我々はこのビデオで紹介する全体海馬スライスの低倍率の画像を取得するとヘルプはマークルーカニックとHwai -ジョンチェンに感謝したいと思います。我々はまた、ビデオを伴うテキストと支援のためにサラパリッシュに感謝します。

微粒子銃トランスフェクション用プロトコール弾丸を作る弾丸は最大6ヶ月間の良いですが、2〜3ヶ月後にトランスフェクション効率に減少し始める可能性があります。弾丸は、乾燥剤のペレットの存在下で4℃で保存してください。常にバイアルを開く前に室温に暖かい弾丸が格納されるシンチレーションバイアルを、、てみましょう。 始める前には用意しておいてください。 <ul><li>スペルミジン（0.05M） </li><li>のCaCl 2（1M） </li><li>エタノール（100％ - ハイグレード - 未開封ボトル） </li><li>オートクレーブH 2 0 </li><li>トランスフェクトされるDNA </li><li>ポリビニルピロリドン（PVP - 20 mg / mlストック） </li><li> 2 X 15 mlコニカル（2/bulletセット） </li><li>チューブ（X〜30インチ/弾丸セット1にカット） </li><li>シンチレーションバイアル（1/bulletセット） </li><li>乾燥ペレット</li><li> 10ミリリットル注射器のw /エンドでのチューブ</li></ul>チューブを準備します。 <ol><li>ドライ〜20分の最小のチューブステーションW / N 2ガ ​​スの配管の30インチ（右O -リングを越えて延長約2インチ）（0.4気圧）。 </li></ol>金のビーズにDNAを沈殿させる。 <ol><li>マイクロ遠心チューブに50μmL総容積（最大50μgのトータルDNA）にトランスフェクトされるDNAを準備する</li><li>金の6-8 mgを秤量し、マイクロ遠心チューブに移す</li><li>金に0.05Mスペルミジンの100μLを加え20秒間超音波処理</li><li>ゴールド/スペルミジンするDNAの50μLを追加</li><li>渦（設定値の約5）W /キャップ開放</li><li> 1M CaCl 2の賢明な100μLをドロップ追加</li><li>短時間（&lt;5秒）を超音波で分解する</li><li>室温で10分間沈殿することができます</li><li>簡単に超音波処理</li></ol>超音波処理中にPVP溶液を調製します： <ol><li>弾丸のセットごとに15 mlコニカル、3.5mL希釈PVPのPVP溶液を希釈してください（3.5ミリリットル100パーセントエタノールに20mg/ml PVPの株式の7.5μLを加える） </li></ol> EtOHで金のビーズをすすぎ。 <ol><li>微量遠心機で10秒間フルスピードでの金のビーズをスピンダウン</li><li>上清を捨てますが、金のビーズの上に少量の液体を保持</li><li>必要に応じて1ミリリットルEtOHで3X洗って、、簡単にそれぞれの時間を超音波で分解する</li></ol> PVP溶液に再懸濁し、ゴールド/ DNA： <ol><li> 3.5ミリリットル希釈PVP / EtOH溶液200μLで金メダルペレットを再懸濁します</li><li>渦懸濁するために金ペレット（必要に応じて簡単に超音波処理） </li><li>新しい15 mLコニカルにゴールド/ PVP溶液200μLを転送する</li><li>すべての金を15 mLコニカルに転送されるまで一度PVP 200μLを加え、この方法で継続し、そして最終容量が3.2 mLである</li></ol>コー​​ティングチューブ： <ol><li>チューブの駅でN 2の電源を切り、乾燥させたチューブを取り外す</li><li> 10mlの注射器に乾燥チューブを取り付けます</li><li>精力的に金/ PVPで満たされた15 mLコニカルを振る</li><li>ゴールド/ PVP溶液中でチューブの端を置き、気泡に注意しながらゆっくりと吸い上げる</li><li>チューブの両端から〜2インチドライ残す</li><li>チューブはまだ注射器に接続されていると、金/ PVP溶液で満たされた、慎重にステーションに戻ってチューブを配置すると</li><li>解決策は、座っているチューブの端面をマーク</li><li>金が接続されている注射器で5分間解決しましょう</li><li>決済金が取り残されるように、シリンジを引いて、非常にゆっくりとソリューションを吸い取る（ウォッシュをバックアップしないことを確認してください） </li><li>シリンジを外します</li><li> 90 °回転させて、2秒放置</li><li> 180 °回転させて、別の2秒を座らせて</li><li> 5秒間チューブを回転させる</li><li>バルブが0.4の間に読むようにN 2をオンに- 0.5〜5分間乾燥しながら、金でコーティングされたチューブをスピン。 </li></ol>チューブを切断。 <ol><li>チューブの準備 - 駅からチューブを取り出して、マークに端をカット。 </li><li>カットカートリッジをキャッチするチューブチョッパーで標識されたシンチレーションバイアルに入れ</li><li>チューブチョッパーにチューブを配置し、清潔なカミソリでチューブをカット</li><li>シンチレーションバイアルに乾燥ペレットを配置</li><li> 4℃店舗カートリッジ° C </li></ol>組織切片を撮影する培養スライスを撮影するとき、それは汚染を避けるために比較的無菌テクニックを採用することが重要です。二つの異なる構造を撮影する場合、弾丸の両方のセットが同じカートリッジホルダーにロードすることができますが、バレルライナーと画面が構成要素との間で変更することを、覚えておいてください。 始める前には用意しておいてください。 <ul><li> DNAの弾丸（開く前に室温にシンチレーションバイアルを暖かくさせる） </li><li>組織切片</li><li>遺伝子銃をヘリオス</li><li>接続されている遺伝子銃のホースとヘリウムタンク&lt;/ LI&gt; <li>カートリッジのホルダー</li><li>代わりにプラスチック製のO -リング付きバレルライナー</li><li>ディフューザー（変更） </li><li>ディフューザーの画面</li><li>鉗子</li></ul>遺伝子銃を準備中。 <ol><li>使用して鉗子は、カートリッジホルダーにゴールドコーティングプラスチック製のカートリッジを置きます。 </li><li>最初のバックロックを押すことにより、遺伝子銃にカートリッジホルダーを配置</li><li>ロックとカートリッジホルダーを固定します</li><li> O -リングと場所でしっかりとディフューザーの画面でバレルライナーを取得する</li><li>遺伝子銃にバレルライナーをねじ込む</li></ol>遺伝子銃で培養スライスを撃つ： <ol><li>耳のマフを装着</li><li>ホース接続されているヘリウムガスのタンクへの遺伝子銃を差し込みます</li><li> 180 PSIにタンクに圧力を上げる</li><li>ディフューザーの画面からほこりやごみを除去するために空気中に空白を撃つ。銃を発射するには、最初のトリガを引くし、銃のビープ音がするまで、安全インターロックボタンを押し下げる。 </li><li>空白を撮影した後、インキュベーターからスライスを削除する</li><li>第一構築するために銃を進める</li><li>約0.5ディフューザーの画面で撮影する - スライスから1インチ</li><li>ウェル間のカートリッジを進める。 </li><li>最後の井戸を撮影した後、インキュベーターに戻してスライスを配置</li><li>ヘリウムホースからガンを取り外す前に、ガスと放出圧力をオフにする</li><li>ネジを外しバレルライナー、およびカートリッジを取り外し、使用するシェル</li></ol>カートリッジホルダーとバレルライナーのクリーニング： <ol><li>場所カートリッジ、バレルライナー、及び石鹸水でビーカーのディフューザーの画面</li><li> 20分間バスの超音波処理や超音波処理の場所のビーカー</li><li>すべての石鹸残基が除去されるまで、徹底的に水で洗い流してください</li><li>時間を70％エタノールに浸し</li><li>一晩乾燥させる乾燥したペーパータオルの上に置いて</li><li>クリーンカートリッジ、バレルライナー、および画面は、その後のバイオリスティックトランスフェクションに再利用することができます</li></ol>微粒子銃トランスフェクションのためのトラブルシューティングのヒント 微粒子銃トランスフェクションは、時々次善のトランスフェクションの条件になる可能性があります。それは少なすぎるか多すぎる細胞はトランスフェクション、高すぎるか低発現レベルにつながる可能性、または一般的には不健康になるために組織切片を引き起こす可能性があります。頻繁に不健康なスライスは、圧力の爆発に起因する。最適なトランスフェクションした組織切片を得るためのヒントです。 スライスが（またはあまりにも多くの細胞が/スライスをトランスフェクトしている場合）不健康なように表示される場合は、試してみてください。 <ul><li> 増加撮影距離</li><li>ガスのタンクで圧力の低下 </li><li>金の額を減少 </li><li> Bio - Rad社のディフューザーの中央を切断し、ディフューザーの画面で中央に置き換える。 </li></ul> 少なすぎるの細胞がトランスフェクトされている場合、試してみてください。 <ul><li>撮影距離を減少させる </li><li>ガスのタンクで圧力の上昇 </li><li>金の額を増加 </li><li> /ウェルの組織スライスの数を増加 </li><li>バレルライナーのO -リングが完全であることを確認してください。 </li></ul>あなたが同じ撮影を確認中にトランスフェクトされた両方の数が多すぎると細胞数が少なすぎるとスライスを取得する場合： <ul><li>あなたは対称的に、上記も銃を保持している</li><li>その金は、均等にコーティングチューブの内側です。 （あなたが金のラインを取得する場合、金が定着した後で速い速度でチューブから上清を引き出すと窒素の電源を入れる前に、金の長い回転させる。一方、あなたが金のストリーキングを取得している場合、 、この可能性が高い弾丸の生成時にあまりにも多くの水分への暴露によるものです：チューブは塗装前に完全に乾いていることを、あなたがエタノールの未開封の瓶を使用していることを確認し、）あなたがふたをキャッピングし、適時に弾丸を準備している。 </li></ul>トランスフェクション効率が最適と思われる場合は（＃細胞が/スライスをトランスフェクト）が、発現レベルが高すぎるまたは低すぎるようだ。 <ul><li>金に比率のDNAを調整してください。 （それが低すぎる場合、例えば、金の量を維持するが、DNAの量を増やす 。） </li><li>撮影とデータ収集間の時間の量を調整する</li></ul>あなたの構成のいずれかの少なすぎる表現を取得する場合二重トランスフェクションの場合には、、適切な方法で2つの構成要素の比率を調整し、両方の構造が同じプロモーター下にあることを確認して、あのことを確認するようにプロモーターは、他の域外競合しません。

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆した金粒子による生体組織の砲撃を経由して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。弾丸が核内に静止する時、粒子による遺伝子導入では、一般的なトランスフェクションされた細胞になる。多くの異なるトランスフェクション法が存在するが、そのようなマイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションおよびウイルス性トランスフェクションとして、バイオリスティックトランスフェクションは簡単にこれらの他の方法を用いてトランスフェクトしていない細胞をトランスフェクトするための集中的な少ない労働力、および効率的な代替手段を提供することができます。細胞壁の存在は、既存の方法1を使用してトランスフェクションが困難になるので、実際には、まず、植物に遺伝子導入する技術として開発されました。有糸分裂後のニューロンは2,3をトランスフェクションが難しいことで知られていますので、同様に、biolisticsは神経生物学の分野で人気を博している。特に、それは広く無傷の脳スライス内の単一ニューロンの微細な形態を評価することを目的とした実験に使用される原理の手法として認識されます。方法は、遺伝子銃保有の手を（; Bio - Rad社ヘリオス遺伝子銃システム）を使用して培養脳スライスの微粒子銃トランスフェクションを実行する方法の詳細かつ包括的な説明を提供するここで説明する。 それは脳スライス中の細胞の疎な数のトランスフェクションを可能にするため微粒子銃トランスフェクションは、スライス培養で神経細胞をトランスフェクションするための好ましい方法となっています。この方法では、個々の神経細胞は単独で調べることができます。この技術は特によく脳スライスの神経細胞のトランスフェクションに適しているため、それはしばしば、2光子顕微鏡と組み合わせて使用されている、2光子励起以来、光散乱の組織4内の深い蛍光標識細胞の可視化を可能にします。確かにこの映像を通して紹介単錐体細胞の高倍率の画像は、カスタム構築された2光子レーザー走査顕微鏡を用いて捕獲された。結論微粒子銃トランスフェクションでは周囲の細胞の高密度のコンテキスト内で個々の細胞にトランスフェクションの効率的な手段であり、そのように蛍光神経スライス培養で個々のニューロンを標識するための非常に役立っています。

我々は個別にすべての製品をリストアップしたものの、それは、BIO - RAD（猫＃165から2431まで）上記のすべての製品に含まれる、&quot;遺伝子銃システムヘリオス&quot;を購入するより経済的です。

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆粒子と組織を照射して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。我々はDNAコーティングされた弾丸の初期準備から遺伝子銃を用いて器官切片培養の最後の撮影に、ラット海馬スライスの微粒子銃トランスフェクションのための詳細なプロトコルを提供しています。遺伝子銃のトランスフェクションは、神経細胞をトランスフェクトの効率的かつ容易な手段であると蛍光組織切片中の細胞の小さなサブセットを標識するために特に便利です。このビデオでは、まず、DNAで被覆金粒子に必要なステップを概説。我々は、次のゴールド/ DNA銃弾のプラスチックチューブの内側を並べる方法を示し、および遺伝子銃にロードするためのプラスチック製のカートリッジを取得するために、このチューブをカットする方法。最後に、我々は、遺伝子銃をヘリオス、そして健康的で最適にトランスフェクトされた組織切片を得るためにトラブルシューティングのアドバイスを提供するバイオラッドの処理を示す、ラット海馬スライス培養のバイオリスティックトランスフェクションを実行します。

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

我々は、DNAコートした金の弾丸の製造方法を説明し、biolistically培養海馬スライスの神経細胞をトランスフェクトするためにそのような弾丸の使用方法を示しています。

遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

52.2K ビュー.  University of California, Davis. 我々は、DNAコートした金の弾丸の製造方法を説明し、biolistically培養海馬スライスの神経細胞をトランスフェクトするためにそのような弾丸の使用方法を示しています。

ビデオ: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

網膜の水平スライス標本

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

生物学

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

海馬ニューロンの遺伝子郡のトランスフェクション

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18ラット脳の器官型スライス培養

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

コンパートメント文化の後根神経節ニューロンの準備とメンテナンス

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

マウス胎児の腎臓の腎性帯からの細胞の単離と培養

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.