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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

University of Tennessee 

R67 &#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x8FD8;&#x539F;&#x9176; (DHFR) &#x662F;&#x8D28;&#x7C92;&#x7F16;&#x7801;&#x7C7B;&#x578B; II &#x9176;&#x3002;&#x56DB;&#x4E2A;&#x5355;&#x4F53; (78 &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x957F;) &#x88C5;&#x914D;&#x5230;&#x62E5;&#x6709; 222 &#x5BF9;&#x79F0;&#x6027; homotetramer&#x3002;&#x5728;&#x4EE5;&#x5F80;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x56DB;&#x4E2A; R67 DHFR &#x57FA;&#x56E0;&#x62F7;&#x8D1D;&#x4E32;&#x8054;&#x6570;&#x7EC4;&#x88AB;&#x878D;&#x5408;&#x5728;&#x6846;&#x67B6;&#x4E2D;&#x751F;&#x6210;&#x540D;&#x4E3A; Quad1 &#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x5355;&#x4F53;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5177;&#x6709;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x4E09;&#x7EA7;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684; R67&quot;&#x7236;&quot;&#x3002;&#x4E3A;&#x65B9;&#x4FBF;&#x8BF1;&#x53D8;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x9650;&#x5236;&#x9176;&#x7F51;&#x7AD9;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E86;&#x4E32;&#x8054;&#x57FA;&#x56E0;&#x6570;&#x7EC4;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#x6DFB;&#x52A0;&#x4E86; S59A &#x548C; H362L &#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x5C3D;&#x91CF;&#x51CF;&#x5C11;&#x53EF;&#x80FD;&#x7684;&#x6298;&#x53E0;&#x5F0F;&#x62D3;&#x6251; &#xFF1B;&#x8FD9;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x4EA7;&#x54C1;&#xFF0C;&#x540D;&#x4E3A; Quad3&#xFF0C;&#x62E5;&#x6709; 10 &#x66FF;&#x6362;&#x548C;&#x6B63;&#x5E38;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E; R67 DHFR &#x62E5;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x811A;&#x624B;&#x67B6;&#xFF0C;&#x5E8F;&#x5217;&#x7A7A;&#x95F4;&#x4E2D;&#x7684;&#x5927;&#x8DF3;&#x88AB;&#x6267;&#x884C; 45 &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x66FF;&#x6362;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x5229;&#x7528;&#x4ECE;&#x5176;&#x4ED6;&#x7C7B;&#x578B; II DHFRs &#x5907;&#x7528;&#x5E8F;&#x5217;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x88AB;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x5728;&#x8868;&#x9762;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4E0E;&#x65E0;&#x5E8F; N-&#x672B;&#x7AEF;&#x5E8F;&#x5217;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x7194;&#x57DF;&#x4E4B;&#x95F4;&#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x3002;&#x7531;&#x6B64;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684; Quad4 &#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x76F8;&#x5F53;&#x529F;&#x80FD; &#xFF1B;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5B83;&#x662F;&#x6BD4; Quad1&#xFF0C;&#x75DB;&#x82E6;&#x5728; ph &#x503C; 5 5 &#x5343;&#x5361;/&#x6469;&#x5C14; DeltaDeltaG &#x635F;&#x5931;&#x4E0D;&#x592A;&#x7A33;&#x5B9A;&#x3002;&#x4E00;&#x4E2A;&#x610F;&#x5916;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x662F;&#x5F62;&#x6210; Quad4 &#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x4E0E; ph &#x503C;&#x4E3A; 8&#xFF0C;&#x9F50;&#x805A;&#x7269;&#x987A;&#x5E8F;&#x8F83;&#x9AD8;&#x3002;R67 DHFR &#x548C;&#x5176;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x56DB;&#x6838;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x62E5;&#x6709;&#x5F3A;&#x52B2;&#x7684;&#x811A;&#x624B;&#x67B6;&#xFF0C;&#x80FD;&#x591F;&#x627F;&#x53D7;&#x7684;&#x4ECB;&#x7ECD; &gt; &#x6216; = 55 &#x66FF;&#x6362;&#x3002;

&#x5F7B;&#x5E95;&#x7684;&#x91CD;&#x65B0;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x7684;&#x56DB;&#x4E2A; R67 &#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x8FD8;&#x539F;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x4E32;&#x8054;&#x6570;&#x7EC4;&#x751F;&#x6210;&#x62E5;&#x6709; 45 &#x66FF;&#x6362;&#x529F;&#x80FD;&#x3001; &#x6298;&#x53E0;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;

R67 dihydrofolate reductase (DHFR) is a plasmid-encoded, type II enzyme. Four monomers (78 amino acids long) assemble into a homotetramer possessing 222 symmetry. In previous studies, a tandem array of four R67 DHFR gene copies was fused in frame to generate a functional monomer named Quad1. This protein possessed the essential tertiary structure of the R67 "parent". To facilitate mutagenesis reactions, restriction enzyme sites were introduced in the tandem gene array. S59A and H362L mutations were also added to minimize possible folding topologies; this protein product, named Quad3, possesses 10 substitutions and is functional. Since R67 DHFR possesses a stable scaffold, a large jump in sequence space was performed by the further addition of 45 amino acid substitutions. The mutational design utilized alternate sequences from other type II DHFRs. In addition, most of the mutations were positioned on the surface of the protein as well as in the disordered N-terminal sequence, which serves as the linker between the fused domains. The resulting Quad4 protein is quite functional; however, it is less stable than Quad1, suffering a DeltaDeltaG loss of 5 kcal/mol at pH 5. One unexpected result was formation of Quad4 dimers and higher order oligomers at pH 8. R67 DHFR, and its derivative Quad proteins, possesses a robust scaffold, capable of withstanding introduction of >or=55 substitutions.

Radical redesign of a tandem array of four R67 dihydrofolate reductase genes yields a functional, folded protein possessing 45 substitutions.

R67 dihydrofolate r&#xE9;ductase (DHFR) est un plasmide-cod&#xE9;, une enzyme de type II. Quatre monom&#xE8;res (78 acides amin&#xE9;s de long) assembler en un homot&#xE9;tram&#xE8;re poss&#xE9;dant 222 sym&#xE9;trie. Dans des &#xE9;tudes ant&#xE9;rieures, un tableau en tandem de quatre copies du g&#xE8;ne DHFR R67 a &#xE9;t&#xE9; fusionn&#xE9;e dans le cadre de g&#xE9;n&#xE9;rer un monom&#xE8;re fonctionnel nomm&#xE9; QUAD1. Cette prot&#xE9;ine poss&#xE8;de la structure essentielle tertiaire de la R67 &#x26;quot;parent&#x26;quot;. Pour faciliter les r&#xE9;actions de mutagen&#xE8;se, des sites d&#x26;#39;enzymes de restriction ont &#xE9;t&#xE9; introduits dans le tableau du g&#xE8;ne en tandem. Mutations S59A et H362L ont &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; ajout&#xE9;s afin de minimiser pliage topologies possibles, ce qui produit de la prot&#xE9;ine, nomm&#xE9;e Quad3, poss&#xE8;de 10 substitutions et est fonctionnel. Depuis DHFR R67 poss&#xE8;de une &#xE9;curie &#xE9;chafaud, un grand bond dans l&#x26;#39;espace de s&#xE9;quence a &#xE9;t&#xE9; r&#xE9;alis&#xE9;e par l&#x26;#39;ajout suppl&#xE9;mentaire de 45 substitutions d&#x26;#39;acides amin&#xE9;s. La conception de mutation utilis&#xE9;s s&#xE9;quences altern&#xE9;es d&#x26;#39;autres DHFRs de type II. En outre, la plupart des mutations sont positionn&#xE9;s sur la surface de la prot&#xE9;ine ainsi que dans le d&#xE9;sordre s&#xE9;quence N-terminale, qui sert de liaison entre les domaines condens&#xE9;s. Le r&#xE9;sultant Quad4 prot&#xE9;ine est tout &#xE0; fait fonctionnelle, mais elle est moins stable que QUAD1, souffrant d&#x26;#39;une perte de DeltaDeltaG de 5 kcal / mol &#xE0; pH 5. Un r&#xE9;sultat inattendu a &#xE9;t&#xE9; la formation de dim&#xE8;res et d&#x26;#39;oligom&#xE8;res Quad4 d&#x26;#39;ordre sup&#xE9;rieur &#xE0; un pH de 8. R67 DHFR, et ses prot&#xE9;ines Quad d&#xE9;riv&#xE9;s, poss&#xE8;de une solide &#xE9;chafaudage, capable de r&#xE9;sister &#xE0; l&#x26;#39;introduction d&#x26;#39;&#x26;gt; ou = 55 substitutions.

Refonte radicale d&#x26;#39;un tableau de Tandem Quatre R67 g&#xE8;nes de la dihydrofolate r&#xE9;ductase Donne un fonctionnelle, prot&#xE9;ine repli&#xE9;e Poss&#xE9;dant 45 substitutions

R67 Dihydrofolate Reduktase (DHFR) ist ein Plasmid-kodierte, Typ-II-Enzym. Vier Monomeren (78 Aminos&auml;uren lang) montieren in einem Homotetramer 222 Symmetrie besitzen. In den vorhergehenden Studien wurde ein Tandem-Array von vier R67 DHFR-gen-Kopien in Frame zum Generieren von einem funktionalen Monomer benannt Quad1 verschmolzen. Dieses Protein besa&szlig; die wesentliche Terti&auml;rstruktur des R67 &quot;&uuml;bergeordneten&quot;. Zur Erleichterung der Mutagenese Reaktionen eingef&uuml;hrt Beschr&auml;nkung Enzym-Websites des Tandem-gen-Arrays. S59A und H362L-Mutationen wurden auch hinzugef&uuml;gt, um m&ouml;gliche faltende Topologien zu minimieren; Dieses Protein-Produkt, mit dem Namen Quad3, besitzt 10 Auswechslungen und betriebsbereit ist. Da R67 DHFR ein stabiles Ger&uuml;st besitzt, wurde ein gro&szlig;er Sprung in der Zeichenfolge Leerzeichen durch weitere Zugabe von 45 Aminos&auml;ure-Ersetzungen durchgef&uuml;hrt. Das eigentliche Design genutzte alternative Sequenzen von anderen Typ II DHFRs. Dar&uuml;ber hinaus wurden die meisten von Mutationen auf der Oberfl&auml;che des Proteins ebenso wie in der ungeordneten N-terminale Sequenz, die als Linker zwischen den geschmolzenen Bereichen dient positioniert. Das resultierende Quad4 Protein ist sehr funktionell; Es ist jedoch weniger stabil als Quad1, einem DeltaDeltaG Verlust von 5 kcal/Mol bei pH 5. Ein unerwartetes Ergebnis war Quad4 Dimerisierung und h&ouml;herer Ordnung Oligomere bei pH 8. R67 DHFR und seiner Derivate Quad-Proteine, besitzt ein robustes Ger&uuml;st, Elkos Einf&uuml;hrung &gt; oder = 55 Substitutionen.

Radikale Neugestaltung eines Tandem-Arrays von vier Genen, R67 Dihydrofolate Reduktase ergibt eine funktionelle, gefaltete Protein besitzen 45 Substitutionen.

R67 diidrofolato reduttasi (DHFR) sono un enzima di plasmide-codificati, tipo II. Quattro monomeri (78 aminoacidi lunghi) assemblare in un homotetramer che possiedono simmetria 222. In studi precedenti, una matrice di tandem di quattro copie di gene DHFR R67 &egrave; stato fuso nel telaio per generare un monomero funzionale denominato Quad1. Questa proteina ha posseduto l&#39;essenziale struttura terziaria del R67 &quot;genitore&quot;. Per facilitare le reazioni di mutagenesi, enzima di restrizione siti sono stati introdotti nella matrice gene tandem. Mutazioni S59A e H362L sono stati aggiunti anche per ridurre al minimo le possibili topologie pieghevole; Questo prodotto della proteina, denominato Quad3, &egrave; funzionale e possiede 10 sostituzioni. Poich&eacute; R67 DHFR possiede un&#39;impalcatura stabile, un grande salto in sequenza spazio &egrave; stato eseguito con l&#39;ulteriore aggiunta di 45 aminoacidiche. Il design di mutational utilizzate sequenze alternate da altre tipo II DHFRs. Inoltre, la maggior parte delle mutazioni sono stata posizionata sulla superficie della proteina cos&igrave; come la disordinata sequenza N-terminale, che serve come il linker tra i domini fusi. La proteina risultante Quad4 &egrave; abbastanza funzionale; Tuttavia, &egrave; meno stabile della Quad1, subire una perdita di DeltaDeltaG di 5 kcal/mol a pH 5. Un risultato inatteso fu la formazione di dimeri di Quad4 e oligomeri di ordine superiori a pH 8. R67 DHFR e suoi derivati proteine Quad, possiede una robusta impalcatura, in grado di sopportare l&#39;introduzione di &amp;gt; o = 55 sostituzioni.

Riprogettazione radicale di una matrice di tandem g&egrave;nes quattro R67 diidrofolato reduttasi produce una proteina funzionale, piegata, possedendo 45 sostituzioni.

R67&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x30EC;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;DHFR&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306B;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3001;II&#x578B;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x56DB;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#xFF08;78&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x9577;&#xFF09;&#x306F;222&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30DB;&#x30E2;&#x56DB;&#x91CF;&#x4F53;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;4&#x3064;&#x306E;R67 DHFR&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30C7;&#x30E0;&#x914D;&#x5217;&#x306F;Quad1&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x5B98;&#x80FD;&#x6027;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30D5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30E0;&#x3067;&#x878D;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;R67&#x306E; &#x26;quot;&#x89AA;&#x26;quot;&#x306E;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x4E09;&#x6B21;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x5236;&#x9650;&#x9175;&#x7D20;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30C7;&#x30E0;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x914D;&#x5217;&#x306B;&#x5C0E;&#x5165;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; S59A&#x3068;H362L&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x6298;&#x308A;&#x305F;&#x305F;&#x307F;&#x3092;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306B;&#x6291;&#x3048;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8FFD;&#x52A0;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C8;&#x30DD;&#x30ED;&#x30B8;&#x3002;Quad3&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x540D;&#x524D;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x7523;&#x7269;&#x306F;&#x3001;10&#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x3092;&#x6709;&#x3057;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; R67 DHFR&#x304C;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x8DB3;&#x5834;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x7A7A;&#x9593;&#x306E;&#x5927;&#x30B8;&#x30E3;&#x30F3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;45&#x306E;&#x30A2;&#x200B;&#x200B;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7F6E;&#x63DB;&#x3092;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x6DFB;&#x52A0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x30C7;&#x30B6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;II&#x578B;DHFRs&#x304B;&#x3089;&#x5225;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x304C;&#x878D;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x9593;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x7121;&#x79E9;&#x5E8F;N&#x672B;&#x7AEF;&#x914D;&#x5217;&#x3001;&#x306E;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x914D;&#x7F6E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x7D50;&#x679C;Quad4&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x3001;pH 5&#x3067;5 kcal / mol&#x3067;&#x306E;DeltaDeltaG&#x640D;&#x5931;&#x306B;&#x82E6;&#x3057;&#x3093;&#x3067;&#x3001;Quad1&#x672A;&#x6E80;&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x3064;&#x4E88;&#x671F;&#x305B;&#x306C;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;pH 8&#x3067;Quad4&#x30C0;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x6B21;&#x306E;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3057;&#x305F;&#x3002; R67 DHFR&#x3001;&#x53CA;&#x3073;&#x305D;&#x306E;&#x8A98;&#x5C0E;&#x4F53;&#x30AF;&#x30EF;&#x30C3;&#x30C9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x26;gt;&#x307E;&#x305F;&#x306F;= 55&#x7F6E;&#x63DB;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x306B;&#x8010;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x5805;&#x7262;&#x306A;&#x8DB3;&#x5834;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x56DB;R67&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x9084;&#x5143;&#x9175;&#x7D20;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30C7;&#x30E0;&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x6839;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x518D;&#x8A2D;&#x8A08;&#x306F;&#x3001;45&#x7F6E;&#x63DB;&#x3092;&#x3082;&#x3064;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3001;&#x6298;&#x308A;&#x7573;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;

R67 dihydrofolate reductase (DHFR) &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC720;&#xD615; II &#xD6A8;&#xC18C; &#xC774;&#xB2E4;. 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; (78 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC774; &#xAE34;) 222 &#xB300;&#xCE6D; &#xC18C;&#xC9C0; homotetramer&#xC5D0; &#xC870;&#xB9BD;. &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; 4 R67 DHFR &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC0AC;&#xBCF8;&#xC758; &#xD0E0;&#xB364; &#xBC30;&#xC5F4; Quad1 &#xB77C;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC131; &#xBAA8;&#xB178; &#xBA38;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xD504;&#xB808;&#xC784;&#xC5D0; &#xC735;&#xD569; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; R67 &quot;&#xBD80;&#xBAA8;&quot;&#xC758; &#xD544;&#xC218; 3 &#xCC28; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xD640;&#xB9AC; &#xACE0;. Mutagenesis &#xBC18;&#xC751;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC; &#xD611;&#xB3D9; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC5D0; &#xAE08;&#xC9C0; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xB3C4;&#xC785; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. S59A &#xBC0F; H362L &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xC811;&#xC774;&#xC2DD; &#xD1A0;&#xD3F4;&#xB85C;&#xC9C0;;&#xC744; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD654; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xCD94;&#xAC00; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Quad3, &#xBA85;&#xBA85; &#xB41C;&#xC774; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC81C;&#xD488; 10 &#xB300;&#xCCB4;&#xB97C; &#xC18C;&#xC720; &#xD558; &#xACE0; &#xC791;&#xB3D9;. R67 DHFR &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xBC1C;&#xD310;&#xC744; &#xBCF4;&#xC720; &#xD558; &#xACE0;, &#xC774;&#xD6C4; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xACF5;&#xAC04;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xD070; &#xC810;&#xD504; 45 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xB97C; &#xD568;&#xC720;&#xD55C; &#xC0B0; &#xC131; &#xB300;&#xCCB4; &#xB354; &#xCD94;&#xAC00; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Mutational &#xB514;&#xC790;&#xC778; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xD615; II Dhfrs&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xCCB4; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC740; &#xC735;&#xD569;&#xB41C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xB9C1;&#xCEE4; &#xC5ED;&#xD560; &#xBB34;&#xC9C8;&#xC11C; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xBC30;&#xCE58; &#xD588;&#xB2E4;. &#xADF8; &#xACB0;&#xACFC; Quad4 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; &#xAF64; &#xAE30;&#xB2A5;; &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, Quad1, pH 5&#xC5D0;&#xC11C; 5 kcal/mol&#xC758; DeltaDeltaG &#xC190;&#xC2E4; &#xACE0;&#xD1B5; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB35C; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xC740; &#xACB0;&#xACFC; pH 8&#xC5D0;&#xC11C; &#xB192;&#xC740; &#xC21C;&#xC11C; &#xB300;&#xB85C; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; Quad4 &#xC774;&#xD569;&#xCCB4;&#xC758; &#xD615;&#xC131;. R67 DHFR&#xC640; &#xADF8; &#xD30C;&#xC0DD; &#xCFFC;&#xB4DC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC18C;&#xAC1C;&#xB97C; &#xACAC;&#xB51C; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xBE44; &#xACC4;&#xB97C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0; &amp;gt; &#xB610;&#xB294; = 55 &#xB300;&#xCCB4;.

4 &#xAC1C;&#xC758; R67 dihydrofolate reductase &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC9C1;&#xB82C; &#xC2DD; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC758; &#xAE09;&#xC9C4;&#xC801;&#xC778; &#xC7AC;&#xC124;&#xACC4; 45 &#xB300;&#xCCB4;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC720; &#xAE30;&#xB2A5;, &#xC811;&#xD78C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

R67 dihidrofolato reductasa (DHFR) es un pl&#xE1;smido codificada, tipo II, enzima. Cuatro mon&#xF3;meros (78 amino&#xE1;cidos de longitud) se ensamblan en un homotetr&#xE1;mero poseer 222 simetr&#xED;a. En estudios previos, una disposici&#xF3;n en t&#xE1;ndem de cuatro copias del gen DHFR R67 fue fusionada en el marco para generar un mon&#xF3;mero funcional llamado Quad1. Esta prote&#xED;na posee la estructura esencial de la educaci&#xF3;n terciaria R67 &#x26;quot;padre&#x26;quot;. Para facilitar las reacciones de mutag&#xE9;nesis, los sitios de enzimas de restricci&#xF3;n se introdujeron en el conjunto de genes en t&#xE1;ndem. Mutaciones S59A y H362L se a&#xF1;adieron tambi&#xE9;n para minimizar las posibles topolog&#xED;as de plegado, lo que producto de la prote&#xED;na, llamada Quad3, posee 10 sustituciones y es funcional. Desde DHFR R67 posee un estable andamio, un gran salto en el espacio de secuencia se realiz&#xF3; mediante la adici&#xF3;n de 45 sustituciones de amino&#xE1;cidos. El dise&#xF1;o mutacional utilizado secuencias alternativas de otros tipos DHFRs II. Adem&#xE1;s, la mayor&#xED;a de las mutaciones se coloca sobre la superficie de la prote&#xED;na, as&#xED; como en la desordenada secuencia N-terminal, que sirve como el enlazador entre los dominios fusionados. El resultante Quad4 prote&#xED;na es muy funcional, sin embargo, es menos estable que Quad1, sufriendo una p&#xE9;rdida DeltaDeltaG de 5 kcal / mol a pH 5. Un resultado inesperado fue la formaci&#xF3;n de Quad4 d&#xED;meros y olig&#xF3;meros superiores de orden a pH 8. R67 DHFR, y sus prote&#xED;nas Quad derivados, posee un s&#xF3;lido andamio, capaz de resistir la introducci&#xF3;n de mayor o igual a 55 sustituciones.

Redise&#xF1;o radical de una disposici&#xF3;n en t&#xE1;ndem de cuatro genes R67 dihidrofolato reductasa produce una prote&#xED;na funcional, Doblado posesi&#xF3;n de 45 Sustituciones

Cromosomiche diidrofolato reduttasi da Escherichia coli catalizza la riduzione del diidrofolato a tetraidrofolato, usando NADPH come cofattore. La termodinamica del legame ligando sono stata esaminata usando un approccio di calorimetria isotermica di titolazione. Utilizzando tamponi con diverse manche di ionizzazione, zero e una piccola, rilascio protone frazionale &egrave; stata osservata per diidrofolato vincolante, mentre &egrave; stato rilasciato un protone dell&#39;associazione NADP(+). Il ruolo dell&#39;acqua nell&#39;associazione inoltre &egrave; stato monitorato utilizzando un numero di differenti osmoliti. Associazione di NADP(+) &egrave; accompagnato dal rilascio netto di molecole d&#39;acqua di &sim;5-24, con una dipendenza sull&#39;identit&agrave; dell&#39;osmolita. In contrasto, associazione di diidrofolato &egrave; indebolito in presenza di osmoliti, coerente con &quot;assorbimento d&#39;acqua&quot;. Sono osservati effetti diversi a seconda dell&#39;identit&agrave; dell&#39;osmolita. L&#39;assorbimento netto di acqua all&#39;associazione diidrofolato precedentemente &egrave; stata osservata la nonhomologous R67-codificato diidrofolato reduttasi (enzima II tipo o zbioul) [Chopra, S., et al (2008) j Biol Chem. 283, 4690-4698]. R67 diidrofolato reduttasi possiede una sequenza nonhomologous e formano una struttura tetramerica con un poro singolo sito attivo, l&#39;osservazione dell&#39;associazione DHF pi&ugrave; debole in presenza di osmoliti in entrambi gli enzimi implica effetti cosolvente su libero diidrofolato. Coerente con questa analisi, flusso interrotto esperimenti trovare betaina colpisce principalmente associazione DHF tramite modifiche in k(on), mentre la betaina colpisce principalmente associazione NADPH attraverso cambiamenti nella k(off). Infine, termini di entalpia additive quando vengono confrontati gli eventi di associazione cofattore binarie e ternarie suggeriscono la presenza di transizioni conformazionali longeve che non sono inclusi in un semplice ciclo termodinamico.

Termodinamica e solventi effetti sul substrato e associazione cofattore in Escherichia coli cromosomiche diidrofolato reduttasi.

&#x4ECE;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x7684;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x8FD8;&#x539F;&#x9176;&#x50AC;&#x5316;&#x5230;&#x4F7F;&#x7528; NADPH &#x4E3A;&#x8F85;&#x9176;&#x56DB;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x7684;&#x51CF;&#x5C11;&#x3002;&#x70ED;&#x529B;&#x5B66;&#x7684;&#x914D;&#x4F53;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F7F;&#x7528;&#x7B49;&#x6E29;&#x6EF4;&#x5B9A;&#x70ED;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x5BA1;&#x67E5;&#x3002;&#x7F13;&#x51B2;&#x533A;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E0D;&#x540C;&#x52A0;&#x70ED;&#x7535;&#x79BB;&#xFF0C;&#x96F6;&#x5230;&#x5C0F;&#x7684;&#x5206;&#x6570;&#x8D28;&#x5B50;&#x91CA;&#x653E;&#x6709;&#x4EBA;&#x4E3A;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#xFF0C;&#x800C;&#x8D28;&#x5B50;&#x88AB;&#x91CA;&#x653E;&#x540E; NADP(+) &#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x5728;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E2D;&#x6C34;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x6B64;&#x5916;&#x76D1;&#x6D4B;&#x7528;&#x51E0;&#x79CD;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6E17;&#x900F;&#x3002;NADP(+) &#x7ED1;&#x5B9A;&#x88AB;&#x4F34;&#x968F;&#x51C0;&#x91CA;&#x653E; &sim;5 24 &#x6C34;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x8EAB;&#x4EFD;&#x4E0B;&#x7684;&#x4F9D;&#x8D56;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x88AB;&#x524A;&#x5F31;&#x4E0B;&#x6E17;&#x900F;&#xFF0C;&#x7B26;&#x5408;&quot;&#x6C34;&#x5438;&#x6536;&quot;&#x3002;&#x6839;&#x636E;&#x6E17;&#x900F;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x8EAB;&#x4EFD;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6548;&#x679C;&#x3002;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x540E;&#x7684;&#x6C34;&#x51C0;&#x5438;&#x6536;&#x4EE5;&#x524D;&#x6709;&#x4EBA;&#x533A;&#x6BB5; R67 &#x7F16;&#x7801;&#x7684;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x8FD8;&#x539F;&#x9176; (dfrB &#x6216;&#x7C7B;&#x578B; II &#x9176;) [Chopra&#xFF0C;S.&#x3001; &#x4E2D;&#x5357;&#x5DE5;&#x4E1A;&#x5927;&#x5B66; &#xFF08;2008 &#x5E74;&#xFF09; J.Biol.&#x5316;&#x5B66; 283&#xFF0C;4690 4698]&#x3002;R67 &#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x8FD8;&#x539F;&#x9176;&#x62E5;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x533A;&#x6BB5;&#x5E8F;&#x5217;&#xFF0C;&#x5F62;&#x6210;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5E26;&#x6709;&#x5355;&#x4E2A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9;&#x5B54;&#x9699;&#x7684; tetrameric &#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x8F83;&#x5F31;&#x7684;&#x767B;&#x9769;&#x51FA;&#x8840;&#x70ED;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5B58;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x9176;&#x6E17;&#x900F;&#x4E0B;&#x89C2;&#x5BDF;&#x6D89;&#x53CA;&#x5BF9;&#x514D;&#x8D39;&#x53F6;&#x9178;&#x5939;&#x5E26;&#x5242;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x4E0E;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5206;&#x6790;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x505C;&#x6B62;&#x6D41;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x53D1;&#x73B0;&#x751C;&#x83DC;&#x78B1;&#x4E3B;&#x8981;&#x5F71;&#x54CD;&#x767B;&#x9769;&#x51FA;&#x8840;&#x70ED;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x901A;&#x8FC7;&#x6539;&#x53D8; k(on)&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x751C;&#x83DC;&#x78B1;&#x4E3B;&#x8981;&#x5F71;&#x54CD; NADPH &#x7ED1;&#x5B9A;&#x901A;&#x8FC7; k(off) &#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x76F8;&#x4E00;&#x81F4;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x7D2F;&#x52A0;&#x7113;&#x672F;&#x8BED;&#x4E8C;&#x5143;&#x548C;&#x4E09;&#x5143;&#x8F85;&#x9176;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x8FDB;&#x884C;&#x6BD4;&#x8F83;&#x65F6;&#x4E5F;&#x8868;&#x660E;&#x957F;&#x5BFF;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x8F6C;&#x6362;&#x672A;&#x5305;&#x542B;&#x5728;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x70ED;&#x529B;&#x5B66;&#x5FAA;&#x73AF;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;

&#x70ED;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x6EB6;&#x5242;&#x5BF9;&#x57FA;&#x677F;&#x548C;&#x8F85;&#x9176;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x7684;&#x4E8C;&#x6C22;&#x53F6;&#x9178;&#x8FD8;&#x539F;&#x9176;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

Chromosomal dihydrofolate reductase from Escherichia coli catalyzes the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate using NADPH as a cofactor. The thermodynamics of ligand binding were examined using an isothermal titration calorimetry approach. Using buffers with different heats of ionization, zero to a small, fractional proton release was observed for dihydrofolate binding, while a proton was released upon NADP(+) binding. The role of water in binding was additionally monitored using a number of different osmolytes. Binding of NADP(+) is accompanied by the net release of âˆ¼5-24 water molecules, with a dependence on the identity of the osmolyte. In contrast, binding of dihydrofolate is weakened in the presence of osmolytes, consistent with "water uptake". Different effects are observed depending on the identity of the osmolyte. The net uptake of water upon dihydrofolate binding was previously observed in the nonhomologous R67-encoded dihydrofolate reductase (dfrB or type II enzyme) [Chopra, S., et al. (2008) J. Biol. Chem. 283, 4690-4698]. As R67 dihydrofolate reductase possesses a nonhomologous sequence and forms a tetrameric structure with a single active site pore, the observation of weaker DHF binding in the presence of osmolytes in both enzymes implicates cosolvent effects on free dihydrofolate. Consistent with this analysis, stopped flow experiments find betaine mostly affects DHF binding via changes in k(on), while betaine mostly affects NADPH binding via changes in k(off). Finally, nonadditive enthalpy terms when binary and ternary cofactor binding events are compared suggest the presence of long-lived conformational transitions that are not included in a simple thermodynamic cycle.

Thermodynamics and solvent effects on substrate and cofactor binding in Escherichia coli chromosomal dihydrofolate reductase.

Dihydrofolate r&#xE9;ductase chromosomique d &#x26;#39;Escherichia coli catalyse la r&#xE9;duction de la dihydrofolate &#xE0; t&#xE9;trahydrofolate utilisant NADPH comme cofacteur. La thermodynamique de liaison du ligand ont &#xE9;t&#xE9; examin&#xE9;s en utilisant une approche par calorim&#xE9;trie &#xE0; titration isotherme. Utiliser les tampons avec diff&#xE9;rentes s&#xE9;ries d&#x26;#39;ionisation, de z&#xE9;ro &#xE0; une petite fraction de lib&#xE9;ration de protons a &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;e pour la liaison dihydrofolate, tout en un proton a &#xE9;t&#xE9; lib&#xE9;r&#xE9; apr&#xE8;s NADP (+) de liaison. Le r&#xF4;le de l&#x26;#39;eau dans la liaison a en outre &#xE9;t&#xE9; contr&#xF4;l&#xE9;e en utilisant un certain nombre de diff&#xE9;rents osmolytes. La liaison de NADP (+) est accompagn&#xE9;e par la lib&#xE9;ration nette de ~ 5-24 mol&#xE9;cules d&#x26;#39;eau, avec une d&#xE9;pendance &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;gard de l&#x26;#39;identit&#xE9; de l&#x26;#39;osmolyte. En revanche, la liaison de la dihydrofolate est affaiblie dans la pr&#xE9;sence de osmolytes, compatible avec &#x26;quot;l&#x26;#39;absorption d&#x26;#39;eau&#x26;quot;. Diff&#xE9;rents effets sont observ&#xE9;s en fonction de l&#x26;#39;identit&#xE9; de l&#x26;#39;osmolyte. L&#x26;#39;absorption nette d&#x26;#39;eau lors de la liaison dihydrofolate a d&#xE9;j&#xE0; &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9; dans la dihydrofolate r&#xE9;ductase non homologue R67-cod&#xE9; (dfrB ou de type II enzyme) [Chopra, S., et al. (2008) J. Biol. Chem. 283, 4690-4698]. R67 que la dihydrofolate r&#xE9;ductase poss&#xE8;de une s&#xE9;quence non homologue et forme une structure t&#xE9;tram&#xE8;re avec un site actif unique pores, l&#x26;#39;observation de liaison plus faible DHF en pr&#xE9;sence d&#x26;#39;osmolytes dans les deux enzymes implique effets cosolvant sur la dihydrofolate libre. Conform&#xE9;ment &#xE0; cette analyse, des exp&#xE9;riences de circulation arr&#xEA;t&#xE9;e &#xE0; trouver la b&#xE9;ta&#xEF;ne affecte principalement la dengue h&#xE9;morragique liaison via des changements dans k (e), tandis que la b&#xE9;ta&#xEF;ne affecte principalement NADPH liaison via des changements dans K (off). Enfin, les termes d&#x26;#39;enthalpie non additifs lorsque des &#xE9;v&#xE9;nements cofacteur binaires et ternaires de liaison sont compar&#xE9;es sugg&#xE8;rent la pr&#xE9;sence de longue dur&#xE9;e de vie des transitions de conformation qui ne sont pas incluses dans un cycle thermodynamique simple.

Thermodynamique et effets de solvant sur le substrat et du cofacteur de liaison dans Escherichia coli chromosomique dihydrofolate r&#xE9;ductase

Chromosomale Dihydrofolate Reduktase von Escherichia coli katalysiert die Reduktion von Dihydrofolate zu Tetrahydrofolat mit NADPH als Kofaktor. Thermodynamik von Ligand-Bindung wurden untersucht Isothermischer Titrierung-Kalorimetrie herantreten. Mit Puffer mit verschiedenen L&auml;ufen der Ionisation, NULL auf eine kleine, wurde gebrochene Proton Version beobachtet, Dihydrofolate Bindung, w&auml;hrend ein Proton auf NADP(+) Bindung ver&ouml;ffentlicht wurde. Die Rolle des Wassers in Bindung wurde zus&auml;tzlich mit einer Reihe von verschiedenen Osmolytes &uuml;berwacht. Bindung des NADP(+) wird von der net Version von Wassermolek&uuml;len &sim;5-24, mit einer Abh&auml;ngigkeit von der Identit&auml;t der Osmolyte begleitet. Dagegen ist die Bindung von Dihydrofolate in Anwesenheit von Osmolytes, mit &quot;Wasseraufnahme&quot; geschw&auml;cht. Verschiedene Effekte werden je nach der Identit&auml;t der Osmolyte beobachtet. Die net Aufnahme von Wasser auf Dihydrofolate Bindung wurde zuvor in der nonhomologous R67-codierte Dihydrofolate Reduktase (DfrB oder Typ-II-Enzym) beobachtet [Chopra, S., Et Al. (2008) J. 283 der Biol.-Chem., 4690-4698]. R67 Dihydrofolate Reduktase besitzt eine nonhomologous Sequenz und bildet eine tetramere Struktur mit einer einzigen aktiven Site Pore, impliziert die Beobachtung der schw&auml;cheren DHF-Bindung in Anwesenheit von Osmolytes in beiden Enzymen Hilfsl&ouml;sungsmittel Auswirkungen auf die freie Dihydrofolate. Im Einklang mit dieser Analyse beendet Str&ouml;mung Experimente feststellen, Betain betrifft meist DHF Bindung &uuml;ber &Auml;nderungen im k(on), w&auml;hrend Betain &uuml;berwiegend NADPH Bindung &uuml;ber &Auml;nderungen im k(off) beeinflusst. Schlie&szlig;lich schlagen nicht additiv Enthalpie Begriffe als bin&auml;ren und tern&auml;ren Cofaktor Bindung Ereignisse verglichen werden das Vorhandensein von langlebigen Konformations&auml;nderungen &Uuml;berg&auml;nge, die nicht in einem einfachen thermodynamischen Zyklus enthalten sind.

Thermodynamik und solvent Auswirkungen auf Substrat und Cofaktor Bindung in Escherichia coli chromosomalen Dihydrofolate Reduktase.

&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x9084;&#x5143;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x88DC;&#x56E0;&#x5B50;&#x3068;&#x3057;&#x3066;NADPH&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x5869;&#x306B;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x306E;&#x9084;&#x5143;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x71B1;&#x529B;&#x5B66;&#x306F;&#x3001;&#x7B49;&#x6E29;&#x6EF4;&#x5B9A;&#x71B1;&#x91CF;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x3068;&#x30D0;&#x30C3;&#x30D5;&#x30A1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30F3;&#x304C;&#x7D50;&#x5408;NADP&#xFF08;+&#xFF09;&#x306B;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9593;&#x306B;&#x3001;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x5206;&#x6570;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30F3;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x306B;&#x30BC;&#x30ED;&#x304C;&#x3001;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x7D50;&#x5408;&#x304C;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x52A0;&#x71B1;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x7D50;&#x5408;&#x6C34;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x5225;&#x306E;osmolytes&#x6570;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30FC;&#x3057;&#x305F;&#x3002; NADP&#xFF08;+&#xFF09;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x6D78;&#x900F;&#x5727;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30C6;&#x30A3;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B;&#x3067;&#x301C;5&#x6708;24&#x65E5;&#x6C34;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x6B63;&#x5473;&#x306E;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4ED8;&#x5C5E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x8449;&#x9178;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x3001; &#x26;quot;&#x5438;&#x6C34;&#x26;quot;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;osmolytes&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x5F31;&#x4F53;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x5225;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x6D78;&#x900F;&#x5727;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x60C5;&#x5831;&#x306B;&#x5FDC;&#x3058;&#x3066;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3002;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x7D50;&#x5408;&#x6642;&#x306E;&#x6C34;&#x306E;&#x6B63;&#x5473;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306F;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x306B;&#x975E;&#x76F8;&#x540C;R67&#x3067;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x9084;&#x5143;&#x9175;&#x7D20;&#xFF08;dfrB&#x307E;&#x305F;&#x306F;II&#x578B;&#x9175;&#x7D20;&#xFF09;[&#x30C1;&#x30E7;&#x30D7;&#x30E9;&#x3001;S.&#x3089;&#x304C;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002; &#xFF08;2008&#xFF09;&#x30B5;&#x900B;&#x30BB;&#x9058;&#x53F0;&#x30B3;&#x53E5;&#x30AF;&#x5316;&#x5B66;&#x3002; 283&#x3001;4690&#x304B;&#x3089;4698]&#x3002; R67&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x9084;&#x5143;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x3001;&#x975E;&#x76F8;&#x540C;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x7D30;&#x5B54;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x56DB;&#x91CF;&#x4F53;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;osmolytes&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x5F31;&#x3044;DHF&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x89B3;&#x5BDF;&#x306F;&#x3001;&#x7121;&#x6599;&#x306E;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x306B;&#x6EB6;&#x5A92;&#x52B9;&#x679C;&#x306E;&#x95A2;&#x4E0E;&#x304C;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3001;&#x6D41;&#x308C;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x30D9;&#x30BF;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x4E3B;&#x306B;k&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#xFF08;&#x30AA;&#x30D5;&#xFF09;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x3001;NADPH&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x30D9;&#x30BF;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x4E3B;&#x306B;&#x3001;K&#xFF08;&#x4E0A;&#xFF09;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x7D50;&#x5408;DHF&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x308B;&#x505C;&#x6B62;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30EA;&#x3068;&#x4E09;&#x88DC;&#x56E0;&#x5B50;&#x7D50;&#x5408;&#x4E8B;&#x8C61;&#x304C;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x975E;&#x52A0;&#x6CD5;&#x30A8;&#x30F3;&#x30BF;&#x30EB;&#x30D4;&#x30FC;&#x306E;&#x7528;&#x8A9E;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x7D14;&#x306A;&#x71B1;&#x529B;&#x5B66;&#x7684;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306B;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x9577;&#x5BFF;&#x547D;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x9077;&#x79FB;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x8449;&#x9178;&#x30EC;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3068;&#x88DC;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x71B1;&#x529B;&#x5B66;&#x3068;&#x6EB6;&#x5A92;&#x52B9;&#x679C;

&#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; dihydrofolate reductase catalyzes&#xC744; cofactor&#xB85C; NADPH&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; tetrahydrofolate dihydrofolate&#xC758; &#xAC10;&#xC18C;. Ligand &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC5F4;&#xC5ED;&#xD559; &#xB4F1;&#xC628; &#xC801;&#xC815; &#xC5F4; &#xB7C9; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC870;&#xC0AC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBC84;&#xD37C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC774;&#xC628;&#xD654;, &#xC18C;&#xD615;, 0&#xC758; &#xB2E4;&#xB978;&#xAC00; &#xC5F4; &#xB41C; &#xC18C;&#xC218; &#xC591;&#xC131;&#xC790; &#xBC29;&#xCD9C; dihydrofolate &#xBC14;&#xC778;&#xB529;, &#xC591;&#xC131;&#xC790; NADP(+) &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB3D9;&#xC548; &#xAD00;&#xCC30; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBB3C;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC740; &#xB610;&#xD55C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB2E4;&#xB978; osmolytes &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xB41C;&#xB2E4;. NADP(+)&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &sim;5-24 &#xBB3C; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; net &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xB294; osmolyte&#xC758; &#xC815;&#xCCB4;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC758;&#xC874;&#xB3C4;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, dihydrofolate&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; osmolytes &#xC77C; &quot;&#xBB3C; &#xD1B5;&#xD48D; &#xAD00;&quot;&#xACFC; &#xC77C;&#xCE58;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC; &#xC57D;&#xD654;. &#xB2E4;&#xB978; &#xD6A8;&#xACFC; osmolyte&#xC758; id&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C;&#xB2E4;. Dihydrofolate &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xBB3C; net &#xAE00;&#xADC0; nonhomologous R67 &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; dihydrofolate reductase (dfrB &#xB610;&#xB294; &#xC720;&#xD615; II &#xD6A8;&#xC18C;)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; [&#xCD08; &#xD504;&#xB77C;, S., &#xC678;. (2008) J. Biol. &#xD654;&#xD559; 283, 4690 4698]. R67 dihydrofolate reductase nonhomologous &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC720; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC561;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAE30; &#xACF5; tetrameric &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xD615;&#xC131; &#xD558; &#xACE0;, &#xB9C8;&#xCC2C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xB85C; &#xC57D;&#xD55C; DHF &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB450; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C; osmolytes&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xC758; &#xAD00;&#xCC30; cosolvent &#xD6A8;&#xACFC; &#xBB34;&#xB8CC; dihydrofolate&#xC5D0; &#xC5F0;&#xB8E8;. &#xC774; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; betaine &#xC8FC;&#xB85C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; k(off)&#xC758; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; NADPH &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; betaine &#xC8FC;&#xB85C; k(on), &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; DHF &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xCC3E;&#xC744; &#xC911;&#xC9C0; &#xB41C; &#xD750;&#xB984;&#xC73C;&#xB85C; &#xC77C;&#xAD00;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC774;&#xC9C4; &#xBC0F; &#xC0BC;&#xC9C4; cofactor &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558;&#xB294; &#xBE44; &#xAC00;&#xC0B0;&#xC801; &#xC5D4; &#xD0C8;&#xD53C; &#xC870;&#xAC74;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xC5F4;&#xC5ED;&#xD559;&#xC801; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC218;&#xBA85;&#xC774; &#xAE34; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC804;&#xD658;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;.

&#xC5F4;&#xC5ED;&#xD559; &#xBC0F; &#xAE30;&#xD310; &#xBC0F; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; dihydrofolate reductase&#xC758; cofactor &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC6A9; &#xB9E4; &#xD6A8;&#xACFC;.

Dihidrofolato reductasa cromos&#xF3;mico de E. coli cataliza la reducci&#xF3;n de dihidrofolato a tetrahidrofolato usando NADPH como cofactor. La termodin&#xE1;mica de uni&#xF3;n del ligando fueron examinados usando un m&#xE9;todo de titulaci&#xF3;n calorimetr&#xED;a isot&#xE9;rmica. Uso de tampones con diferentes calores de ionizaci&#xF3;n, de cero a una peque&#xF1;a liberaci&#xF3;n de protones fraccional se observ&#xF3; para la uni&#xF3;n de dihidrofolato, mientras que un prot&#xF3;n se lanz&#xF3; al NADP (+) vinculante. El papel del agua en la uni&#xF3;n se control&#xF3; adicionalmente utilizando un n&#xFA;mero de diferentes osmolitos. La uni&#xF3;n de NADP (+) est&#xE1; acompa&#xF1;ada por la liberaci&#xF3;n neta de ~ 5-24 mol&#xE9;culas de agua, con una dependencia de la identidad de la osmolito. En contraste, la uni&#xF3;n de dihidrofolato se debilita en presencia de osmolitos, de acuerdo con &#x26;quot;absorci&#xF3;n de agua&#x26;quot;. Diferentes efectos se observan en funci&#xF3;n de la identidad de la osmolito. La absorci&#xF3;n neta de agua tras la uni&#xF3;n dihidrofolato se observ&#xF3; anteriormente en la dihidrofolato reductasa no hom&#xF3;loga R67-codificado (dfrB o tipo II enzima) [Chopra, S., et al. (2008) J. Biol.. Chem.. 283, 4690-4698]. Como R67 dihidrofolato reductasa posee una secuencia hom&#xF3;loga y forma una estructura tetram&#xE9;rica con un poro solo sitio activo, la observaci&#xF3;n de uni&#xF3;n DH m&#xE1;s d&#xE9;bil en la presencia de osmolitos en ambas enzimas implica efectos cosolventes en dihidrofolato libre. De acuerdo con este an&#xE1;lisis, se detuvo experimentos de flujo encontrar beta&#xED;na afecta principalmente a los DH de uni&#xF3;n a trav&#xE9;s de cambios en la k (a), mientras que la beta&#xED;na afecta sobre todo a NADPH vinculante a trav&#xE9;s de cambios en la k (apagado). Por &#xFA;ltimo, los t&#xE9;rminos no aditivos entalp&#xED;a cuando los eventos binarios y ternarios uni&#xF3;n al cofactor se comparan sugieren la presencia de larga duraci&#xF3;n, transiciones conformacionales que no est&#xE1;n incluidos en un ciclo termodin&#xE1;mico sencillo.

Termodin&#xE1;mica y los efectos del solvente en el sustrato y la uni&#xF3;n al cofactor en Escherichia Coli cromos&#xF3;mica de la dihidrofolato reductasa

Jordan Grubbs

Department of Biochemistry,
Cellular and Molecular Biology,
Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology

University of Tennessee

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Jordan Grubbs

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Biochemistry,Cellular and Molecular Biology,Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology

University of Tennessee

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Department of Biochemistry,
Cellular and Molecular Biology,
Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology