습니다. 우측 상엽의 대대적인 절제술은 우측 하엽에 비해 무게가 현저하게 증가하는 결과를 낳았다.