細菌の光力学的不活性化における光活性分子を評価するためのLEDベース In Vitro スクリーニング

私の研究は、天然および合成の両方のフラビリウム化合物ファミリーからさまざまな分子を探索することに焦点を当てており、UV光防護の文脈でのそれらの生物活性を研究し、光線力学療法アプリケーションの光増感剤としての可能性を評価することに中心的な関心を持っています。私たちの研究グループの最近の発見は、アミノベースのフラビリウム色素の光活性化特性を実証し、それらを有望な新しいクラスの光増感剤として確立しました。これらの化合物は、さらなる探索の大きな可能性を示しており、この分野での革新的なアプリケーションへの道を切り開きます。

96ウェルマイクロプレートおよびライトパネルシステムを使用することで、制御された環境で光増感剤のハイスループットスクリーニングを行うことができ、光線力学療法のさまざまな候補間の同定と比較が容易になります。まず、停止培養からMueller-Hinton寒天プレートに黄色ブドウ球菌菌を導入します。プレートを摂氏37度で24時間インキュベートして、新鮮な培養物を得ます。

寒天プレートから2〜3個の新鮮なコロニーを採取し、pH 7.4で6ミリリットルの予熱滅菌滅菌ろ過PBSで希釈します。1、200回転/分で接種物を3〜4サイクルで渦巻いてサンプルを均質化し、均質化された接種物の3ミリリットルを使い捨てキュベットに引き込みます。600ナノメートルで光学密度を測定した後、PBSを使用してサンプルを0.1の光学濃度に一致するように希釈します。

感光剤化合物の原液をDMSOやPBSなどの適切な溶媒に調製します。ストック溶液をPBSで希釈して作業溶液を作成し、細菌培養培地の成分が光の吸収を妨げないようにします。作業溶液をボルテックスして、完全な均質化を確保します。

まず、黄色ブドウ球菌懸濁液と光増感剤化合物の作業溶液を準備します。2つの別々の96ウェルプレートを準備し、1つは光露光用、もう1つは暗部制御用です。各プレートに、光増感剤溶液と細菌懸濁液をそれぞれ100マイクロリットル分注します。

溶液をピペットで5〜10回混合します。プレートを摂氏37度で30分間インキュベートし、光増感剤が細菌細胞と相互作用するようにします。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出します。

プレートの1つを光の露出から保護し、ダークコントロールとして保管してください。もう一方の96ウェルプレートを長方形の50ワットLEDパネルの上に置きます。プレートの端をLED表面に印を付けて、プロトコルの繰り返し間で一貫した配置を確保します。

プレートをLEDライトに約15分間さらします。別の96ウェルプレートを使用して、コントロールウェル、非照射ウェル、照射ウェルを含むサンプルの段階希釈液を調製します。サンプルの数に応じて、各ウェルに180マイクロリットルのPBSを追加します。

照射済みプレートと非照射プレートの各ウェルから20マイクロリットルをPBS充填プレートの最初のカラムに分注します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、ウェル1から6までの簡単な段階希釈を行います。寒天プレートを6つの等しいセクションに分割し、各セクションは希釈液の1つに対応します。

各ウェルから10マイクロリットルを寒天プレートの対応する部分に分注します。プレートを18〜20時間インキュベートします。インキュベーターから寒天プレートを取り外し、コロニーカウントに適した領域を特定します。

オーガープレートの各セクション内で、コロニー形成ユニットの数を数えます。可視光範囲スペクトルは、400ナノメートルから700ナノメートルの間に3つの異なるピークを示しました。暗い条件下では、試験されたフラビリウム化合物はいずれも細胞毒性作用を示しませんでした。

対照的に、光曝露後、試験された化合物は黄色ブドウ球菌の生存率を用量依存的に低下させ、6マイクロモルおよび12マイクロモルの濃度で有意な影響が観察されました。