Cette recherche vise à mieux comprendre les protéines sans marquage au niveau d’une seule molécule en temps réel, en mettant l’accent sur les protéines qui sont difficiles à étudier à l’aide des techniques actuelles ou qui sont pertinentes pour la maladie. Les nanopinces plasmoniques ont récemment démontré leur capacité à surveiller la dynamique conformationnelle lors de la liaison à de petites molécules, à vérifier la cinétique de désassemblage et à élucider les paysages d’énergie libre, le tout au niveau de la molécule unique. À l’heure actuelle, aucune technique de caractérisation des protéines établie n’est capable d’étudier la dynamique conformationnelle des protéines à molécule unique sans marquage.
On pense que les nanopinces plasmoniques ont le potentiel de remplir ce créneau dans le domaine. Cet avantage unique nous aide à étudier la relation entre le changement de conformation des protéines et leurs fonctions biologiques, ainsi que les implications dans le développement de la maladie. Les recherches futures se concentreront sur les protéines intrinsèquement désordonnées et membranaires, car beaucoup d’entre elles sont impliquées dans plusieurs maladies telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et divers cancers.
Pour commencer, placez l’échantillon revêtu de PEG-thiol dans la cellule d’écoulement imprimée en 3D à l’aide d’une pince à épiler droite, en veillant à ce que la couche d’or soit tournée vers le haut. Décollez un côté du couvercle du ruban adhésif double face en plastique PET transparent. Placez soigneusement le ruban sur l’échantillon et la cellule d’écoulement, en vous assurant que les nanostructures et les trous d’entrée/sortie de la cellule d’écoulement restent découverts.
À l’aide d’une pince à épiler arrondie, appuyez doucement sur les bords du ruban pour garantir son adhérence à la cellule d’écoulement et à l’échantillon. Décollez l’autre côté du ruban adhésif et placez délicatement une lamelle en verre sur l’échantillon. À l’aide d’une pince à épiler arrondie, appuyez sur les bords de la lamelle pour assurer son adhérence.
Ce processus crée un canal liquide à l’intérieur de la cellule d’écoulement d’une hauteur de 50 micromètres et d’un volume de 3,5 microlitres. À l’aide d’une petite pointe de pipette, mélangez à parts égales la solution A et la solution B du silicone dupliqué sur une lame de microscope dans un rapport de un pour un ou selon les spécifications du fabricant. Remplissez les espaces entre la lamelle et la cellule d’écoulement avec un silicone à duplication mixte, en le poussant doucement sous la lamelle.
Tenez la cellule d’écoulement à l’envers et appliquez soigneusement du silicone dupliqué autour de la paroi intérieure du trou. Déplacez doucement le silicone sur les bords visibles de la face inférieure de la silice fondue de l’échantillon, en laissant l’échantillon sécher avec la couche d’or vers le haut jusqu’à ce que le silicone dupliqué ait complètement pris. Après avoir vérifié que tous les composants sont correctement connectés, chargez l’interface utilisateur du système microfluidique sur l’ordinateur.
Cliquez sur l’icône de lecture à côté du distributeur MUX et du fil, qui contrôlent respectivement la vanne rotative 12 par un et la vanne trois par deux voies pour ouvrir leurs interfaces correspondantes. Pour contourner la vanne trois par deux voies, allumez le premier port du fil. Pour monter la cellule d’écoulement dans des nanopinces plasmoniques, fixez les tubes d’entrée et de sortie aux parties appropriées de la cellule d’écoulement.
Placez la cellule d’écoulement sur un tissu propre avec la couche d’or vers le haut. Infusez le tampon dans la cellule d’écoulement à un débit élevé d’environ 0,3 millilitre par minute. Vérifiez que le fluide se déplace à travers l’échantillon à l’intérieur de la cellule d’écoulement et qu’aucun liquide n’est visible à l’extérieur ou en dessous.
Appliquez une à deux gouttes d’huile d’immersion sur l’objectif 100X. Placez la cellule d’écoulement dans l’étape de nanopince plasmonique avec la couche d’or vers le bas. Fixez la cellule d’écoulement à l’aide de clips métalliques sur les aimants et verrouillez la platine pour la maintenir en place.
Allumez la source de lumière blanche. Ouvrez le logiciel de l’appareil photo et ajustez le temps et le gain d’exposition jusqu’à ce que les nanostructures deviennent visibles. Allumez le laser à une puissance relativement élevée et ajustez manuellement l’axe Z jusqu’à ce que le point laser soit visible.
Allumez le contrôleur piézoélectrique et sélectionnez les paramètres appropriés pour le port de communication et la tension maximale. Réglez les valeurs des axes X, Y et Z sur la moitié de la tension maximale pour permettre un meilleur alignement de la platine dans toutes les directions. Alignez le spot laser avec l’une des structures à double nano-trou ou DNH à l’aide des boutons de commande des axes X, Y et Z de l’étage principal.
Assurez-vous que la photodiode d’avalanche ou l’APD est allumée. Fermez doucement l’enceinte à la nanopince plasmonique. Ouvrez le logiciel associé à l’enregistrement APD, tel qu’une interface utilisateur LabVIEW faite maison. Modifiez le nom du fichier et réglez la fréquence de coupure sur un kilohertz.
Spécifiez ensuite le chemin d’accès au fichier souhaité où les fichiers seront enregistrés. Éteignez la source de lumière blanche et rallumez le laser. Après avoir réglé la puissance du laser à un niveau approprié, utilisez les commandes piézoélectriques pour ajuster les axes X, Y et Z jusqu’à ce que le signal APD soit aussi élevé que possible.
Éviter la saturation de l’APD et avec un écart-type minimal de la trace. Ensuite, éteignez le laser pour préserver la durée de vie des nanostructures. Exécutez l’unité de commande de la pompe à seringue et l’interface utilisateur du distributeur pour régler la valve et prélever la quantité souhaitée de protéines.
À l’aide de l’interface utilisateur microfluidique, infusez la solution protéique à un débit similaire au taux de retrait. Continuez la perfusion à ce rythme jusqu’à ce que la solution protéique atteigne la cellule d’écoulement. Réglez ensuite le débit sur une valeur appropriée pour le piégeage et attendez que la trace soit stabilisée.
Vérifiez que le volume et le temps sur le pousse-seringue correspondent aux valeurs attendues. Pour enregistrer les données du signal APD, ajustez les axes X, Y et Z selon vos besoins à l’aide de l’interface utilisateur du contrôleur piézoélectrique. Lorsque vous observez un changement important dans la transmission et l’écart-type, notez l’heure à laquelle cela se produit pour le tri futur des données. Si la protéine doit être libérée dans le cadre de l’expérience, éteignez le laser pendant environ cinq secondes, puis rallumez-le.
La trace doit présenter un changement important de transmission et un écart-type nettement inférieur, indiquant un retour à l’état de base. Une fois l’expérience terminée, éteignez le laser. Retirez la cellule d’écoulement de l’étage à trois axes et déconnectez la tubulure du système microfluidique.
Placez la cellule d’écoulement sur un tissu propre avec la couche d’or vers le haut. À l’aide d’un scalpel, coupez soigneusement la colle sous la lamelle en verre avant de la retirer doucement et de la jeter. Tenez la cellule d’écoulement à un angle avec la couche d’or toujours tournée vers le haut et utilisez une pince à épiler arrondie pour retirer soigneusement la colle de la face inférieure de la cellule d’écoulement afin de libérer l’échantillon.
À l’aide d’une pince à épiler, prélevez l’échantillon et rincez-le abondamment à l’isopropanol. Séchez l’échantillon à l’aide d’un pistolet à air comprimé. Une expérience représentative réalisée sur le chargement in situ du fer dans une molécule d’apoferritine démontre l’utilisation de nanopinces plasmoniques comme outil pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines.
La trace de transmission de l’apoferritine reste stable lorsqu’elle est piégée dans une solution PBS, indiquant qu’il n’y a pas de changements conformationnels significatifs. Lors de l’exposition à la solution ferreuse, les fluctuations des écarts-types de la trace ont augmenté, indiquant des changements structurels dynamiques associés à la charge en fer. Après 20 minutes d’exposition au fer, la trace de transmission s’est stabilisée, indiquant la transition de l’apoferritine vers son holoforme.
Les graphiques de la fonction de densité de probabilité ont démontré un changement dans la distribution de la tension lors de la charge de fer, ce qui soutient davantage la transition conformationnelle de l’apoferritine à l’holoferritine.
