私たちの取り組みは現在、エピジェネティックな変化と代謝の再配線との間の既存の相関関係をより良く特徴付けることに焦点を当てており、最終的には新しいエピジェネティックな治療標的を特定することを目標としています。エピジェネティックな修飾の動的で可逆的な性質を考えると、最近、いくつかのエピドラッグ剤が開発され、がん治療の改善と化学療法抵抗性の減少につながっています。近年、最新の質量分析法の応用と、トップページや高速液体クロマトグラフィーなどの分離技術の組み合わせにより、インスタンスの特性評価の分野で大きな進歩が見られました。
ヒストンの特性評価における主な課題は、動的修飾酵素と代謝物の利用可能性との間のクロストークから生じる、無数のヒストンプロテオフォームの存在です。まず、ミニ垂直ポリアクリルアミドゲル、電気泳動システム用のミニTAUゲルを調製します。これを行うには、6モル尿素を15%アクリルアミドビスアクリルアミドの溶液に溶解し、1ミリリットルの超純水を室温で穏やかに攪拌して溶解します。
次に、他のコンポーネントを追加し、音量を調整します。プリセットゲルプレートにこの溶液を充填し、気泡が形成されないようにし、上部から1.5センチメートル離れます。1ミリリットルのイソプロパノールを上に加え、ゲルを平らにします。
スタッキングゲルを調製するには、尿素を6%アクリルアミド、ビスアクリルアミドに1ミリリットルの超純水で溶解します。他の成分を添加した後、ゲルプレートにこの溶液を充填し、溶液がコームの歯の半分に達するまでプレートの間に10ウェルコームを挿入します。次に、6モル尿素、5%氷酢酸、および二重蒸留水を溶解して、100マイクロリットルのTAUサンプルバッファーを調製します。
次に、凍結乾燥したヒストンサンプルを30マイクロリットルのTAUサンプルバッファーに溶解します。ミニカセットに、最終濃度5%酢酸のTAUランニングバッファーを充填します。シリンジを使用してゲルのウェルをランニングバッファーですすぎ、マイクロピペットでサンプルをウェルにロードします。
次に、電気泳動チャンバーを電源に接続し、正極を下部に配置します。時々、電源を切り、ゲルウェルをシリンジですすいで、ゲルの底面から気泡を取り除きます。ゲルプレートからゲルを取り除いた後、きれいなメスを使用して目的のレーンを切ります。
次に、ゲルレーンを15ミリリットルの0.5 Mトリス塩酸塩、pH 8.8で15分間洗浄します。ここに示す成分を使用して、15ミリリットルの平衡化バッファー1と2を調製します。次に、平衡化バッファー2を暗闇に保管します。
次に、ゲルレーンを10ミリリットルの平衡緩衝液でインキュベートし、15分間穏やかに攪拌してからデカントします。その後、ゲルレーンを10ミリリットルの平衡緩衝液2でインキュベートし、暗所で15分間穏やかに攪拌してからデカントします。次に、ここに示す組成を使用して、15%アクリルアミド分離ゲルを調製します。
ゲルプレートをセットし、長いゲルプレートの端から1.5cmのところに分離ゲル溶液を充填します。上に1ミリリットルのイソプロパノールを加えてゲルを平らにし、重合させます。ゲルが重合したら、イソプロパノールをデカントし、3 mmセルロースクロマトグラフィーペーパーを使用してウェルを乾燥させます。
ピンセットを使用して気泡を防ぎ、切断したゲルレーンを分離ゲルウェルに挿入し、トリスグリシンとSDSバッファーに0.5%低融点アガロースを使用し、5マイクロリットルの0.003%ブロモフェノールブルーを使用して、ゲルレーンを分離ゲルに密封します。ゲルプレートをカセットに入れ、トリスグリシンとSDSバッファーを充填します。ブロモフェノールブルー染料が底に達するまで、ゲルを120ボルトで泳がせます。
実行後、プレートからゲルをそっと取り出し、余分なアガロースを捨てます。まず、ヒストンサンプルに対してミニ2Dゲルトリトン酸尿素(TAU電気泳動)を行い、続いて銀染色を行います。次に、ここに示す試薬を準備します。
清潔なメスを使用して、染色したゲルから目的のヒストンスポットを取り出し、各スポットを新しい1.5ミリリットルのシリコンチューブに配置して、アイソフォームの相互汚染を回避します。250マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム、または50%アセトンニトロを各ゲルスポットに加え、室温のサーモミキサーで穏やかに攪拌してインキュベートします。溶液をデカントし、ゲル片が透明になるまでこのプロセスを3回繰り返します。
ゲルスポットを脱水するには、200マイクロリットルのアセトンニトロールを追加します。このステップでは、ゲル片が不透明な白に変わります。アセトンニトリルをデカントし、ゲルスポットを10分間風乾させます。
ゲル片はチューブ内で乾燥しているように見えます。次に、20マイクロリットルのトリプシン溶液またはゲル片を覆うのに十分な量を追加して、ゲルスポットを再水和します。チューブを摂氏37度のサーモミキサーで、穏やかに攪拌しながら少なくとも4時間から最大16時間インキュベートします。
三連祭壇画ペプチドを含む上清を新しいチューブに移します。ゲル片に50マイクロリットルの抽出溶液を加え、超音波水浴中で摂氏4度で10分間2回超音波処理します。追加の三連祭壇画ペプチドを含む上清を同じ新鮮なチューブに移します。
凍結乾燥機を使用して、プールした抽出ペプチドを摂氏30度で乾燥させます。凍結乾燥されたペレットがチューブ内に形成されます。次に、各チューブに15マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸を加え、摂氏25度のサーモミキサーで静かにインキュベートします。
上清をバイアルに移し、液体クロマトグラフィータンデム、質量分析分析を行います。
