이 연구는 현재 기술을 사용하여 조사하기 어렵거나 질병과 관련이 있는 단백질에 특히 중점을 두고 단일 분자 수준에서 표지가 없는 단백질에 대한 통찰력을 실시간으로 얻는 것을 목표로 합니다. 플라즈몬 나노핀셋은 최근 단일 분자 수준에서 소분자에 결합할 때 구조적 역학을 모니터링하고, 분해 역학을 확인하고, 자유 에너지 풍경을 규명할 수 있는 능력을 입증했습니다. 현재 확립된 단백질 특성 분석 기술은 표지가 없는 단일 분자 단백질 구조적 역학을 조사할 수 없습니다.
플라즈몬 나노 핀셋은 이 분야의 틈새 시장을 채울 수 있는 잠재력을 가지고 있는 것으로 여겨집니다. 이 독특한 이점은 단백질의 구조적 변화와 생물학적 기능 사이의 관계와 질병 발병에 미치는 영향을 조사하는 데 도움이 됩니다. 향후 연구는 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다양한 암과 같은 여러 질병과 관련이 있는 본질적으로 무질서한 단백질과 막 단백질에 초점을 맞출 것입니다.
먼저 직선 핀셋을 사용하여 PEG-thiol 코팅된 샘플을 3D 프린팅 플로우 셀에 넣고 금층이 위쪽을 향하도록 합니다. 투명 PET 플라스틱 양면 테이프 커버의 한쪽 면을 떼어냅니다. 샘플과 플로우 셀 위에 테이프를 조심스럽게 놓고 플로우 셀의 나노 구조와 흡입구/배출 구멍이 덮여 있지 않은지 확인합니다.
둥근 핀셋을 사용하여 테이프의 가장자리 주위를 부드럽게 눌러 플로우 셀(flow cell)과 샘플에 대한 접착력을 고정합니다. 테이프의 다른 쪽을 떼어내고 샘플 위에 유리 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 둥근 핀셋을 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 눌러 접착력을 고정합니다.
이 공정은 플로우 셀 내에 높이가 50마이크로미터이고 부피가 3.5마이크로리터인 액체 채널을 생성합니다. 작은 피펫 팁을 사용하여 복제 실리콘의 용액 A와 용액 B를 동일한 비율로 현미경 슬라이드에 혼합하거나 제조업체가 지정한 대로 혼합합니다. 커버 슬립과 플로우 셀 사이의 틈을 혼합 복제 실리콘으로 채우고 커버 슬립 아래로 부드럽게 밀어 넣습니다.
플로우 셀(flow cell)을 거꾸로 잡고 구멍의 내벽 주위에 복제 실리콘을 조심스럽게 도포합니다. 샘플의 아래쪽에 있는 용융 실리카의 보이는 가장자리로 실리콘을 부드럽게 이동하고 복제 실리콘이 완전히 굳을 때까지 금층이 위쪽을 향하도록 샘플을 건조시킵니다. 모든 구성 요소가 제대로 연결되었는지 확인한 후 컴퓨터에 미세유체 시스템 UI를 로드합니다.
MUX 분배기 및 와이어 옆에 있는 재생 아이콘을 클릭하면 12 x 1 로터리 밸브와 3 x 양방향 밸브를 각각 제어하여 해당 인터페이스를 엽니다. 양방향 밸브로 3개를 우회하려면 와이어 중 하나의 포트를 켭니다. 플로우 셀을 플라즈모닉 나노핀셋에 장착하려면 주입구 및 배출 튜브를 플로우 셀의 적절한 부분에 부착합니다.
플로우 셀(flow cell)을 금색 층이 위쪽을 향하도록 깨끗한 조직에 놓습니다. 분당 약 0.3ml의 높은 유속으로 플로우 셀에 완충액을 주입합니다. 유체가 플로우 셀 내부의 샘플을 가로질러 이동하는지, 외부 또는 아래쪽에 유체가 보이지 않는지 확인합니다.
100X 대물렌즈에 이멀젼 오일 1-2방울을 떨어뜨립니다. 플로우 셀(flow cell)을 플라즈모닉 나노핀셋(plasmonic nanotweezers) 스테이지에 금층이 아래를 향하도록 합니다. 자석 위의 금속 클립을 사용하여 플로우 셀을 고정하고 스테이지를 잠궈 제자리에 고정합니다.
백색 광원을 켭니다. 카메라 소프트웨어를 열고 나노 구조가 보일 때까지 노출 시간과 게인을 조정합니다. 비교적 높은 출력으로 레이저를 켜고 레이저 스폿이 보일 때까지 Z축을 수동으로 조정합니다.
압전 컨트롤러를 켜고 통신 포트 및 최대 볼륨에 대한 적절한 설정을 선택합니다.tage. X, Y 및 Z축 값을 최대 전압의 절반으로 설정하여 모든 방향에서 더 나은 스테이지 정렬을 허용합니다. 메인 스테이지 X, Y 및 Z축 제어 손잡이를 사용하여 레이저 스폿을 이중 나노 구멍 또는 DNH 구조 중 하나에 정렬합니다.
눈사태 포토 다이오드 또는 APD가 켜져 있는지 확인하십시오. 인클로저를 플라즈모닉 나노핀셋에 부드럽게 닫습니다. 집에서 만든 LabVIEW UI와 같은 APD 녹음과 관련된 소프트웨어를 엽니다. 파일 이름을 편집하고 차단 주파수를 1kW로 설정합니다.
그런 다음 파일이 저장될 원하는 파일 경로를 지정합니다. 백색 광원을 껐다가 레이저를 다시 켭니다. 레이저 출력을 적절한 수준으로 설정한 후 압전 컨트롤을 사용하여 APD 신호가 가능한 한 높아질 때까지 X, Y 및 Z축을 조정합니다.
APD 포화를 피하고 트레이스의 표준 편차를 최소화합니다. 다음으로, 나노 구조의 수명을 보존하기 위해 레이저를 끕니다. 주사기 펌프 제어 장치와 분배기 UI를 실행하여 밸브를 설정하고 원하는 양의 단백질을 회수합니다.
microfluidic UI를 사용하여 인출 속도와 유사한 유속으로 단백질 용액을 주입합니다. 단백질 용액이 플로우 셀(flow cell)에 도달할 때까지 이 속도로 계속 주입합니다. 그런 다음 트랩핑에 적합한 값으로 유량을 설정하고 추적이 안정화될 때까지 기다립니다.
시린지 펌프의 부피와 시간이 예상 값과 일치하는지 확인합니다. APD 신호 데이터를 기록하려면 압전 제어기 UI를 사용하여 필요에 따라 X, Y, Z 축을 조정하십시오. 전송 및 표준 편차의 큰 변화를 관찰하면 향후 데이터 정렬을 위해 이러한 변화가 발생하는 시간을 기록해 둡니다. 실험의 일환으로 단백질을 방출해야 하는 경우 약 5초 동안 레이저를 껐다가 다시 켜십시오.
추적은 전송의 변화가 크고 표준 편차가 현저히 낮아야 하며, 이는 기준 상태로의 복귀를 나타냅니다. 실험을 완료한 후 레이저를 끕니다. 3축 스테이지에서 플로우 셀(flow cell)을 제거하고 미세유체 시스템 튜브를 분리합니다.
플로우 셀(flow cell)을 금색 층이 위쪽을 향하도록 깨끗한 조직에 놓습니다. 메스를 사용하여 유리 커버 슬립 아래의 접착제를 조심스럽게 잘라낸 다음 부드럽게 들어 올려 폐기합니다. 금층이 여전히 위쪽을 향하도록 flow cell을 비스듬히 잡고 둥근 핀셋을 사용하여 flow cell(플로우 셀) 아래쪽에서 접착제를 조심스럽게 제거하여 샘플을 빼냅니다.
스트레이트 핀셋을 사용하여 샘플을 집어 올리고 이소프로판올로 철저히 헹굽니다. 공기총을 사용하여 샘플을 건조시킵니다. 아포페리틴 분자에 대한 in-situ 철 로딩에 대해 수행된 대표적인 실험은 단백질 구조적 역학을 조사하기 위한 도구로 플라즈몬 나노핀셋을 사용하는 것을 보여줍니다.
아포페리틴의 투과 흔적은 PBS 용액에 갇혔을 때 안정적으로 유지되며, 이는 유의미한 구조적 변화가 없음을 나타냅니다. 철 용액에 노출되면 트레이스의 표준 편차 변동이 증가하여 철 하중과 관련된 동적 구조적 변화를 나타냅니다. 철에 20분 노출된 후 전염 흔적이 안정화되어 아포페리틴이 홀로폼으로 전이되었음을 나타냅니다.
확률 밀도 함수 플롯은 철 하중에 따른 전압 분포의 변화를 보여주었으며, 이는 아포페리틴에서 홀로페리틴으로의 구조적 전이를 더욱 뒷받침합니다.
