この作品はARKに、米国心臓協会14GRNT20390154からの受賞によって、部分的にはインディアナ大学 - パデュー大学、インディアナポリスからの研究支援基金助成金（RSFG）によって部分的にサポートされていました

1.細菌発現。 注：この研究で使用した発現プラスミドを、 表1に記載されています。本研究で用いた溶液、培地、及び緩衝液は、表2に記載されています。古細菌のプロテアソームサブユニット遺伝子のクローニングおよび発現プラスミドの生成は、他の場所18,20に記載されています。簡単に言えば、サブユニットの組換え共発現のためのプラスミドは、個々のサブユニット18,20の同等の発現レベルを得ることに役立つシストロン性オペロンの戦略を採用しています。下記の式のパラメータは、この研究におけるプロテアソームサブユニットのために最適であることが経験的に決定されました。他の古細菌種由来の、または他の組換えタンパク質複合体（考察を参照）プロテアソームのために、他のプロテアソーム変異体のための発現を最適化する必要があるかもしれません。 <ol><li> （化学的コンピテント大腸菌 BL21に関心の発現プラスミドをトランスフォームDE3）細胞。 </li><li>たて氷上で解凍したDE3細胞のアリコートに - （100 ngの典型的には50）、そして20分間氷上でインキュベートし続けプラスミドの2μL - 1を追加します。 </li><li>熱ショック45秒、42℃で細胞とadditionl 2分間氷上にチューブを返します。 </li><li> LB培地1mlを加え、1時間（150 rpm）し、振盪しながら37℃でインキュベートします。 </li><li> （カナマイシン（すべてのプラスミドは、この抗生物質に本研究エンコード抵抗で使用される）を補充したLB固体培地を含有するプレート、）LB-館プレート上に形質転換混合物の200μL - 100を広げます。 37ºCO / Nでプレートをインキュベートします。 </li><li>次の朝、ガラス培養チューブ内の液体LB館メディアの3ミリリットルにLB-館プレートから単一コロニーを接種します。約2.5（150 rpm）し、振とうしながら37ºCでインキュベート - 3 H、またはまで濁りが観察されます。 </li><li>分光光度計において600nm（OD 600）での培養物の光学密度を測定します。細胞カルトを希釈6 mLの最終容積で0.4のOD 600に予め温めたLB-館メディアの適切な量とURE。 40分間37ºCで振とう再開します。 </li><li> 1mMの最終濃度までストック溶液からIPTGを添加することにより、液体培養におけるタンパク質発現を誘導します。 7時間 - 約6のために（150 rpm）し振とうしながら37ºCでインキュベートします。 </li><li> 1.5 mLのマイクロチューブに、その全体が細菌細胞培養物を収穫。 </li><li>マイクロ遠心チューブに文化の1.5 mLを加え。 1分間10,000×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、ペレットに同じ培養の別の1.5 mLを加え。 1分間10,000×gで遠心分離します。 </li><li>全培養は、マイクロ遠心チューブに収穫されるまで、ステップ1.11を繰り返します。 </li><li>溶解するまで-80℃で誘導されたペレットを保管してください。 </li></ol> 2.細菌の溶解および溶解物をミキシング。 注意： </stronグラム&gt;共発現を介して、研究サンプルについては、セクション2.1（およびそのサブセクション）に従います。溶解液の混合を必要とするサンプルについては、2.2節（およびそのサブセクション）に従います。プロトコルに含まれているTSP（合計、可溶性、ペレット）分析αおよびβサブユニットのほぼ等量を混合溶解液（説明を参照）の間に結合されていることを確認することができ、タンパク質発現を最適化するのに有用です。また、下流の結果が期待されていないようならば（ すなわち、それはタンパク質が発現し、可溶性れたことを確認）重要な制御を提供します。したがって、我々は非常に最初にTSP分析などをお勧めします。最適なプロトコルは、特定のサブユニットの組み合わせのために達成されると、TSP分析は、厳密にそれが以下にオプションとして記載されている理由である必要はありません。 <ol><li>細菌細胞および可溶性画分の準備の溶解。 <ol><li> 5分間氷上で誘導された細胞ペレットを解凍します。溶解緩衝液600μLにペレットを再懸濁。 </li><li>株式会社総粗溶解物を生成するために30分間（150 rpm）し振とうしながら30ºCでサスペンションをubate。 注：次の手順と次のサブセクションはオプションです。 </li><li>独立した1.5 mLのマイクロ遠心チューブに総粗溶解物から2 25μLアリコートを削除し、次のようにTSPの分析を行います。 <ol><li> 2 25μLアリコートのいずれかに、1×の最終濃度に5×SDS試料緩衝液を加えます。 「総粗溶解物」の「T」とのチューブにラベルを付けます。 </li><li>完全にタンパク質を変性させるために5分間100ºCで「T」のサンプルをインキュベートします。 </li><li>一方、10分間、10,000×gで第25μLを遠心それを取ります。慎重に小さなペレットを乱すことなく、上清を除去し、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。 「可溶性画分」のために、この新しいチューブ「S」をラベルを付けます。 </li><li> behi左の小さなペレットにndは前のステップで、再懸濁するために溶解バッファーとボルテックスの25μLを追加します。 「ペレット画分 &quot;のための&quot; P &quot;このチューブにラベルを付けます。 </li><li> 「S」および「P」のチューブに5×SDSサンプル緩衝液の6μLを加え、上記のように100ºCでインキュベートします。 注：TSPサンプルは発現を分析し、その日に使用しない場合に必要になるまで、彼らは-20ºCで凍結することができます。 12％および/または15％の標準的なSDS-PAGEゲル上ですぐにロードする前に、上記のように解凍したら、それらは、100ºCで再びインキュベートしなければなりません。 </li></ol></li><li> TSP解析が行われている間、遠心分離機総粗溶解物の残りの550μLを10分間10,000×gで（または合計粗溶解物の全体の600μLTSP分析が行われていない場合）。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を収集します。これは、精製のために使用される水溶性の溶解物です。 </li></ol></li><li>溶解物の混合。 <ol><li>ステップ2.1.1および上記2.1.2で説明したように溶解を行います。 </li><li>希望のβサブユニットを発現する細菌からの総粗溶解物の600μLで所望のαサブユニットを発現する細菌からの総粗溶解物の600μLを混ぜます。ゆっくりと30分間振盪しながら37ºCでインキュベートします。 注：（説明を参照）を混合溶解物中の最大アセンブリを達成するために、インキュベーション時間を最適化する必要があるかもしれません。ここに提示された時間と温度は、この研究における組換えタンパク質のために最適であり、他の場所18を決定しました。 </li><li>遠心分離機10分間10,000×gで混合溶解物を不溶性ペレットからの可溶性物質を分離します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。タンパク質精製のために、この混合可溶性溶解液を使用してください。 </li></ol></li></ol>固定化コバルト親和性樹脂を介して3.タンパク質精製（ICAR）。 <ol><li>樹脂を平衡化します。 <ol><li>徹底的に瓶を反転させることにより、樹脂を再懸濁し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブにスラリーの50μLを移します。ペレット樹脂に2分間700×gで遠心分離します。注意深く上清を吸引。 注：私たちは、液体の大部分を除去するために、青色1 mLのピペットチップを使用してピペット吸引を行います。白い2μLチップビーズを覆う液体の非常に薄い層を残し、残りの上清の除去の微調整のために使用されます。 </li><li>優しく樹脂をペレットに2分間700×gで樹脂と遠心分離機を再懸濁するために1 mLの緩衝液Aミックスの追加。注意深く上清を吸引し、この洗浄ステップをもう一度繰り返します。 </li></ol></li><li>平衡化した樹脂に2.1または2.2で以前に得られた可溶性溶解液を適用します。 60分間、4ºCで穏やかに回転させながらチューブをインキュベートします。 グラム&lt;700×でチューブを遠心/ em&gt;の5分間、注意深く上清を吸引除去します。 </li><li>非特異的に結合したタンパク質を除去するために、次のように樹脂を洗浄します。 <ol><li>再懸濁バッファーAを1mLと樹脂と10分間、4ºCで穏やかに振動でインキュベートします。 5分間700×gでチューブを遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。 </li><li>緩衝液B（5 mMのイミダゾールとの緩衝液A）1mlで再懸濁樹脂と5分間4ºCで穏やかに振動でインキュベートします。 5分間700×gでチューブを遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。 </li><li>緩衝液C（10mMのイミダゾールとの緩衝液A）1mlで再懸濁樹脂と5分間4ºCで穏やかに振動でインキュベートします。 5分間700×gでチューブを遠心分離し、上清を注意深く吸引除去します。 </li></ol></li><li>緩衝液Eの400μL（200 mMのイミダゾールとの緩衝液A）トンを追加することによってタンパク質を溶出樹脂O。穏やかに5分間4ºCで揺動させながらインキュベートします。 5分間700×gで遠心分離します。 </li><li>新しい1.5 mLの遠心分離管に精製されたタンパク質を含む上清を移します。 </li><li>次のようにシリアル遠心分離により精製したタンパク質を脱塩します。 <ol><li>精製タンパク質の400μLに、100μLの緩衝液Aを（これは200 mMのから160 mmのイミダゾール濃度を低下させる）を追加します。 10kDaの分子量カットオフで0.5 mLの超遠心フィルターに精製したタンパク質を適用します。 5分間14,000×gで遠心分離します。 </li><li>ろ液を捨て、再び濃縮液と遠心分離を希釈するために400μlのBuffer Aを追加します。イミダゾール濃度は4 mMのを下回るまで、遠心分離/希釈のサイクルを続けます。各遠心分離〜70μlの（または約7倍）までの500μLを集中した場合の例としては、2つのサイクルがAPPRし始めて160 mMのイミダゾール濃度（7×7 = 49倍）を削減しますoximately 3.3 mMの。 </li><li> BCAアッセイ21を使用して脱塩試料のタンパク質濃度を測定します。 注：製造業者の使用説明書に記載のように脱塩は、BCAアッセイの許容限界以下イミダゾールレベルを低減することが要求されます。我々の研究室では、それは敏感であるため、BCAアッセイを好む大きなダイナミックレンジを有しており、はるかに少ないタンパク質間変動を示します。しかし、タンパク質濃度を決定するための他の方法は、BCAアッセイのために置換することができます。キーは、各方法の利点と限界を認識することです。 </li></ol></li><li> 1Xの最終濃度に5Xネイティブサンプルバッファーを追加し、電気泳動に進みます。また、後の分析のために-20ºCで保存サンプル。 </li></ol> 4.非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）。 注意：未重合アクリルアミドは神経毒です。適切な保護GEAを着用rを。 <ol><li>次のように非変性PAGEゲルを準備します。 <ol><li>清浄なガラス板を使用して鋳造し、スタンドを鋳造するためのゲルカセットを準備します。小さな磁気撹拌機の上に勾配メーカーを置き、各チャンバー内に小さな撹拌棒を配置します。 </li><li> （w / v）のアクリルアミドおよび2％（w / v）の40％を使用して、ビスアクリルアミドストック溶液、ネイティブ解決バッファにおけるアクリルアミドゲル溶液（w / v）の5％から10％に調製。 1：ビスアクリルアミドする総アクリルアミドの比は37.5であることを確認してください。氷上でチル注ぐ前に。 注：SDS 22を省略して、ここで使用される非変性PAGEシステムは、LaemmliのSDS-PAGEシステムと本質的に同一です。 </li><li>重合を開始し（水で調製し、10％（w / v）のストック溶液から）アクリルアミド溶液にアンモニウム過硫酸塩を加えます。アンモニウム過硫酸塩の最終濃度は0.1％（W / V）。 </li><li>勾配メーカーの2室にアクリルアミドのソリューションを注ぎます。出口チューブ挿入とbetweenゲルカセットのプレートは、磁気撹拌機を活性化し、勾配メーカーのバルブを開きます。 10％非変性勾配ゲル - 5を注ぎます。 </li><li>一度注ぎ、イソプロパノールの薄層でゲルをオーバーレイし、ゲルを30分間重合を可能にします。この間、ネイティブ解決バッファ内の新鮮な5％アクリルアミドゲル溶液を調製。ゲルセットした後、イソプロパノールをオフに注ぎ、噴霧ボトルからの脱イオン水でゲルの上部をすすぎます。 </li><li>上記で調製した5％ゲル溶液に、ガラス板がいっぱいになるまでアンモニウム過硫酸塩を追加（4.1.3で説明したとおりに）、重合ゲルの上に注ぎます。ゲルコームを挿入します。オーバーレイされたゲルは、さらに30分間重合させました。 </li><li>ゲルが重合されると、電気泳動装置にゲルカセットを組み立てます。また、使用するための準備ができるまで、湿らせたペーパータオルやプラスチックラップに包まれた4ºCでゲルを、格納します。 </li></ol></li><li>非変性PAGEゲルはELECに組み立てられると泳動装置は、10Xネイティブランニング緩衝在庫から新たに調製1Xネイティブランニング緩衝液でタンクを埋めます。 </li><li>各ウェルガラスシリンジを使用してに、区間3の終わりに得られた精製タンパク質の負荷は10μg。 </li><li>ウェルの1つに（1Xネイティブランニングバッファー中に希釈）、高分子量天然のタンパク質標準の負荷2μL。 </li><li> （ - 4.5時間約4）色素の先端がゲルをオフに実行されるまで55 Vおよび4ºCでゲルを実行します。 </li><li>非変性ゲルに加えて、標準的なSDS-PAGE 22により精製タンパク質のアリコートを分析します。 <ol><li> 1Xの最終濃度の5×SDSサンプル緩衝液で、区間3の終わりに得られた精製タンパク質試料のアリコート（10μgの）を混合します。 </li><li> 22標準12％および/または15％SDS-PAGEゲル上に5分と負荷のために100ºCでインキュベートします。 </li><li>色素の先端がゲルをオフに実行するまで、これは約アドオンである（120 Vで、その後20分間、80Vで動作し、itional 12％ゲルを75分間、15％ゲル、120分）。 </li></ol></li></ol> 5.活動およびタンパク質染色を可視化。 <ol><li>電気泳動に続いて、慎重に別のガラス板と、脱イオン水50mLを含むゲルトレイに非変性ゲルを移します。穏やかに5分間揺らしながらゲルをすすぎます。水を捨て、この洗浄工程を3回繰り返します。 </li><li>次のように基板オーバーレイアッセイを行います。 <ol><li>蛍光性ペプチド基質のSuc-LLVY-AMCを含有する現像緩衝液の1 mLを加え、ゲル全体に均一に広がります。 30分間、37ºCでインキュベートします。 注：ガラスロッドまたはゲルリリーサー（別のガラスプレートに使用されるプラスチックの小さなくさび）をゲル上に液体を広げるために使用することができます。 </li><li>慎重にゲルイメージングシステムのUVトランスイルミネーターにゲルを転送し、切断されたペプチド基質に起因する蛍光を観察します。記録画像。慎重にゲルBAを転送ゲルトレイにCK。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら5分間脱イオン水50mlで2回ゲルを洗浄します。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら60分間、コロイド状クーマシー染色試薬10mlでゲルを染色。 50 mLの水で脱染ゲル背景が透明になるまで。この染色工程は、同様に、標準的なSDS-PAGEゲルに適用されます。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

私たちは、組換え古細菌のプロテアソームを使用してページを非変性することによりプロテアソームアセンブリを分析する組み合わせアプローチの利点を実証します。プロテアソームサブユニットの細菌共発現する通常の方法9,11は、迅速な分析を可能にしますが、キーアセンブリ中間体を明らかにしないことがあります。私たちは、アセンブリイベントの広い画像を開発するために?...

多タンパク質複合体は、1多数の重要な細胞活動を行っています。これらの複合体の多くは、はるかに彼らのアセンブリ2,3についてよりも、構造と機能について知られています。プロテアソームは、そのような複雑であり、人生のすべてのドメインに含まれています。真核生物では、この分子機械は、ユビキチン/プロテアソームシステム（UPS）の中核であり、細胞内タンパク質分解4の主要な経路を提供します。 19S調節粒子（RP）6によって一方または両方の端部に蓋をすることができ20Sプロテアソーム、またはコア粒子（CP）5、（26Sプロテアソームと呼ばれる）、真核生物のプロテアソームは、二つの主要なサブアセンブリで構成されています。 20Sプロテアソームは、大区画化プロテアーゼです。その四次構造は、絶対に人生のすべてのドメインにわたって保存されており、構造的に関連したサブユニットの2つのタイプを含む4〜7員環のスタックで構成され、α;そして、5,7,8、β。真核生物では、二つの外側リングはそれぞれ7別個のαサブユニットから構成され、2つの内輪は、それぞれ7個別のβサブユニットから構成されています。タンパク質分解活性は、βサブユニットの3内に存在します。対照的に、古細菌のCPリングは、通常、αの唯一の種類及びβサブユニットの一種で構成されています。古細菌のプロテアソームは、その組成の単純さと彼らのが彼らの真核生物のカウンターパート9-13と共通の組立機構を共有の両方にプロテアソームアセンブリを研究するための重要なモデルシステムを提供しています。簡単に言えば、αサブユニットは、βサブユニットが集合し、その上に足場として機能する、最初のαリングに集合します。完全に組み立てられたCP（α7β7β7α7）を生じさせる結果のハーフプロテアソーム（α7β7）二量体化、。二量体化の間にβサブユニットに、プロペプチドが存在自己触媒触媒N末端スレオニンを露出、除去されます。アセンブリをモデル化するために古細菌プロテアソームの使用は、しばしば、大腸菌における組換え古細菌プロテアソームタンパク質の産生を利用します。それは自身のプロテアソームを産生しない宿主生物において、WT及び変異型の両方の、種々の組み合わせで製造されるサブユニットを可能にするので、これは価値のあるアプローチです。 多タンパク質複合体の集合を監視することが生化学的に組み立て中間体および前駆体から完全に組み立てられた複合体を分離分別方法のいくつかの種類を必要とします。その優れた解決能力に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を非変性することは、様々な大規模な多タンパク質複合体14-17の分別に特に有用であることが証明されています。組換え古細菌のプロテアソームの生産と非変性PAGEの組み合わせはdissectinに強力なアプローチとなっていますグラムプロテアソームアセンブリ9,11,12,18。しかし、このアプローチが適用される（ すなわち 、α及びβサブユニットの組換え共発現を介して）通常の方法は重大な欠点を有しています。アセンブリ反応は、協同組合と強く濃度依存性の3です。細胞内部のタンパク質濃度は、アセンブリ反応は、インビボで急速に進んで、排除体積効果により、19非常に高いことを考えます。したがって、αおよびβサブユニットが同時発現させる際に重要なアセンブリ中間体を欠場することが可能です。 ここでは、組換え古細菌のプロテアソームサブユニットを使用して、プロテアソームアセンブリの研究に合わせたアプローチを主張しています。このアプローチでは、両方の同時発現と溶解液の混合方法が使用されます。共発現が少ない労働集約的であるため、前者はアセンブリの迅速な分析を可能にします。後者は、混合したαおよびβサブユニットの別々の発現に依存します。このrequiがけれども共発現よりも解像度もう少し努力が、それは同時発現の際に失われる中間体を検出する能力によって補償以上のものです。一緒に、これらの2つの方法は、プロテアソームのアセンブリのより完全な像を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

プロテアソームは、人生のすべてのドメインで発見されています。そのアセンブリが完全に理解されていないけれども彼らは、真核生物では細胞内タンパク質分解の主要な経路を提供します。すべてのプロテアソームは、構造的に保存されたコア粒子（CP）を含む、または20Sプロテアソーム二七量体αサブユニットのリング間に挟まれた2つの七量体のβサブユニットの環を含みます。古細菌の20Sプロテアソームは、彼らの真核生物の対応物と比較して、組成単純であり、まだ彼らの両方が共通の組立機構を共有しています。その結果、古細菌の20Sプロテアソームは、真核生物のプロテアソームのアセンブリのための重要なモデルであり続けます。具体的には、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて結合された古細菌の20Sプロテアソームの組換え発現は、プロテアソーム生合成に多くの重要な洞察をもたらしました。ここでは、nondenaturi前に古細菌のプロテアソームのαおよびβサブユニットの共発現の通常の戦略を改善するための手段を議論しますngのPAGE。我々は、迅速かつ効率的なものの、単独で共発現アプローチはキーアセンブリ中間体を逃すことができることを示しています。プロテアソームの場合には、共発現は、一つの完全なα-リングと一つの完全なβ-リングを含む中間のハーフプロテアソームの検出を許可しない場合があります。しかし、この中間体は、容易に溶解物混合を介して検出されます。私たちは、溶解液の混合と共発現を組み合わせることアセンブリを分析する上で、より徹底したアプローチをもたらす、まだ労働nonintensiveままであることを示唆しています。このアプローチは、他の組み換え多タンパク質複合体の研究に有用であり得ます。

αサブユニットはリング9を形成するために結合するとき、プロテアソームアセンブリ（ 図1）が開始されます。 C末端ヘキサヒスチジンは、（彼のタグ）誘導体（ 表1）のタグを付けたように古細菌Methanococcus maripaludis S2からのαサブユニットは、大腸菌で発現されるときに示すことができます。組換えα-Hisタンパク質はICARにより精製し、PAGEを非?...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

このプロトコルは、サブユニットの同時発現および組換えプロテアソームアセンブリのより完全な検査のために混合postlysisサブユニットの両方を使用しています。

組換え古細菌プロテアソームおよび非変性PAGEでプロテアソームアセンブリを調べる：複合的アプローチのためのケースを

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K ビュー.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI). このプロトコルは、サブユニットの同時発現および組換えプロテアソームアセンブリのより完全な検査のために混合postlysisサブユニットの両方を使用しています。 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

生化学

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

生物学

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

生物工学

The Proteasome Structure

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no longer needed. In this pathway, the protein that needs to be eliminated undergoes a process called ubiquitination, where a chain of ubiquitin molecules is attached to the 48th lysine residue of the target protein. This ubiquitin modification helps the proteasome distinguish between a target protein and a healthy protein.
The proteasome is an ATP-driven, large multi-subunit protease (26S) found in the nucleus and cytoplasm of all eukaryotes. The 26S proteasome comprises a central hollow cylindrical core (the 20S) and ring-shaped protein caps (19S). The 20S core particle is barrel-shaped, containing stacked rings with proteolytic active sites lined inside. The 19S caps act as gatekeepers and regulatory units of the proteasome. They are present at one or both ends of the core.
Caps have ubiquitin receptors, ubiquitin hydrolase, and unfoldase, each with a unique function. The ubiquitin receptor recognizes and allows ubiquitin-tagged proteins into the core, the hydrolase deubiquitinase cleaves ubiquitin from the substrate, and the unfoldase protein unfolds target proteins as they enter the protein core.
The hexameric unfoldases create a ring structure in the proteasome cap and belong to a large class of AAA proteins. Their mechanistic action is similar to other ATP-dependent helicases that cause DNA unwinding. The ATP-bound unfoldase ring binds a folded target protein held in place by its ubiquitin tag at the proteasomal cap. Next, a conformational change, driven by ATP hydrolysis, pulls the target protein substrate into the 20S core and strains the ring structure. As a result, when a protein is subjected to pulling forces, it can undergo two possible outcomes&#8212; it may either undergo partial unfolding and enter the cylindrical core, or it can retain its structure while partially retracting.
Highly stable substrates generally require hundreds of cycles of ATP hydrolysis before being pulled through the AAA ring. Once de-ubiquitylated and unfolded, the target protein is exposed to proteases inside the proteasomal core for digestion. In contrast to free cellular proteases, which quickly dissociate after their action on the target protein, the proteasome core holds the target protein until it is fully digested into smaller peptides. These small peptides are then released into the cytosol for further processing.&#160;

プロテアソームの構造

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no ...

組換え古細菌プロテアソームおよび非変性PAGEでプロテアソームアセンブリを調べる：複合的アプローチのためのケースを

要約

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からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

蛍光プロテアーゼアッセイプラットフォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

プロテアソームの構造

組換え古細菌プロテアソームおよび非変性PAGEでプロテアソームアセンブリを調べる：複合的アプローチのためのケースを

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OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

プロテアソームの構造

蛍光プロテアーゼアッセイプラットフォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用