Рецидив опухоли является очень заметной проблемой резекции родов. В этом исследовании мы пытаемся узнать больше о росте опухоли в регенеративной среде. Было показано, что опухолевые органоиды гистологически и генетически повторяют опухоль пациента, хотя модели in vivo редки и нестабильны.
Мы успешно осуществили трансплантацию полученного пациентом органоида в печень мыши. Мы показали это в двух примерах. Гистологическое иммуногистохимическое окрашивание показывает, что органоиды и ксенотрансплантат напоминают исходную опухоль пациента.
Развитие органоидов из исходной опухоли напоминает более точную модель опухоли пациента по сравнению с другими возможностями, такими как двумерные клеточные культуры. Встраивание этой модели в сложную среду регенерации печени поможет лучше понять существующие взаимодействия между опухолевыми клетками и регенеративной средой. Мы надеемся, что получим знания в нашей области относительно понимания рецидива ГЦК резекции печени.
Поэтому с помощью этой модели мы хотим создать основу для будущих исследовательских проектов. Для начала с помощью скальпеля и щипцов разрежьте собранную ткань рака печени на мелкие фрагменты размером от одного до двух квадратных миллиметров. Переложите кусочки ткани в 15-миллилитровую пробирку, содержащую пять миллилитров диссоциативного буфера.
Поместите трубку на вращающееся устройство при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации пропустите клеточную смесь через клеточное сетчатое фильтр размером 100 микрометров, помещенное поверх 50-миллилитровой пробирки. С помощью поршня пятимиллилитрового шприца раздавите фрагменты ткани через фильтр.
Теперь добавьте пять миллилитров дополненного усовершенствованного DMEM поверх фильтра, чтобы промыть его. Перелейте фильтрат в коническую трубку объемом 15 миллилитров. После аспирации надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов.
Снова центрифугируйте суспензию в течение пяти минут при 300г. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS перед подсчетом. Перед нанесением покрытия на клетки удалите надосадочную жидкость из суспензии ячеек центрифуги.
Повторно суспензируйте примерно одним миллилитром базальной мембраны матрицу к трубке и положите на лед. Пипеткой внесите 20 микролитров клеточной суспензии в лунки предварительно прогретой шестилуночной пластины для создания капель. Подождав две-три минуты, поместите пластину в перевернутое положение в проточный шкаф на пять минут.
Затем переложите пластину в инкубатор для застывания. Наконец, добавьте по два миллилитра органоидной питательной среды в каждую лунку. Органоидная линия, полученная от пациента, представляла собой морфологические особенности исходной опухоли пациента.
Для начала поместите мышь, находящуюся под наркозом, в положение лежа на спине, заклеив конечности скотчем. С помощью щипцов и микрохирургических ножниц сделайте разрез на истощенном месте операции вдоль линейной белой кости от нижней части живота до мечевидного хряща. Вставьте ретракторы в разрез, регулируя направление вытяжения, чтобы добиться оптимального обнажения верхней части живота.
Положите чистую салфетку, смоченную с солевым раствором, прямо рядом с местом разреза. Теперь выложите тонкую кишку и слепую кишку на влажную салфетку. Обнажайте правую верхнюю долю до тех пор, пока не станет возможной инъекция.
Наберите органоидную смесь в полоскатель с надписью «Шприц Гамильтона». Неуклонно вводите суспензию в мышь до появления метки, не двигая иглой. Надавите ватным тампоном на место инъекции.
Затем проверьте брюшную полость на предмет разрыва доли или обратного потока. Прополощите брюшную полость 0,5 миллилитрами стерильного физиологического раствора. Наложите беговой шов с рассасывающимся швом, чтобы закрыть живот.
Опухоль, развившаяся у мыши, напоминала как органоиды, полученные от пациента, так и исходную опухоль пациента. Чтобы начать малую резекцию печени, проведите лапаротомию у мыши, находящейся под наркозом, в положении лежа на спине. Влажными ватными тампонами надавите на медиальную долю краниально, чтобы создать больше пространства в операционном поле.
Переверните левую латеральную долю печени краниально, чтобы обнажить хвостатую долю и связку. Разрежьте связку полностью. Затем введите лигатуру ниже латеральной доли печени.
Теперь переверните левую латеральную долю печени каудально и проведите левый свободный конец лигатуры вокруг левого кончика левой боковой доли печени. Проведите правый свободный конец вокруг другого кончика. С помощью ватной палочки наложите тракцию на мочку, следя за тем, чтобы лигатура располагалась по центру.
Затем завяжите двойной полуузел. Закрепите этот узел еще одним вторым половинным узлом, завязанным в другом направлении, не затягивая его полностью. Когда лигатура расположена правильно, удерживайте свободный краниальный конец лигатуры тупыми щипцами и потяните каудальный конец еще одной парой щипцов.
Закрепите узел вторым узлом, завязанным в обратном направлении. Разрежьте близко к лигатуре, не разрезая ее, чтобы резекция печени. После незначительной резекции левой латеральной доли печени пересектите серповидную связку.
Переверните мочку краниально, затем вставьте под нее лигатуру и переверните ее каудально. Теперь обмотайте свободные эны лигатуры вокруг губного лаба. Как только лигатура будет размещена правильно, медленно завяжите двойной полуузел.
Полностью затяните второй полуузел в обратном направлении, затем добавьте третий полуузел в противоположном направлении. Подсектируйте мочку, затем промойте брюшную полость стерильным солевым раствором. Верните кишечник на его анатомическое место.
Чтобы закрыть живот, используйте щипцы для захвата кожи и брюшины. Наложите шов с рассасывающимся швом на верхний конец линии разреза. Выполните второй шов с другой стороны разреза, выходящей со стороны кожи.
Завяжите узел плотно, оставив свободный конец без иглы коротким. Оставьте игольчатый конец стежка длинным. Завершите беговой шов узлом на нижнем конце разреза.
Очистите брюшную полость от оставшейся крови. Относительный вклад долей печени сопоставим у разных мышей одной и той же линии. Средняя масса правой нижней доли увеличилась до 0,82% от общей массы тела после незначительной резекции.
Обширная резекция привела к увеличению массы тела на 0,99%. Значительная резекция правой верхней доли привела к выраженному увеличению ее массы по отношению к правой нижней доле.
