この作品は、イスラエル農業 (#16-16-0003) 省の主任研究員からの助成金によってイスラエル省、科学、技術およびスペースによって支えられました。

1. 植物材料と成長条件
<ol><li>5 cm × 5 cm ポット当たり種子 1 つタバコ (品種サムスン) は標準的なポットの中に満ちています。トレイにポットを置きます。23 ° C の一定温度で長い一日 (16/8 h/暗) 条件の下で成長部屋の植物を育てるポットから排水まで水道水で灌漑します。</li>
	<li>50±5 日後、実験用に最適の濃度によると、灌漑で Fe 治療を開始します。たとえば、0 から 6 mm、可溶性鉄キレート剤 (Fe EDDHA) によって補われる鉄濃度の範囲を使いました。水を引く適切なソリューションが付いている植物 2 日毎 (脱水症状を避けるため) に 6-8 日の。</li>
</ol>2. 鉄測定葉の準備
メモ: 使用するすべての材料がある必要があります鉄無料の鉄汚染.の危険性を減らすために4% 塩酸溶液で 2 回すりこぎをきれいにし乾燥ろ紙を使用する前にするたびに。任意の材料を再使用する場合二度 4% 塩酸溶液とそれをきれいにしろ紙を乾燥します。
<ol><li>手袋 (任意の金属の装置を使用して) を使用して、手で茎から葉をデタッチします。各サンプルの葉 (生体重) 約 10 g を使用します。スプレー ボトルを使用して二重蒸留水 (DDW) 各葉をきれいに。この手順は、鉄の汚染を防止することが重要です。</li>
	<li>ペーパー タオルの上葉を乾燥し、紙の袋に入れてください。80 ° C の一定温度でオーブンに 2 〜 3 日の紙バッグを転送します。</li>
	<li>乾燥時、モルタルと乳棒と滅菌 15 mL プラスチック チューブに転送を用いた粉体に葉を粉砕します。</li>
</ol>3. 燃焼灰の葉
ノート: HCl (0) に近い低 pH 溶液の使用は、鉄の溶解度を増すものです。岩綿は、ガスが燃焼中にバイアルを脱出することを防ぐために使用されます。
<ol><li>その蓋なしの新しい、密封された 20 mL シンチレーション バイアルの重量を量る。値に注意してくださいまたはゼロ、風袋のボタンを使用して値を設定します。バイアルに砕いた乾燥葉 (サンプル) を追加します。</li>
	<li>サンプルとコンテナーの重量を量るし、値に注意してください。ロックウールでバイアルを閉じます。</li>
	<li>サンプルを追加することがなく 3 追加バイアルの重さし、その値に注意してください。これらのバイアルは、試料重量の増加につながっている可能性がありますロック ウールの量を評価するコントロールとして使用されます。</li>
	<li>炉内サンプルとコントロールのバイアルに置き温度以下を使用して書き込みを開始: 部屋の温度、高速 4 時間増資 425 ° C、および、最終的に、425 ° C。この時点で、乾燥した葉は灰になっているでしょう。</li>
	<li>約 100 ° C にダウン サンプルを冷ますがない、この温度湿度を避けるために次の 2 つの手順のため、以下は、サンプルの最終的な重量を影響するかもしれない。厚手の手袋を使用して、ピンセット、内方バイアルを保持炉からサンプルを削除します。</li>
	<li>バイアルを平らな面に配置、岩綿を削除し、元の蓋と瓶を閉じます。</li>
	<li>3 コントロール バイアル (3.3 を参照) の重量を量るし、自分の平均体重を計算します。体重増加が等しい場合または上記灰重量の 1% に (手順 4.2 を参照)、測定誤差の推定値としてこの値を使用します。</li>
</ol>4. 鉄測定の灰を準備
メモ: 初期サンプルの最終的な鉄濃度は塩酸の量で割った灰の重量として計算されます。
<ol><li>1 M 塩酸溶液を準備 (4 %hcl) (プラスチックまたはガラス フラスコ) の DDW の 87.5 ml 12.5 mL 37% 塩酸原液を追加することによって。</li>
	<li>15 mL プラスチック チューブの重量を量ると値に注意してくださいまたは、風袋のボタンを使用してゼロ値に設定。遺灰を転送管、計量、そして値をメモします。これは、灰の重量です。</li>
	<li>灰の中に 1 M 塩酸 5 mL を追加します。22 μ m フィルターをフィルターして灰と同じフィルターを使って 1 M HCl の追加 5 mL を追加します。</li>
	<li>最終巻は 10 mL をする必要があります。フィルターにソリューションの一部が失われることに注意してください。 注: サンプルは、FAAS またはプルシアン ブルー法による Fe 測定する準備が整いました。</li>
	<li>Fe 濃度で検量線プルシアン ブルーによる原子吸光法によって測定する (図 4を参照) の各植物種。その後、単独でプルシアン ブルー法による Fe 濃度が測定できます。</li>
</ol>5. FAAS により Fe 濃度の測定
<ol><li>FAAS による測定の各サンプルから 4 mL を削除します。</li>
	<li>灰の重さで FAAS 測定から得られた結果を分割します。(灰は 10 mL で溶いた) ので、0.01 で結果の値を分割します。結果の値はグラム灰 (ppm) ごとの鉄濃度です。</li>
</ol>6. プルシアン ブルーの染色液の準備
<ol><li>4% を準備 K4Fe(CN)6を 100 mL DDW と渦の 4 g を追加することによってソリューションをプルシアン ブルー (他のボリュームおよび/または濃度使用できます別の要求)。本研究ではより少なく集中することプルシアン ブルーのソリューションよりも以前に報告された (20%)14が使用されたことに注意してください。</li>
	<li>暗闇の中で使用されるまでの 4 ° C でのソリューションを保持します。ソリューションは、このような条件で保存する場合、6 ヶ月間安定です。</li>
</ol>7. FAAS 結果を用いたプルシアン ブルーの較正曲線の生成
注: 次の式を使用して灰の鉄濃度を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">式 1 C: 濃度、v: サンプル ボリューム w: 灰重量 (g) です。
<ol><li>プルシアン ブルーのソリューション、1 M HCl の 0.50 mL 0.50 mL を混ぜます。これは、空のソリューションとなります。</li>
	<li>サンプルの 0.5 mL を混ぜる (4% 灰 HCl、セクション 3 で説明したよう)、ピペッティングによるプルシアン ブルー溶液 (ステップ 6.1) の 0.5 mL。しかし、最低 1 分間、5 分を待ちます。5 分後のサンプルで沈降が発生します。</li>
	<li>キュベットにミックスを転送し、715 で外径を測定分光光度計を用いた nm。値に注意してください。</li>
	<li>サンプルの灰重量 (ステップ 3.2) OD 値 (ステップ 7.3) を分割します。結果は、グラム灰あたり外径を表します。</li>
	<li>FAAS 測定 (Y 軸) と OD 値から得られる鉄濃度の線形回帰のプロット (X 軸) です。5.2 と 7.4 手順で取得した結果を使用します。回帰式は、Y を計算する =、+ bX、Y が鉄濃度、吸光度が交差する表します、b を表す吸光度斜面を表し X OD。</li>
</ol>8. 同じ植物のタイプから他のサンプルの鉄のレベルを決定するためプルシアン ブルー メソッドを使用してください。
メモ: この種の植物に、検量線は既に確立されて、以来同じ植物のタイプから任意の新しいサンプルの鉄濃度直接計算できます線形回帰式を使用します。
<ol><li>3 と 4 の手順 7.1 7.4 に続いてのセクションで手順に従います。</li>
	<li>線形回帰 (ステップ 7.5) から得られた式を使って、溶液中の鉄の濃度を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

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植物組織の鉄の測定は、灌漑や他の環境条件の影響を評価するために非常に重要です。ここでは、他の植物種や組織に容易に合わせることができるタバコ葉における Fe コンテンツ測定のための簡単で正確な比色定量法について述べる。
比色法のための条件を最適化する、鉄の溶解性を許可するように低 pH 媒体 (pH < 1.0) を使用しました。書き込み処理を行った鉄のすべてのフォームを解放し、汚染物質のサンプルで現在が結果を変更できません。については鉄汚染、1 つ留意すべき地球の地殻の 6.7% に酸化鉄 (FeOn) の種21が装備されていること、その濃度が植物の乾燥重量220.009% に達することができます。したがって、1 つは、ほこりは、できるだけ多くの 3 〜 7% (地域) によって鉄23、大きく結果に影響を与えることができますので、汚染のリスクを検討してください。また、実験で使用されるすべての装置の鉄含有量を慎重に確認し、汚染を避けるためにすべての必要な予防措置を取ることが不可欠です。空気と接触していたまたは 4% 塩酸水溶液の実験で再利用されていますがすべての装置をきれいにすることをお勧めします。はさみやスプーンなどあらゆる金属ツールを使用して避けるべきである完全、代わりにガラスまたはプラスチック バージョンに置き換えられます。鉄の汚染を避けるための重要なステップがたとえば手順 3.1 と 4.1 で強調表示されます。
サンプルから信号を取得する失敗は、プロトコルの各段階で発生する問題のため発生します。このインスタンスでは、知られている鉄濃度とソリューションに対して試薬をチェックすることをお勧めします。問題が解決しない場合新鮮なプルシアン ブルー試薬を準備する必要があります。標準では、ただし、シグナルを示す必要がありますこのサンプルの鉄濃度が検出しきい値を下回ることを示し、サンプルがより集中する必要があります。複製の間で大きな変動は鉄汚染から生じるし、新しいサンプルの使用が必要になります。
検量線は 6 ヶ月ごと生成が必要またはプルシアン ブルー試薬のバッチが使用されるたびに、新しい。初期校正曲線の少なくとも 6 試料中の鉄の含有量を測定し、線形回帰がまだ正しいことを確認して再検証。検、+1 や-1 r (相関係数) に近い、R2 (決定係数)24,25,26の 1 に近い値を得るために不可欠です。完璧なラインは、1 R2値を持っているだろう、0.95 以上 R2値のほとんどは、較正曲線の許容されます。
プロトコルの制限は、異なる植物細胞および種は鉄の集中の決定のため記載されている手順を使用して異なる相関曲線を表示ことがありますという事実があります。したがって、相関曲線が与えられた実験の正確なことを確認するためにパイロット テストを実行することをお勧めします。Y の数式で、得られた結果の曲線を使用する測定した OD 値が代入する必要があります =、+ bX。今回のケースでは、次の数式が使用された: [Fe] = 0.32 + 25.3 x OD。
別の制限は、植物組織のかなり大きい量の必要性から発生します。これは、適切な信号を取得するために (手順 5.3 参照) 灰を溶解する HCl ボリュームを適応することによりある程度回避できます。それにもかかわらず、ここで説明する方法は良いオプションです ICP-MS、FAAS 準備ができてアクセスの使用などの高価な装置はない利用可能なおよび/または同じ植物種のさまざまなサンプル、分析する場合。
鉄検出システムとしてプルシアン ブルーの方法の可能な追加アプリケーションは、灰をもたらすことができます任意の有機材料だけでなく土壌などの無機物質、定量的鉄検出機能を搭載します。

鉄 (Fe) は、すべての生物に重要な微量栄養素です。植物の呼吸、光合成とクロロフィル生合成などの基本的なプロセスに関与のため必須微量栄養素1についてです。無料鉄多価イオンの高集積植物細胞酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルのリリースにつながる反応のために有害です。植物細胞内鉄の恒常性を維持するために、イオンは液胞に格納され、フェリチン、鉄の恒常性2に直接関与するタンパク質ケージおよびすべての生きている有機体の鉄の主要な記憶域構造内で隔離。同時には、鉄欠乏性貧血は、植物鉄 biofortification の増加が必要で、その結果、人間の人口のかなりの割合を影響します。植物フェリチンのユニークな性質上、フェリチン鉄食品濃縮栄養失調3のこの問題を戦うために有望な戦略を提供しています。
鉄イオンは、主に 2 つ酸化状態、すなわち鉄 (2価 Fe2 +または鉄 (II))、鉄 (三価 Fe3 +または鉄 (III)) フォーム。鉄、鉄クラスター4などのいくつかの他の形態はまた細胞であります。Fe はセルと自然フォーム ヘマタイト (Fe2O3) と ferryhidrites 内の酸化鉄として格納されます ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O)5生理学的な条件の下で。これらの反応は、特に鉄のフォームに形成された水酸化物非常に低い容解性があります。鉄保持は、pH 56上固体状態で主はその結果、溶液の pH によって影響を受けます。
溶解性が悪い、Fe の高反応性を考慮した植物組織や器官の間での転送が適切なキレート分子と関連付ける必要があります。また、鉄と鉄のフォーム1の間の酸化還元状態を制御する必要があります。葉、内鉄の約 80% は、電子伝達系、チトクローム、葉緑素と他のヘム分子の生合成に重要な役割はそのための光合成細胞で発見され、鉄 S の形成におけるクラスター7。セル内の余分な鉄の場合、黒字はフェリチン分子8金属が保存されている液胞に転流します。
鉄は、いくつかの方法、含む火炎原子吸収分光法9 (FAAS) または比色試金10, 前者は後者よりもはるかに正確な植物組織で測定できます。FAAS は、個々 の要素の電磁放射に基づくサンプルの元素組成を決定することができる精度の高い手法です。FAAS に変換します金属イオン原子状態のサンプルでは、炎加熱による特定イオンの基底状態に戻るときに特定の波長のイオン励起と放射に 。別のイオンからの排出量は、分光器で区切られ、吸収センサー11によって検出されました。したがって、FAAS は直接鉄濃度を定量化する提供しています。しかし、生体組織中の鉄を可視化するための他の手法が利用できます。誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS)12は、鉄などの微量要素を測定するための非常に正確な技術、機器、FAAS と ICP-MS の両方の不足が共通問題。その一方で、チオシアン酸測色13による鉄の測定は、精度を欠いている、サンプル間の小さな変化を検出する失敗します。プルシアン ブルー染色14,15,16,17は鉄フェロシアン化カリウム (K4Fe(CN)6) 生産、鉄イオンとの反応に基づく間接法、青い色の強い、動物や植物の組織の組織学的セクションで質的な鉄の検出に使用されます。
金属 (ゼロ原子価) 鉄は、リソスフェアのまれです。環境中の鉄の支配的な非複合イオンの形態は、ほとんど無酸素環境で比較的より豊富である鉄と鉄有酸素サイトの色合いが強い、周囲の酸素の量によって決まります。鉄酸化の原因となるエージェントはしばしば無酸素、酸性環境18で異なるが、この後者の形式、非常に酸性環境で支配的なも。4% で鉄を溶解するとき HCl (pH 0) 好気性環境で、希薄化後の鉄の主要な部分として存在する、鉄 (Fe3 +)19,20を形成します。
鉄イオンと K4Fe(CN)6の反応は次のとおりです。
Fe3 +: した FeCl3 + K4Fe(CN)6 KFe(III)Fe(II)(CN)6̄ + 3KCl =
Fe2 +: 2 K4Fe(CN)6 + 4 のした FeCl2 = 鉄4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
本研究で我々 はプルシアン ブルー染色することができますソリューションの鉄のレベルを測定するために役立つかどうか尋ねた。
当初は、水溶液中の Fe の濃度とプルシアン ブルー染色の相関関係を検証しました。水溶液中で (した FeCl2、した FeCl3または 2 つの 1:1 混合物) として Fe 濃度は、プルシアン ブルーの付加の後で原子分光法と吸光度 (OD) の両方を測定しました。図 1は、それぞれの方法によって得られる測定の線形回帰曲線を示しています。溶液中の鉄濃度の定量分析のためプルシアン ブルーのメソッドを使用できますと結論づけた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> 図 1: FAAS と光の吸光度によって測定される Fe 濃度の線形回帰 (OD、715 nm) プルシアン ブルーによる得られた。青い正方形とラインは Fe2 +ソリューションを表す、赤い四角形と線 Fe3 +ソリューションおよび黒い正方形を表しライン Fe2 +と Fe3 +の間の 1:1 混合物。次の回帰が得られた: [Fe2 +] = 3 + 123 x 外径 r 0.996、R2 = = 0.989;[Fe3 +] = 1 + 292 x 外径 r = 0.999、R2 = 0.997;[Fe2 +/3 +] = 11 + 146 x 外径 r = 0.983、R2 = 0.956。Fe2 +ドナーした FeCl2 Fe3 +ドナーした FeCl3であった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
比色プルシアン ブルー植物組織の鉄の定量分析法を適応し、火炎吸収原子分光学とプルシアン ブルー染色によりタバコ葉灰の鉄含有量を測定しました。2 つの手法から結果の相関があった。

<table><tbody><tr><td>Potassium Hexacyanoferrate(II)</td><td>Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>Reagent for the Pussian Blue</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution</td></tr><tr><td>Scintillation Vials</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-4</td><td>Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.</td></tr><tr><td>Disposable Syringe 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>Syringe used during the filtration</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tobacco, Nicotiana tabacum&lt;/em&gt; cv. Samsun NN</td><td>Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab</td><td>Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.</td><td>Tobacco cultivar used in this protocol</td></tr><tr><td>Glass Wool (Rock Wool)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>Used in the procedure of burning samples in the furnace.</td></tr></tbody></table>

a colorimetric method for measuring iron content in plants

鉄生体内で最も重要な栄養素の一つは、呼吸や光合成などの基本的なプロセスに関与しています。鉄の含有量は乾燥重量の約 0.009% に相当する植物で、すべての生物で幾分低いです。日付、火炎吸収原子分光学植物組織中の鉄濃度を測定する最も正確な方法の一つです。ただし、この方法は時間がかかり、高価な一般的植物研究所は、特定の機器が必要です。したがって、日常的に使用することができます簡単に、まだ正確な方法が必要です。比色のプルシアン ブルー メソッドは、動物や植物の組織切片の染色質の鉄の定期的に使用されます。本研究では、タバコ中の鉄の定量計測法の葉プルシアン ブルーを適応.原子分光学と同じ試料中の鉄の含有量を測定し、線形回帰を発見する染色プルシアン ブルーの両方を使用してこのメソッドの精度を検証しました (R2 = 0.988) 2 つのプロシージャの間。我々 はプルシアン ブルーの植物組織定量的鉄測定法は正確な単純な安価な結論します。しかし、ここで紹介する線形回帰はサンプルと試薬の潜在的な相互作用のための他の植物種のために適切かもしれない。回帰曲線の確立は別の植物種にしたがって必要です。

このプロトコルは正しく実施される、1 つはプルシアン ブルーと原子分光法によって得られた結果と良好な相関性を得る必要があります。したがって、次の実験に反映は、植物試料中の鉄濃度の正確な測定を取得するプルシアン ブルーのメソッドを簡単に使用できます。
タバコがプロトコルに記載を栽培され、異なる鉄濃度を含む殺菌水で灌漑 (0、1、2、3、4、5、または 6 の mM) 7 日間。植物、収穫、洗浄、80 ° C で 3 日間の乾燥(すなわち、ステップ 2.3 から) プロトコルの次の手順は、説明されているように続いていた。コントロール バイアルは、灰の重量から 1% 未満の変動を示したので、この値がさらに計算に追加されませんでした。
鉄濃度は、FAAS により測定しました。表 1は、これらの測定の代表的な結果を示しています。(3 7 濃度がレプリケートされます) 21 サンプルから得られたデータは、較正曲線の生成に使用されました。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>治療 (灌漑 mM 鉄)</td>
			<td>工場</td>
			<td>HCl 鉄濃度 (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>A</td>
			<td>7.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>B</td>
			<td>16.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>C</td>
			<td>23.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>D</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>47.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>G</td>
			<td>50.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>H</td>
			<td>41.6</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: タバコの灰溶液中の鉄濃度の異なる鉄のレベルを含む殺菌水で灌漑の植物から葉します。
上記の 21 サンプルの灰の中に鉄の濃度は、FAAS (手順 7 でメモを参照) によって得られた値を使用して求めた。灌漑用水中の鉄濃度が大きく葉鉄含有量 (図 2) に影響を受けることがわかった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig2.jpg"> 図 2: 葉たばこの鉄濃度に灌漑でアイロンの影響。バーを表す標準偏差 (n = 3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
Fe2 +と Fe3 +の異なる濃度の溶液の吸光スペクトルを測定した予備実験 (図示せず)、および 715 で最良のピークが得られた nm。また、プルシアン ブルーによる 21 サンプルのすべてのスペクトルがテストされました。715 でその吸光度を明確だった nm は最適な波長でまたここにも (図 3)。したがって、この波長はすべての実験で使用されました。
線形回帰曲線は、FAAS によって得られた鉄濃度値と図 3 (図 4) で表されるサンプルのプルシアン ブルーのメソッドを用いて吸光度 (OD) 値のプロットしました。次の回帰が得られた: [Fe] = 0.32 + 25.3 x 外径、r = 0.994 と R2= 0.988。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig3.jpg"> 図 3: 吸光度波長スペクトル タバコの灰を混ぜてプルシアン ブルー ソリューション プロトコルで説明されているようです。波長スペクトルは、灰の濃度によって分けられました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig4.jpg"> 図 4: FAAS と光の吸光度によって測定されるタバコの灰の Fe 濃度の線形回帰 (OD、715 nm) プルシアン ブルー法によって得られた。次の回帰を求めた: [Fe] = 0.32 + 25.3 x 外径 r = R20.994 0.988 を =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
手順 8 で述べたように今同じ植物のタイプから新しいサンプルの得られた線形回帰を使用できます。

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A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

比色のプルシアン ブルーを用いた植物組織の鉄含有量を測定するための簡潔かつ信頼できるプロトコルを提案します。

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

a-colorimetric-method-for-measuring-iron-content-in-plants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

22.0K ビュー.  Ben-Gurion University of the Negev. 比色のプルシアン ブルーを用いた植物組織の鉄含有量を測定するための簡潔かつ信頼できるプロトコルを提案します。

ビデオ: A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

環境学

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of nitrogen-containing plant defensive compounds, and variation in species-specific correlations between nitrogen and plant protein content all limit the accuracy of these inferences. Additionally, research focused on plant and/or herbivore physiology require a level of accuracy that is not achieved using generalized correlations. The methods presented here offer researchers a clear and rapid protocol for directly measuring plant soluble proteins and digestible carbohydrates, the two plant macronutrients most closely tied to animal physiological performance. The protocols combine well characterized colorimetric assays with optimized plant-specific digestion steps to provide precise and reproducible results. Our analyses of different sweet corn tissues show that these assays have the sensitivity to detect variation in plant soluble protein and digestible carbohydrate content across multiple spatial scales. These include between-plant differences across growing regions and plant species or varieties, as well as within-plant differences in tissue type and even positional differences within the same tissue. Combining soluble protein and digestible carbohydrate content with elemental data also has the potential to provide new opportunities in plant biology to connect plant mineral nutrition with plant physiological processes. These analyses also help generate the soluble protein and digestible carbohydrate data needed to study nutritional ecology, plant-herbivore interactions and food-web dynamics, which will in turn enhance physiology and ecological research.

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

The protocols described herein provide a clear and approachable methodology for measuring soluble protein and digestible (non-structural) carbohydrate content in plant tissues. The ability to quantify these two plant macronutrients has significant implications for advancing the fields of plant physiology, nutritional ecology, plant-herbivore interactions and food-web ecology.

植物性の水溶性タンパク質と消化性炭水化物含量の手本として使用してトウモロコシ (トウモロコシ) の定量化

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

化学

<meta charset="utf8"></head><body>新規鉄キレート剤の検出のための蛍光アッセイ

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target for anti-cancer approaches. The development of novel compounds and the identification of leads for further modification requires that proof of mechanism assays be carried out. There are many assays to evaluate the impact on proliferation; however, the ability to chelate iron is an important and sometimes overlooked end-point measure due to the high costs of equipment and the challenge to quickly and reproducibly quantify the strength of chelation. Here, we describe a quantifiable and inexpensive cell-free fluorescent method to confirm the ability of novel compounds to chelate iron. Our assay relies on the commercially available inexpensive fluorescent dye Calcein, whose fluorescence can be quantified on most fluorescent microtiter plate readers. Calcein is a weak iron chelator, and its fluorescence is quenched when it binds Fe2+/3+; fluorescence is restored when a novel chelator outcompetes Calcein for bound Fe2+/3+. The removal of fluorescent quenching and the resulting increase in fluorescence allows the chelation ability of a novel putative chelator to be determined. Therefore, we offer an inexpensive, high-throughput assay that allows the rapid screening of novel candidate chelator compounds.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:新規鉄キレート剤ががん細胞代謝に与える影響の評価

We describe a fluorescent assay that can quickly and inexpensively confirm the ability of novel compounds to chelate iron. The assay measures the ability of compounds to outcompete the iron binding activity of the weak iron chelating fluorescent probe Calcein, resulting in a quantifiable increase in fluorescence when chelation occurs.

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

がん研究

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

医学

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal iron endowment is entirely dependent on iron transfer across the placenta, and perturbations of this transfer can lead to adverse pregnancy outcomes. In mice, measurement of iron fluxes across the placenta traditionally relied on radioactive iron isotopes, a highly sensitive but burdensome approach. Stable iron isotopes (57Fe and 58Fe) offer a nonradioactive alternative for use in human pregnancy studies.
Under physiological conditions, transferrin-bound iron is the predominant form of iron taken up by the placenta. Thus, 58Fe-transferrin was prepared and injected intravenously in pregnant dams to directly assess placental iron transport and bypass maternal intestinal iron absorption as a confounding variable. Isotopic iron was quantitated in the placenta and mouse embryonic tissues by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). These methods can also be employed in other animal model systems of physiology or disease to quantify in vivo iron dynamics.

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

This article demonstrates how to prepare and administer transferrin-bound nonradioactive isotopic iron for studies of iron transport in mouse pregnancy. The approach for quantifying isotopic iron in fetoplacental compartments is also described.

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤 を 横切る鉄輸送の定量

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal ...

生物学

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

食品鉄バイオアベイラビリティ測定のためのCaco-2細胞バイオアッセイ

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

Introduction to Mass Spectrometry

Source: Laboratory of Dr. Khuloud Al-Jamal - King&#39;s College London

Mass spectrometry is an analytical chemistry technique that enables the identification of unknown compounds within a sample, the quantification of known materials, the determination of the structure, and chemical properties of different molecules.
A mass spectrometer is composed of an ionization source, an analyzer,&#160;and a detector. The process involves the ionization of chemical compounds to generate ions. When using inductively coupled plasma (ICP), samples containing elements of interest are introduced into argon plasma as aerosol droplets. The plasma dries the aerosol, dissociates the molecules, and then removes an electron from the components to be detected by the mass spectrometer. Other ionization methods such as electrospray ionization (ESI) and matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) are used to analyze biological samples. Following the ionization procedure, ions are separated in the mass spectrometer according to their mass-to-charge ratio (m/z), and the relative abundance of each ion type is measured. Finally, the detector commonly consists in an electron multiplier where the collision of ions with a charged anode leads to a cascade of increasing number of electrons, which can be detected by an electrical circuit connected to a computer.
In this video, the procedure of ICP-MS analysis will be described by the detection of 56Fe as an example.

植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

要約

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RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

植物性の水溶性タンパク質と消化性炭水化物含量の手本として使用してトウモロコシ (トウモロコシ) の定量化

鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤を横切る鉄輸送の定量

食品鉄バイオアベイラビリティ測定のためのCaco-2細胞バイオアッセイ

質量分析への紹介

植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

要約

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鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤 を 横切る鉄輸送の定量

食品鉄バイオアベイラビリティ測定のためのCaco-2細胞バイオアッセイ

質量分析への紹介

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤を横切る鉄輸送の定量