この方法により、皮質インターニューロン前駆体の成熟に対する内在活性の影響を研究することができる。この技術は、大多数の科学界がアクセスできる皮質インターニューロン前駆物質の細胞特性を標的にして操作するための効率的な方法を提供する。このプロトコルは、サンプルと機器の細心の注意を払って処理を伴い、視覚的なデモンストレーションで最もよく理解することができます。
防水ペンを使用して、6つの35ミリメートルペトリ皿の底面の底部の中央に直線を描きます。PBSの液体4%低ゲル化アガロースの10ミリリットルを35ミリメートルのペトリ皿の2つに加え、アガロースに3〜4個の解剖された脳を埋め込み、嗅球が1皿あたりを下に向け、各サンプルの間に3〜5ミリメートルのスペースを残します。すべての脳が埋め込まれたら、アガロースが3つの脳を凝固させ、アガロースの単一のブロックに彫り込み、サンプルの端の周りに約3ミリメートルのゲルを残すために、皿を摂氏4度に置きます。
ミクロトームベースの表面にブロックを接着し、外科用ブレードを使用して、各組織サンプル間のブロックの底部を切り取り、3つの独立したブロックを得ます。次に、振動ブレードミクロトームを使用して、氷冷クレブス溶液のブロックを250マイクロメートルの厚いスライスに切り離し、曲がった平らなマイクロスパチュラを使用して、内側または尾根神経節性エミネンスを含むスライスのみを収集します。次に、個々のポリスチレンセンターウェル臓器培養皿の最小必須培地に浮かぶ個々の13マイクロメートルの直径、8マイクロメートルの孔サイズフィルター膜に各セクションを置きます。
すべての切片が得られたら、1時間摂氏37度の二酸化炭素組織培養インキュベーターに皿を入れる。焦点DNA注入の前に、1ミリメートルの直径、10ミリメートルの長いアガロースカラムをガラス長225ミリメートル、2ミリリットル容量のガラスピペットで氷の冷たいクレブス溶液に入れます。外科用ブレードを使用して、エレクトロポレーション電極の表面に収まるように1つの小さなアガロース片を切断し、焦点DNA注射のベースとして使用する1つの大きな部分を切断する。
次に、アガロースブロックを氷冷クレブス溶液に入れる。注射の場合、発現および制御ベクターDNAを各ベクターのマイクロリットル濃度あたり1マイクログラムで混合し、1~10回目の希釈で高速グリーンストック溶液を追加します。引っ張られた0.5ミリメートルの内径、1ミリリットルの外径ガラスマイクロピペットに10マイクロリットルのDNA混合物を充填し、マイクロピペットを空気圧ピコポンプインジェクターにロードします。
アガロースの大きなブロックをステレオ顕微鏡の下に置き、注射するスライスをアガロースの部分に置きます。次いで、スライスの選択された内側神経節または尾膜神経節性の有数体領域に25〜50ナノリットルの体積を注入する。注入の直後に、ペトリ皿電極に小さなアガロースブロックを置き、平らなエンドマイクロスパチュラを使用してアガロースカラムを移動式カバー電極に取り付けます。
注射したスライスを支持膜をアガロースブロックに移し、スライスの選択領域の上にアガロースカラムを持つ上部電極を置きます。次に、500ミリ秒離れた125ボルトの2つの5ミリ秒パルスで領域を電気ポレートします。エレクトロポレーションの後、支持膜を持つスライスを保持皿に戻し、皿を組織培養器に戻します。
1時間後、最小必須培地を一次神経細胞培養に適した基本的な培地に置き換え、スライスを一晩インキュベーターに戻します。これらのエレクトロポレーション実験では、約50%のGFP陽性ニューロンがRFP陽性注入タンパク質を同時発現し、したがって、GFP陽性RFP陰性集団が注入されたDNAリガンドの効果に対する内部制御として役立った。クロザピンおよび酸化物投与は、これらの新生児コロナ組織切片における活性依存性タンパク質c−Fosの発現によって示されるように、トランスフェクトRFP陽性細胞の活性を選択的に増加させる。
クロザピンおよび酸化物処理はまた、投与されたごみ類に比べてGFP陽性RFP陰性細胞の数に対するGFP陽性RFP陽性細胞の割合の増加をもたらす。この手順は、宿主の循環可塑性および脳機能に及ぼす活動変調移植性インターニューロンの影響を研究するために使用することができる。
