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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

University of Houston 

&#x7CBE;&#x81F4;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x548C;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x9176;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x79EF;&#x6781;&#x548C;&#x6D88;&#x6781;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x538B;&#x529B;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684;&#x6F14;&#x53D8;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x4F7F;&#x7528;&#x4F53;&#x5916;&#x7B5B;&#x9009;&#x6280;&#x672F;&#x901A;&#x5E38;&#x63A5;&#x53D7;&#x65B0;&#x578B;&#x57FA;&#x8D28;&#x9176;&#x53D8;&#x4F53;&#x663E;&#x793A;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6EE5;&#x4EA4;&#x4E0E;&#x81EA;&#x7136;&#x540C;&#x884C;&#x8F83;&#x4F4E;&#x7684;&#x603B;&#x8425;&#x4E1A;&#x989D;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x7EC6;&#x83CC;&#x663E;&#x793A;&#x548C;&#x591A;&#x53C2;&#x6570;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x4E86;&#x6A21;&#x62DF;&#x4F53;&#x5916;&#x7684;&#x9176;&#x53D8;&#x4F53;&#x5206;&#x79BB;&#x7684;&#x79EF;&#x6781;&#x548C;&#x6D88;&#x6781;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x538B;&#x529B;&#x4E0E;&#x53CD;&#x5E94;&#x6027;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x886C;&#x5E95;&#xFF0C;&#x800C;&#x540C;&#x65F6;&#x6392;&#x9664;&#x90A3;&#x4E9B;&#x4E0E;&#x53CD;&#x5E94;&#x6027;&#x610F;&#x5916;&#x886C;&#x5E95;&#x671D;&#x7684;&#x65B0;&#x9896;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5927;&#x578B;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x5185;&#x80BD;&#x9176; OmpT &#x7684;&#x968F;&#x673A;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x5E93;&#x7684;&#x7B5B;&#x9009;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684;&#x9176; variant&#xFF0C;1.3.19&#xFF0C;&#x5206;&#x89E3; Ala Arg &#x80BD;&#x952E;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F;&#x9996;&#x9009;&#x7684; WT &#x9176;&#x7684; Arg Arg &#x503A;&#x5238;&#x5206;&#x79BB;&#x3002;&#x53D8;&#x578B; 1.3.19 &#x5C55;&#x51FA;&#x5927;&#x4E8E;&#x4E09;&#x4E2A;&#x7FFB;&#x5929;&#x8986;&#x5730;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x6027; &#xFF08;-Ala-Arg-/-&#x7CBE;&#x6C28;&#x9178;-&#x7CBE;&#x6C28;&#x9178;-) &#x548C;&#x4E3A;&#x6240;&#x663E;&#x793A;&#x7684;&#x9996;&#x9009;&#x886C;&#x5E95;&#xFF0C;Arg &#x53C2;&#x6570;&#x7684;&#x7236;&#x7EA7;&#x76F8;&#x540C;&#x7684; Ala Arg &#x5288;&#x88C2;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6548;&#x7387;Ser223Arg &#x66FF;&#x6362;&#x5355;&#x4E2A;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x6240;&#x793A;&#x5B8C;&#x5168;&#x8BB2;&#x8FF0;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6027;&#x80FD;&#xFF0C;1.3.19 &#x7684; variant &#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x503C;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x89E3;&#x91CA;&#x63D0;&#x51FA;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x884C;&#x4E3A;&#x662F;&#x4EE5;&quot;&#x4EA4;&#x6362;&quot;&#x901A;&#x5E38; WT &#x57FA;&#x677F;&#x80BD;&#x4E0E; 223Arg &#x4FA7;&#x94FE;&#x5728;&#x53D1;&#x73B0; OmpT S(1) &#x5B50;&#x7F51;&#x7AD9; P(1) Arg &#x4FA7;&#x94FE;&#x3002;

&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5C55;&#x793A;&#x9AD8;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x548C;&#x7CBE;&#x81F4;&#x7684;&#x57FA;&#x677F;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x53D8;&#x79CD;&#x3002;

The exquisite selectivity and catalytic activity of enzymes have been shaped by the effects of positive and negative selection pressure during the course of evolution. In contrast, enzyme variants engineered by using in vitro screening techniques to accept novel substrates typically display a higher degree of catalytic promiscuity and lower total turnover in comparison with their natural counterparts. Using bacterial display and multiparameter flow cytometry, we have developed a novel methodology for emulating positive and negative selective pressure in vitro for the isolation of enzyme variants with reactivity for desired novel substrates, while simultaneously excluding those with reactivity toward undesired substrates. Screening of a large library of random mutants of the Escherichia coli endopeptidase OmpT led to the isolation of an enzyme variant, 1.3.19, that cleaved an Ala-Arg peptide bond instead of the Arg-Arg bond preferred by the WT enzyme. Variant 1.3.19 exhibited greater than three million-fold selectivity (-Ala-Arg-/-Arg-Arg-) and a catalytic efficiency for Ala-Arg cleavage that is the same as that displayed by the parent for the preferred substrate, Arg-Arg. A single amino acid Ser223Arg substitution was shown to recapitulate completely the unique catalytic properties of the 1.3.19 variant. These results can be explained by proposing that this mutation acts to "swap" the P(1) Arg side chain normally found in WT substrate peptides with the 223Arg side chain in the S(1) subsite of OmpT.

Engineering of protease variants exhibiting high catalytic activity and exquisite substrate selectivity.

La s&eacute;lectivit&eacute; exquise et l&#39;activit&eacute; catalytique des enzymes ont &eacute;t&eacute; fa&ccedil;onn&eacute;s par les effets de la pression de s&eacute;lection positive et n&eacute;gative au cours de l&#39;&eacute;volution. En revanche, variantes d&#39;enzyme con&ccedil;us en utilisant des techniques de d&eacute;pistage in vitro d&#39;accepter de nouveaux substrats g&eacute;n&eacute;ralement affichent une plus grande promiscuit&eacute; catalytique et chiffre d&#39;affaires inf&eacute;rieur en comparaison avec leurs homologues naturels. Utilisez affichage bact&eacute;rienne et cytom&eacute;trie en flux multiparam&eacute;trique, nous avons d&eacute;velopp&eacute; une m&eacute;thodologie novatrice pour &eacute;muler positif et n&eacute;gatif de pression de s&eacute;lection in vitro pour l&#39;isolement des variantes de l&#39;enzyme avec r&eacute;activit&eacute; pour d&eacute;sir&eacute; nouveaux substrats, tandis que simultan&eacute;ment &agrave; l&#39;exclusion de ceux avec r&eacute;activit&eacute; vis-&agrave;-vis des substrats non d&eacute;sir&eacute;s. D&eacute;pistage d&#39;une grande biblioth&egrave;que de mutants al&eacute;atoires de l&#39;endopeptidase de coli Escherichia od&egrave;le conduit &agrave; l&#39;isolement d&#39;une variante de l&#39;enzyme, 1.3.19, qui s&#39;est fendue d&#39;une liaison peptidique de Ala-Arg au lieu de la liaison Arg-Arg pr&eacute;f&eacute;r&eacute;e par l&#39;enzyme WT. 1.3.19 Variante expos&eacute; sup&eacute;rieur &agrave; trois amplifiant s&eacute;lectivit&eacute; (- Ala - Arg-/ - Arg - Arg-) et une efficacit&eacute; catalytique pour le clivage Ala-Arg c&#39;est la m&ecirc;me que celle affich&eacute;e par le parent pour le substrat pr&eacute;f&eacute;r&eacute;, Arg-arg. Un seul acide amin&eacute; Ser223Arg substitution s&#39;est av&eacute;r&eacute; r&eacute;capituler compl&egrave;tement uniques propri&eacute;t&eacute;s catalytiques de la 1.3.19 variante. Ces r&eacute;sultats peuvent &ecirc;tre expliqu&eacute;s en proposant que cette mutation agit pour la cha&icirc;ne lat&eacute;rale Arg p se trouv&eacute;e normalement dans les peptides substrat WT avec la cha&icirc;ne lat&eacute;rale de 223Arg dans le sous-site s (1) d&#39;od&egrave;le de &laquo; swap &raquo;.

Ing&eacute;nierie des variantes de prot&eacute;ase pr&eacute;sentant une forte activit&eacute; catalytique et s&eacute;lectivit&eacute; de substrat exquis.

Die exquisite Selektivit&auml;t und katalytische Aktivit&auml;t der Enzyme haben im Laufe der Evolution durch die Auswirkungen der positiven und negativen Selektionsdruck gepr&auml;gt. Im Gegensatz dazu anzeigen Enzymvarianten entwickelt, die mithilfe von in-vitro-Screening-Techniken neuartige Substrate akzeptieren in der Regel ein h&ouml;heres Ma&szlig; an katalytische Promiskuit&auml;t und niedrigeren Gesamtumsatz im Vergleich zu ihren nat&uuml;rlichen Gegenst&uuml;cken. Mit bakteriellen Display und multiparameter Durchflusszytometrie, entwickelten wir eine neuartige Methode zur Emulation von positiven und negativen selektiven Druck in-vitro f&uuml;r die Isolierung von Enzymvarianten mit Reaktivit&auml;t f&uuml;r gew&uuml;nschte Roman Substrate, w&auml;hrend gleichzeitig mit Reaktivit&auml;t gegen unerw&uuml;nschte Untergr&uuml;nde ausgenommen. Screening von einer umfangreichen Bibliothek von zuf&auml;lligen Mutanten von Escherichia coli Endopeptidase OmpT f&uuml;hrte zur Isolierung eine Enzym-Variante 1.3.19, die eine Ala-Arg-Peptidbindung anstelle der Arg-Arg-Bond bevorzugt durch die WT-Enzym zerspaltet. Variant 1.3.19 ausgestellt gr&ouml;&szlig;er als drei millionenfache Selektivit&auml;t (- Ala - Arg-/ - Arg - Arg-) und eine katalytische Effizienz f&uuml;r Ala-Arg-Spaltung, die identisch angezeigt, indem das &uuml;bergeordnete Element f&uuml;r das bevorzugte Substrat, Arg-arg. Eine einzige Aminos&auml;ure Ser223Arg Ersetzung wurde gezeigt, dass die einzigartigen katalytischen Eigenschaften von der 1.3.19 vollst&auml;ndig rekapitulieren Variante. Diese Ergebnisse k&ouml;nnen erkl&auml;rt werden, indem er vorschl&auml;gt, dass diese Mutation handelt, um &quot;die Seitenkette P(1) Arg normalerweise gefunden in WT Substrat Peptide mit der 223Arg-Seitenkette in der S(1)-Subsite von OmpT tauschen&quot;.

Engineering von Protease-Varianten, die hohe katalytische Aktivit&auml;t und exquisite Substrat Selektivit&auml;t ausstellen.

La selettivit&agrave; squisito e attivit&agrave; catalitica degli enzimi sono state modellate dagli effetti della pressione di selezione positiva e negativa nel corso dell&#39;evoluzione. Al contrario, varianti di enzima progettati utilizzando tecniche di screening in vitro ad per accettare nuovi substrati in genere visualizzano un maggiore grado di promiscuit&agrave; catalitico e fatturato totale inferiore rispetto alle loro controparti naturali. Mediante batterica e la citometria a flusso multiparametrico, abbiamo sviluppato una metodologia romanzo per emulare la pressione selettiva positiva e negativa in vitro per l&#39;isolamento delle varianti di enzima con reattivit&agrave; per substrati romanzo desiderati, mentre contemporaneamente escludendo quelli con reattivit&agrave; verso substrati indesiderati. Lo screening di una vasta libreria di mutanti casuali dell&#39;endopeptidasi coli Escherichia salvataggi ha condotto all&#39;isolamento di una variante di enzima, 1.3.19, che scisse un legame peptidico Ala-Arg invece il legame Arg-Arg preferito dall&#39;enzima WT. 1.3.19 Variante esposta maggiore di tre milioni di selettivit&agrave; (- Ala - Arg-/ - Arg - Arg-) e un&#39;efficienza catalitica per Ala-Arg scissione che &egrave; uguale a quello visualizzato dal padre per il substrato preferito, Arg-arg. Un singolo amminoacido Ser223Arg sostituzione &egrave; stato indicato per ripassare completamente l&#39;unica propriet&agrave; catalitiche del 1.3.19 variante. Questi risultati possono essere spiegati da proporre che questa mutazione agisce per &quot;scambiare&quot; la catena laterale P(1) Arg normalmente si trovano in peptidi substrato WT con catena laterale 223Arg nel S(1) sito secondario di salvataggi.

Ingegneria delle varianti di proteasi espositrici ad alta attivit&agrave; catalitica e selettivit&agrave; del substrato squisito.

&#x7D76;&#x5999;&#x306A;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x3068;&#x89E6;&#x5A92;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x6B63;&#x3068;&#x8CA0;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x5727;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x9032;&#x5316;&#x306E;&#x904E;&#x7A0B;&#x3067;&#x5F62;&#x3092;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x306E; in vitro &#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x901A;&#x5E38;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x57FA;&#x677F;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x5165;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306A;&#x89E6;&#x5A92;&#x4E71;&#x4EA4;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x81EA;&#x7136;&#x306E;&#x56FD;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x4F4E;&#x3044;&#x7DCF;&#x58F2;&#x308A;&#x4E0A;&#x3052;&#x9AD8;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30D7;&#x30EC;&#x30A4;&#x3068;&#xFF0C; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6B63;&#x3068;&#x8CA0;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x5727;&#x4F53;&#x5916;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x306E;&#x7D76;&#x7E01;&#x76EE;&#x7684;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x7528;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;&#x3068;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x671B;&#x307E;&#x3057;&#x304F;&#x306A;&#x3044;&#x57FA;&#x677F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;&#x3068;&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x6392;&#x9664;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30A8;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8AD6;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC; OmpT &#x306E;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x306A;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;Ala Arg &#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408; WT &#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x512A;&#x5148;&#x5F15;&#x6570; Arg &#x50B5;&#x5238;&#x306E;&#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;&#x5207;&#x65AD;&#x3001;&#x9175;&#x7D20; variant&#x3001;1.3.19 &#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8; 1.3.19 &#x5C55;&#x793A;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x767A;&#x660E;&#x8005;&#x9078;&#x629E;&#x6027; (-Ala Arg-/- &#x30A2;&#x30EB;&#x30BC;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3; - &#x30A2;&#x30EB;&#x30BC;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;-) &#x3068;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x5BC4;&#x308A;&#x306E;&#x57FA;&#x677F;&#x306F;&#x3001;Arg &#x5F15;&#x6570;&#x89AA;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x3068;&#x540C;&#x3058;&#x7FFC; Arg &#x80F8;&#x306E;&#x8C37;&#x9593;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x306F;&#x3001;&#x3002;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178; Ser223Arg &#x7F6E;&#x63DB;&#x3001;1.3.19 &#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x89E6;&#x5A92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x8981;&#x7D04;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&quot;&#x901A;&#x5E38; WT &#x57FA;&#x8CEA;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E; 223Arg &#x5074;&#x9396;&#x306B; OmpT &#x306E; S(1) &#x30B5;&#x30D6;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x767A;&#x898B; P(1) &#x30A2;&#x30EB;&#x30BC;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x5074;&#x9396;&#x3092;&#x30B9;&#x30EF;&#x30C3;&#x30D7;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&quot;&#x884C;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x3044;&#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027;&#x3068;&#x7D76;&#x5999;&#x306A;&#x57FA;&#x8CEA;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2; &#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3002;

&#xC808;&#xBB18; &#xD55C; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC9C4;&#xD654; &#xACFC;&#xC815;&#xC758; &#xAE0D;&#xC815; &#xBC0F; &#xBD80;&#xC815; &#xC120;&#xD0DD; &#xC555;&#xB825; &#xD6A8;&#xACFC; &#xC758;&#xD574; &#xD615;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xBA74;, &#xD6A8;&#xC18C; &#xBCC0;&#xC885; &#xC18C;&#xC124; &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3D9;&#xC758; &#xCCB4; &#xC678; &#xAC80;&#xC0AC; &#xAE30;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC131;&#xD589;&#xC704;&#xC640; &#xC790;&#xC5F0; &#xB4E4;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB0AE;&#xC740; &#xCD1D; &#xB9E4;&#xCD9C;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD559;&#xC704;&#xB97C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Multiparameter cytometry &#xC138;&#xADE0; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC6D0;&#xCE58; &#xC54A;&#xB294; &#xAE30;&#xD310; &#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; &#xC81C;&#xC678; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xC6D0;&#xD558;&#xB294; &#xC18C;&#xC124; &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC18;&#xC751;&#xC73C;&#xB85C; &#xAE0D;&#xC815;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801; &#xC555;&#xB825; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBCC0;&#xC885;&#xC758; &#xACA9;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCCB4; &#xC678;&#xB97C; &#xBAA8;&#xBC29; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; endopeptidase Ompt&#xC758; &#xBB34;&#xC791;&#xC704; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xD070; &#xB3C4;&#xC11C;&#xAD00;&#xC758; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBCC0;&#xC885;, 1.3.19, WT &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC120;&#xD638; Arg Arg &#xBCF8;&#xB4DC; &#xB300;&#xC2E0; Ala Arg &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xD2B9;&#xD788; &#xACA9;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC774;&#xB04C;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBCC0;&#xD615; 1.3.19 &#xC804;&#xC2DC; 3 &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD070; million-fold &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; (-&#xD06C; &#xB78C;-Arg-/-Arg-Arg-)&#xC640; &#xAE30;&#xBCF8; &#xAE30;&#xD310; Arg-arg.&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD80;&#xBAA8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xB294; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; Ala Arg &#xBD84;&#xC5F4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD6A8;&#xC728; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; Ser223Arg &#xB300;&#xCCB4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; 1.3.19&#xC758; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xC644;&#xC804;&#xD788; &#xC815;&#xB9AC; &#xC92C;&#xB358; &#xBCC0;&#xC885;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC;&#xC774; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &quot;&#xAD50;&#xD658;&quot; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; WT &#xAE30;&#xD310; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC5D0;&#xC11C; 223Arg &#xC0AC;&#xC774;&#xB4DC; &#xCCB4;&#xC778; Ompt&#xC758; S(1) &#xD558;&#xC704; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xACAC; P(1) Arg &#xC0AC;&#xC774;&#xB4DC; &#xCCB4;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD558; &#xC5EC; &#xC124;&#xBA85;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;.

&#xB192;&#xC740; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xC808;&#xBB18; &#xD55C; &#xAE30;&#xD310; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xC804;&#xC2DC; protease &#xBCC0;&#xC885;&#xC758; &#xACF5;&#xD559;.

La selectividad exquisita y actividad catal&iacute;tica de las enzimas han sido moldeados por los efectos de la presi&oacute;n de selecci&oacute;n positiva y negativa durante el curso de la evoluci&oacute;n. En cambio, variantes de la enzima dise&ntilde;adas mediante t&eacute;cnicas de proyecci&oacute;n in vitro para aceptar nuevos sustratos t&iacute;picamente muestran un mayor grado de promiscuidad catal&iacute;tica y menor volumen de negocios total en comparaci&oacute;n con sus contrapartes naturales. Utilizando la pantalla bacteriana y citometr&iacute;a de flujo multipar&aacute;metro, hemos desarrollado una nueva metodolog&iacute;a para emular positiva y negativa presi&oacute;n selectiva in vitro para el aislamiento de variantes de la enzima con reactividad sustratos novela deseada, mientras que simult&aacute;neamente excepto con reactividad hacia sustratos no deseados. Proyecci&oacute;n de una gran biblioteca de mutantes al azar de la endopeptidasa de coli Escherichia OmpT condujo al aislamiento de una variante del enzima, 1.3.19, que troceados un enlace pept&iacute;dico de Ala-Arg en vez de los bonos de Arg-Arg preferido por la enzima WT. 1.3.19 Variante exhibi&oacute; mayor que tres millones-veces de selectividad (- Ala - Arg-/ - Arg - Arg-) y una eficacia catal&iacute;tica para Ala-Arg escote que es igual a la mostrada por el padre para el sustrato preferido, Arg-Arg. Un solo amino&aacute;cido Ser223Arg sustituci&oacute;n se mostr&oacute; totalmente recapitular las &uacute;nicas propiedades catal&iacute;ticas de la 1.3.19 variante. Estos resultados pueden explicarse al proponer que esta mutaci&oacute;n act&uacute;a para &quot;cambiar&quot; de la cadena lateral de Arg p normalmente se encuentra en p&eacute;ptidos de sustrato WT con la cadena lateral de 223Arg en el subsitio de s de OmpT.

Ingenier&iacute;a de variantes de la proteasa que exhiben alta actividad catal&iacute;tica y selectividad de substrato exquisito.

&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC; OmpP &#x662F;&#x5C55;&#x54C1;&#x5177;&#x6709; OmpT 71%&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x5E8F;&#x5217;&#x6807;&#x8BC6;&#x7684; F &#x5BC4;&#x751F;&#x7F16;&#x7801;&#x5916;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x9176;&#x5207;&#x5272;&#x57FA;&#x677F;&#x4E3B;&#x8981;&#x5BF9;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x78B1;&#x6027;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;&#x50CF; OmpT&#xFF0C;&#x7EAF;&#x51C0;&#x7684; OmpP &#x662F;&#x6D3B;&#x52A8;&#x53EA;&#x5B58;&#x5728;&#x8102;&#x591A;&#x7CD6;&#x3002;&#x6700;&#x4F73;&#x591A;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28; OmpP &#x5C55;&#x54C1;&#x50AC;&#x5316;&#x6548;&#x7387;&#x9AD8; &#xFF08;k(cat)/K(m) = 3.0 x 10(6) M(-1)s(-1))&#x3002;&#x7531;&#x57FA;&#x677F;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x7684; OmpP &#x6269;&#x5C55;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E; Arg &#x548C; Lys &#x8F83;&#x5F3A;&#x70C8;&#x9996;&#x9009;&#x5728; P1 &#x548C; P1&#39; &#x9176;&#x7684;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x82CF;&#x6C28;&#x9178;&#x3001; &#x7CBE;&#x6C28;&#x9178;&#x3001; &#x6216; Ala &#x662F;&#x9996;&#x9009;&#x5728; P2 &#xFF1B;&#x4F4E;&#x6D53;&#x7F29;&#x94C0;&#xFF0C;Ala &#x6216; Glu &#x662F;&#x9996;&#x9009;&#x5728; P4 &#xFF1B;Arg &#x662F;&#x9996;&#x9009;&#x5728; P3&#39;&#x3002;OmpP &#x548C; OmpT &#x7684;&#x7279;&#x6B8A;&#x6027;&#x7684;&#x663E;&#x8457;&#x5DEE;&#x5F02;&#x5305;&#x62EC;&#xFF1A; OmpP &#x66F4;&#x591A;&#x80FD;&#x591F;&#x63A5;&#x53D7;&#x5728; P1 &#x6216; P1 Lys&#39;&#xFF0C;&#x7F51;&#x7AD9;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5728; OmpP &#x57FA;&#x677F; Ser &#x5728; P3 &#x7684;&#x7A81;&#x51FA;&#x5730;&#x4F4D;&#x3002;&#x540C;&#x6837;&#xFF0C;OmpP P1 &#x7F51;&#x7AD9;&#x80FD;&#x66F4;&#x597D;&#x5730;&#x9002;&#x5E94; Ser &#xFF1B;&#x5176;&#x7ED3;&#x679C;&#x662F;&#xFF0C;OmpP &#x5F97;&#x4EE5;&#x6BD4;&#x662F; OmpT &#x7EA6; 120 &#x500D;&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x5207;&#x5272;&#x4E4B;&#x95F4; Ser Arg &#x7684;&#x80BD;&#x57FA;&#x8D28;&#x3002;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;OmpP &#x548C; OmpT &#x5207;&#x5272;&#x4E0E;&#x4E09;&#x4E2A;&#x8FDE;&#x7EED; Arg &#x6B8B;&#x7559;&#x5728;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7AD9;&#x70B9;&#xFF0C;&#x5DEE;&#x5F02;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x6297;&#x83CC;&#x80BD;&#x7684;&#x5931;&#x6D3B;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x80BD;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;F &#x7684;&#x5B58;&#x5728; &#39; &#x5BC4;&#x751F;&#x7ED3;&#x679C;&#x4E2D;&#x589E;&#x52A0;&#x6297;&#x6027;&#x7684;&#x6297;&#x83CC;&#x80BD;&#x7CBE; ompT &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x548C;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x3002;

&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x5916;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x9176; OmpP &#x7684;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x3002;

&#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; OmpP 71% &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; id OmpT &#xC804;&#xC2DC; F &#xC678;&#xBD80; &#xB9C9; episome &#xC778;&#xCF54;&#xB529; protease&#xB294; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC774; &#xB450; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xC8FC;&#xB85C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xC30D; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xAE30;&#xD310; polypeptides &#xCABC;&#xAC1C; &#xB2E4;. OmpT, &#xAC19;&#xC740; &#xC21C;&#xD654; OmpP, lipopolysaccharide &#xC874;&#xC7AC;&#xD560; &#xB54C;&#xB9CC; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB418;&#xC5B4;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xC9C8;&#xACFC; OmpP &#xC804;&#xC2DC; &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xCD09;&#xB9E4; (k(cat)/K(m) 3.0 x &#xC2DC;&#xBBFC;&#xAD8C;&#xC774; M(-1)s(-1)) =. &#xAE30;&#xD310; &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; Ompp&#xC758; &#xD655;&#xC7A5;&#xB41C; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; Arg&#xC640; &#xB9AC;&#xC2A4;&#xB294; p 1&#xACFC; p 1&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xAC8C; &#xC6D0;&#xD558;&#xB294; &#xACF5;&#xAC1C; &#39; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;. &#xB610;&#xD55C;, Thr, Arg, &#xB610;&#xB294; Ala&#xB294; P2;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC120;&#xD638; &#xB808;&#xC774;, Ala &#xB610;&#xB294; Glu&#xB294; P4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC120;&#xD638; Arg&#xB294; p3&#xC5D0;&#xC11C; &#xC120;&#xD638; &#xD558;&#xB294; &#xACE0; &#39;. OmpP &#xBC0F; OmpT &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC758; &#xC8FC;&#xBAA9;&#xD560; &#xB9CC;&#xD55C; &#xCC28;&#xC774; &#xD3EC;&#xD568; P1 &#xB610;&#xB294; p 1&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9AC;&#xC2A4; &#xBC1B;&#xC544; Ompp&#xC758; &#xD070; &#xB2A5;&#xB825; &#39;, OmpP &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; p3&#xC5D0; Ser&#xC758; &#xB208; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;. &#xB9C8;&#xCC2C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xB85C;, OmpP P1 &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; Ser;&#xC744; &#xC218;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB354; &#xB098;&#xC740; &#xADF8; &#xACB0;&#xACFC;, OmpP Ser Arg &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xAE30;&#xC9C8; &#xBCF4;&#xB2E4; OmpT &#xC57D; 120 &#xBC30; &#xB354; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xCABC;&#xAC1C; &#xB2E4; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD765;&#xBBF8;&#xB86D;&#xAC8C;&#xB3C4;, OmpP &#xBC0F; OmpT &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xD56D;&#xADE0; &#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC758; &#xBE44;&#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC5D0; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; &#xB2E4;&#xB978; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xC5F0;&#xC18D; &#xB41C; Arg &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xACFC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xCABC;&#xAC1C; &#xB2E4;. &#xC774; &#xB530;&#xB77C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; F&#xC758; &#xC874;&#xC7AC; &#xD45C;&#xC2DC; &#39; episome &#xACB0;&#xACFC; &#xD56D;&#xADE0; &#xC131; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; protamine ompT &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC800;&#xD56D;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00;.

&#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC678;&#xBD80; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; Ompp&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;.

Escherichia coli OmpP is an F episome-encoded outer membrane protease that exhibits 71% amino acid sequence identity with OmpT. These two enzymes cleave substrate polypeptides primarily between pairs of basic amino acids. We found that, like OmpT, purified OmpP is active only in the presence of lipopolysaccharide. With optimal peptide substrates, OmpP exhibits high catalytic efficiency (k(cat)/K(m) = 3.0 x 10(6) M(-1)s(-1)). Analysis of the extended amino acid specificity of OmpP by substrate phage revealed that both Arg and Lys are strongly preferred at the P1 and P1' sites of the enzyme. In addition, Thr, Arg, or Ala is preferred at P2; Leu, Ala, or Glu is preferred at P4; and Arg is preferred at P3'. Notable differences in OmpP and OmpT specificities include the greater ability of OmpP to accept Lys at the P1 or P1', site as well as the prominence of Ser at P3 in OmpP substrates. Likewise, the OmpP P1 site could better accommodate Ser; as a result, OmpP was able to cleave a peptide substrate between Ser-Arg about 120 times more efficiently than was OmpT. Interestingly, OmpP and OmpT cleave peptides with three consecutive Arg residues at different sites, a difference in specificity that might be important in the inactivation of cationic antimicrobial peptides. Accordingly, we show that the presence of an F' episome results in increased resistance to the antimicrobial peptide protamine both in ompT mutants and in wild-type E. coli cells.

Substrate specificity of the Escherichia coli outer membrane protease OmpP.

Escherichia coli OmpP est une prot&eacute;ase de membrane externe &eacute;pisomes cod&eacute; F qui pr&eacute;sente l&#39;identit&eacute; de s&eacute;quence d&#39;acides amin&eacute;s 71 % avec od&egrave;le. Ces deux enzymes clivent polypeptides de substrat principalement entre des paires d&#39;acides amin&eacute;s basiques. Nous avons constat&eacute; que, comme od&egrave;le, purifi&eacute; de l&#39;OmpP est actif uniquement en pr&eacute;sence de lipopolysaccharides. Avec des substrats de peptide optimale, l&#39;OmpP pi&egrave;ces haute efficacit&eacute; catalytique (k(cat)/K(m) = 3,0 x 10 (6) M(-1)s(-1)). L&#39;analyse de la sp&eacute;cificit&eacute; de l&#39;&eacute;tendue des acides amin&eacute;s de OmpP par phage de substrat a r&eacute;v&eacute;l&eacute; que Arg et Lys sont fortement pr&eacute;f&eacute;r&eacute; au P1 et P1&#39; sites de l&#39;enzyme. En outre, Thr, Arg ou Ala est pr&eacute;f&eacute;r&eacute; &agrave; P2 ; Leu, Ala, ou la Glu est pr&eacute;f&eacute;r&eacute; &agrave; P4 ; et Arg est pr&eacute;f&eacute;r&eacute; &agrave; P3&#39;. Des diff&eacute;rences notables dans les sp&eacute;cificit&eacute;s de l&#39;OmpP et od&egrave;le incluent la capacit&eacute; plus grande de l&#39;OmpP d&#39;accepter des Lys au P1 ou P1&#39;, ainsi que l&#39;importance des Ser &agrave; P3 dans les substrats de l&#39;OmpP du site. De m&ecirc;me, le site de l&#39;OmpP P1 pourrait mieux r&eacute;pondre aux besoins Ser ; en cons&eacute;quence, l&#39;OmpP a pu en conjonction avec un substrat peptidique entre Ser-Arg environ 120 fois plus efficacement que fut od&egrave;le. Fait int&eacute;ressant, l&#39;OmpP et od&egrave;le clivent peptides avec trois r&eacute;sidus cons&eacute;cutifs d&#39;Arg sur diff&eacute;rents sites, une diff&eacute;rence de sp&eacute;cificit&eacute; qui peut &ecirc;tre importante dans l&#39;inactivation des peptides antimicrobiens cationiques. En cons&eacute;quence, nous montrons que la pr&eacute;sence d&#39;un F&#39; &eacute;pisomes entra&icirc;ne une r&eacute;sistance accrue &agrave; la protamine peptide antimicrobien od&egrave;le mutants tant dans les cellules de type sauvage e. coli.

Sp&eacute;cificit&eacute; de substrat de la prot&eacute;ase de membrane externe Escherichia coli OmpP.

Escherichia coli OmpP ist ein F Episome-codierte Au&szlig;enmembran Protease, das 71 % Aminos&auml;ure-Sequenz Identit&auml;t mit OmpT aufweist. Diese zwei Enzyme cleave Substrat Polypeptide in erster Linie zwischen Paaren von grundlegende Aminos&auml;uren. Wir fanden, dass, wie OmpT, gereinigtes OmpP nur in Anwesenheit von Lipopolysaccharid aktiv ist. Mit optimalen Peptid Substraten, OmpP weist hohen katalytischen Effizienz (k(cat)/K(m) = 3,0 X 10 6 M(-1)s(-1)). Analyse der erweiterten Aminos&auml;ure Besonderheit des OmpP von Substrat Phage ergab, dass Arg und Lys unbedingt vorzuziehen am P1 und P1 sind &#39; Seiten des Enzyms. Dar&uuml;ber hinaus wird Thr, Arg oder Ala bevorzugt bei P2; Leu, Ala, oder Glu wird bevorzugt bei P4; und Arg wird bevorzugt bei P3&#39;. Wichtige Unterschiede im OmpP und OmpT Besonderheiten geh&ouml;rt die gr&ouml;&szlig;ere F&auml;higkeit von OmpP, Lys am P1 oder P1 annehmen &#39;, Platz sowie die Prominenz der Ser auf P3 in OmpP Substrate. Ebenso konnte die OmpP P1-Website besser Ser aufnehmen; Infolgedessen konnte OmpP einem Peptid-Substrat zwischen Ser-Arg cleave etwa 120 mal effizienter als OmpT war. Interessanterweise cleave OmpP und OmpT Peptide mit drei aufeinanderfolgenden Arg R&uuml;ckst&auml;nde an verschiedenen Standorten, eine unterschiedliche Spezifit&auml;t, die in die Inaktivierung der kationische antimikrobielle Peptide wichtig sein k&ouml;nnten. Dementsprechend zeigen wir, dass die Anwesenheit von ein F&#39; Episome f&uuml;hrt zu erh&ouml;hte Resistenz gegen antimikrobielle Peptid-Protamin, sowohl in OmpT Mutanten Wildtyp E. Coli Zellen.

Substratspezifit&auml;t von Escherichia coli Au&szlig;enmembran Protease OmpP.

Escherichia coli OmpP &egrave; una proteasi di membrana esterna con codifica episome F che esibisce 71% identit&agrave; della sequenza dell&#39;amminoacido con salvataggi. Questi due enzimi fendere polipeptidi substrato principalmente tra coppie di amminoacidi basici. Abbiamo trovato che, come salvataggi, OmpP purificata &egrave; attivo solo in presenza di lipopolisaccaride. Con substrati ottimali del peptide, OmpP esibisce ad alta efficienza catalitica (k(cat)/K(m) = 3.0 x 10 M(-1)s(-1)). Analisi della specificit&agrave; estesa dell&#39;amminoacido della OmpP da fago substrato ha rivelato che sia Arg e Lys sono fortemente preferito al P1 e P1&#39; siti dell&#39;enzima. Inoltre, Ala, Arg o Thr &egrave; preferito al P2; Leu, Ala, Glu &egrave; preferito a P4; e Arg &egrave; preferito a P3&#39;. Notevoli differenze nella specificit&agrave; OmpP e salvataggi includono la capacit&agrave; maggiore dell&#39;OmpP accettare Lys a P1 o di P1&#39;, il sito cos&igrave; come il rilievo di Ser a P3 in substrati OmpP. Allo stesso modo, il sito OmpP P1 meglio poteva ospitare Ser; di conseguenza, OmpP era in grado di fendere un substrato peptidico tra Ser-Arg circa 120 volte pi&ugrave; efficiente di quanto fosse salvataggi. &Egrave; interessante notare, OmpP e salvataggi fendere peptidi con tre consecutivi residui Arg in diversi siti, una differenza nella specificit&agrave; che potrebbe essere importante per l&#39;inattivazione di peptidi antimicrobici cationici. Di conseguenza, ci mostrano che la presenza di un F&#39; episome si traduce in maggiore resistenza alla protamina peptide antimicrobico in salvataggi mutanti e nelle cellule wild-type e. coli.

Specificit&agrave; di substrato della proteasi membrana esterna Escherichia coli OmpP.

&#x5927;&#x8178;&#x83CC; OmpP 71 &#xFF05; &#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; id OmpT &#x3067;&#x5C55;&#x793A;&#x3001;F episome &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x5916;&#x819C;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089; 2 &#x3064;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x57FA;&#x8CEA;&#x30DD;&#x30EA;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x5869;&#x57FA;&#x6027;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x306E;&#x30DA;&#x30A2;&#x306E;&#x9593;&#x4E3B;&#x306B;&#x5207;&#x65AD;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;OmpT &#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x7CBE;&#x88FD; OmpP &#x30EA;&#x30DD;&#x591A;&#x7CD6;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x307F;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C3;&#x30C9;&#x57FA;&#x677F;&#x3068; OmpP &#x5C55;&#x793A;&#x9AD8;&#x89E6;&#x5A92;&#x52B9;&#x7387; (k(cat)/K(m) 3.0 x 10 (6) M(-1)s(-1)) =&#x3002;OmpP &#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x57FA;&#x8CEA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x3067;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F; Arg &#x3068; Lys &#x304C; P1 &#x3068; P1 &#x306E;&#x3067;&#x5F37;&#x304F;&#x63A8;&#x5968;&#x304C; &#39; &#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x6728;&#x3001;&#x5F15;&#x6570;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x7FFC; P2 &#x3067;&#x512A;&#x5148;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EB;&#x30FC;&#x3001;&#x7FFC;&#x307E;&#x305F;&#x306F; Glu P4 &#x3067;&#x512A;&#x5148;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Arg &#x306F; P3 &#x3067;&#x3001;&#x597D;&#x307E;&#x3057;&#x3044; &#39;&#x3002;OmpP &#x3068; OmpT &#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x9855;&#x8457;&#x306A;&#x9055;&#x3044;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059; Lys P1 &#x307E;&#x305F;&#x306F; P1 &#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x5165;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x308A;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x6A5F;&#x80FD; OmpP &#x306E; &#39;&#x3001;P3 &#x3067; Ser &#x306E;&#x5353;&#x8D8A;&#x6027; OmpP &#x57FA;&#x677F;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x3001;OmpP P1 &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3088;&#x308A; Ser &#x3092;&#x53CE;&#x5BB9;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;OmpP Ser Arg &#x9593;&#x57FA;&#x8CEA;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092; OmpT &#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x7D04; 120 &#x500D;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x5207;&#x65AD;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;OmpP &#x3068; OmpT &#x306F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; 3 &#x9023;&#x7D9A; Arg &#x6B8B;&#x57FA;&#x3001;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x6297;&#x83CC;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x4E0D;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x306E;&#x5207;&#x65AD;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;F &#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x8868;&#x793A; &#39; episome &#x6297;&#x83CC;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; &#x30D7;&#x30ED;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3; ompT &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3068;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306B;&#x62B5;&#x6297;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5916;&#x819C;&#x9175;&#x7D20; OmpP &#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3002;

Escherichia coli OmpP es una proteasa de membrana externa episome-codificado de F que exhibe la identidad de secuencia de amino&aacute;cidos de 71% con OmpT. Estas dos enzimas desdoblan polip&eacute;ptidos de sustrato principalmente entre pares de amino&aacute;cidos b&aacute;sicos. Se encontr&oacute; que, como OmpT, OmpP purificada es activa s&oacute;lo en presencia de lipopolisac&aacute;rido. Con sustratos de p&eacute;ptido &oacute;ptimo, OmpP exhibe alta eficacia catal&iacute;tica (k(cat)/K(m) = 3.0 x 10 (6) M(-1)s(-1)). An&aacute;lisis de la especificidad de la extendida del amino&aacute;cido de la OmpP por Fago sustrato revel&oacute; que Arg y Lys est&aacute;n fuertemente recomendado: P1 y P1&#39; sitios de la enzima. Adem&aacute;s, Thr, Arg o Ala es preferido en P2; Leu, Ala, o Glu es preferido en P4; y Arg es preferido en P3&#39;. Diferencias notables en las especificidades de la OmpP y OmpT incluyen la mayor capacidad de OmpP aceptar Lys en el P1 o P1&#39;, del sitio as&iacute; como la importancia de Ser en P3 en sustratos OmpP. Adem&aacute;s, el sitio de la OmpP P1 podr&iacute;a acomodar mejor Ser; como resultado, OmpP pudo allegarse un sustrato de p&eacute;ptido entre Ser-Arg cerca de 120 veces m&aacute;s eficientemente que era OmpT. Curiosamente, la OmpP y OmpT hienden p&eacute;ptidos con tres residuos de Arg consecutivos en diferentes sitios, una diferencia en la especificidad que podr&iacute;a ser importante en la inactivaci&oacute;n de p&eacute;ptidos cati&oacute;nicos antimicrobianos. Por consiguiente, se muestra que la presencia de una F&#39; episome da lugar a aumento de la resistencia a la protamina P&eacute;ptido antimicrobiano en mutantes de ompT y en c&eacute;lulas de tipo e. coli.

Especificidad de sustrato de la proteasa de membrana externa de Escherichia coli OmpP.

&#x9AD8;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x3068;&#x89E6;&#x5A92;&#x52B9;&#x7387; (kcat &#x30AD;&#x30ED;&#x76EE; 10 &#xFF08;40 M(-1) s(-1))&#x3002; &#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x306A;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x5207;&#x65AD;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F; endopeptidases &#x306E;&#x5BB6;&#x65CF;&#x304C;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x9078;&#x629E; counterselection &#x57FA;&#x677F;&#x624B;&#x6CD5;&#x306B;&#x3066;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x5909;&#x7570;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x96FB;&#x8377;&#x3001;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3; GluArg&#x3001;&#x81EA;&#x7136;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x306F;&#x307F;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x77E5;&#x8B58;&#x306B;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x5207;&#x3089;&#x50B5;&#x5238;&#x306B;&#x96A3;&#x63A5;&#x3057;&#x3066;&#x5909;&#x66F4;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5BB6;&#x65CF;&#x306E;&#x30E1;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x5C11;&#x6570;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7F6E;&#x63DB;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;(&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082; 1 &#x3064;&#x306E;&#x5834;&#x5408;) &#x512A;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x8A3C;&#x660E;&#x3002;

&#x9AD8;&#x6D3B;&#x6027;&#x30FB;&#x9AD8;&#x9078;&#x629E;&#x7684; endopeptidases &#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x3002;

&#x5DF2;&#x521B;&#x5EFA;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5185;&#x7684;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x80FD;&#x591F;&#x5288;&#x5F00;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x5E8F;&#x5217;&#x4E0E;&#x9AD8;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x548C;&#x50AC;&#x5316;&#x6548;&#x7387; (kcat/&#x516C;&#x91CC; &gt; 10 &#xFF08;40 M(-1) s(-1))&#x3002;&#x9009;&#x62E9; counterselection &#x886C;&#x5E95;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7B5B;&#x68C0;&#x5E93;&#xFF0C;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x53D8;&#x79CD;&#x88AB;&#x7F16;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x627F;&#x8BA4;&#x6709;&#x6539;&#x53D8;&#x6536;&#x8D39;&#x3001; &#x5927;&#x5C0F;&#x548C;&#x758F;&#x6C34;&#x6027;&#x5C5E;&#x6027;&#x6BD7;&#x90BB;&#x7684;&#x57FA;&#x677F;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; GluArg&#xFF0C;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x77E5;&#x8BC6;&#x4E0D;&#x5929;&#x7136;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4E2D;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684; scissile &#x503A;&#x5238;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x5BB6;&#x65CF;&#x6210;&#x5458;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8F83;&#x5C11;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7684;&#x66FF;&#x6362;&#xFF0C;&#xFF08;&#x81F3;&#x5C11;&#x5728;&#x4E00;&#x79CD;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;) &#x88AB;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x4E0A;&#x4F4D;&#x3002;

&#x9AD8;&#x5EA6;&#x6D3B;&#x8DC3;&#x3001; &#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x5185;&#x4E0E;&#x7A0B;&#x63A7;&#x7684;&#x57FA;&#x677F;&#x7684;&#x5177;&#x4F53;&#x60C5;&#x51B5;&#x3002;

A family of engineered endopeptidases has been created that is capable of cleaving a diverse array of peptide sequences with high selectivity and catalytic efficiency (kcat/KM > 10(40 M(- 1) s(- 1)). By screening libraries with a selection-counterselection substrate method, protease variants were programmed to recognize amino acids having altered charge, size and hydrophobicity properties adjacent to the scissile bond of the substrate, including GluArg, a specificity that to our knowledge has not been observed among natural proteases. Members of this artificial protease family resulted from a relatively small number of amino acid substitutions that (at least in one case) proved to be epistatic.

Highly active and selective endopeptidases with programmed substrate specificities.

Une famille d&#39;endopeptidases ing&eacute;nieries a &eacute;t&eacute; cr&eacute;&eacute;e qui est capable de cliver un large &eacute;ventail de s&eacute;quences peptidiques avec une s&eacute;lectivit&eacute; &eacute;lev&eacute;e et une efficacit&eacute; catalytique (kcat/KM &gt; 10 (40 M(-1) s(-1)). Par les biblioth&egrave;ques de contr&ocirc;le avec une m&eacute;thode de s&eacute;lection-contre-s&eacute;lection substrat, variantes de prot&eacute;ase ont &eacute;t&eacute; programm&eacute;s pour reconna&icirc;tre des acides amin&eacute;s ayant alt&eacute;r&eacute; frais, de taille et d&#39;hydrophobicit&eacute; propri&eacute;t&eacute;s adjacentes &agrave; la liaison se du substrat, y compris GluArg, une sp&eacute;cificit&eacute; qui, &agrave; notre connaissance, n&#39;a pas &eacute;t&eacute; observ&eacute;e chez les prot&eacute;ases naturelles. Membres de cette famille de prot&eacute;ases artificiel r&eacute;sultent d&#39;un nombre relativement restreint de substitutions d&#39;acides amin&eacute;s qui (au moins dans un cas) s&#39;est av&eacute;r&eacute; &eacute;pistatique.

Endopeptidases hautement actifs et s&eacute;lectifs avec des sp&eacute;cificit&eacute;s de substrat programm&eacute;e.

Eine Familie von ver&auml;nderter Endopeptidases wurde erstellt, der Splei&szlig;en einer Vielzahl von Peptidsequenzen mit hoher Selektivit&auml;t und katalytische Effizienz (Kcat/KM &gt; 10 (40 M(-1) s(-1)). Durch screening Bibliotheken mit einer Auswahl-Counterselection-Substrat-Methode, wurden Protease Varianten programmiert, erkennen von Aminos&auml;uren, die Ladung, die Gr&ouml;&szlig;e und die Hydrophobie Eigenschaften angrenzend an die scissile Bindung des Substrats, einschlie&szlig;lich GluArg, eine Besonderheit, die nach unserem Wissen nicht unter nat&uuml;rlichen Proteasen beobachtet wurde ge&auml;ndert haben. Mitglieder dieser k&uuml;nstlichen Protease-Familie resultierte aus eine relativ kleine Anzahl von Aminos&auml;ure-Ersetzungen, die (zumindest in einem Fall) erwies sich als epistatic.

Sehr aktive und selektive Endopeptidases mit programmierten Substrat Besonderheiten.

&Egrave; stata creata una famiglia di ingegneria endopeptidases che &egrave; in grado di scissione di una gamma diversificata di sequenze peptidiche con elevata selettivit&agrave; ed efficienza catalitica (kcat/KM &amp;gt; 10 (40 M(-1) s(-1)). Da librerie di screening con un metodo di selezione-counterselection substrato, varianti di proteasi sono stati programmati per riconoscere gli amminoacidi avendo alterato la carica, dimensioni e idrofobicit&agrave; propriet&agrave; adiacente al scissile legame del substrato, tra cui GluArg, una specificit&agrave; che a nostra conoscenza non &egrave; stata osservata tra le proteasi naturali. Membri di questa famiglia di proteasi artificiale derivato da un numero relativamente piccolo di aminoacidiche che (almeno in un caso) ha dimostrato di essere epistatici.

Endopeptidases altamente attivo e selettivo con specificit&agrave; di substrato programmata.

&#xC870;&#xC791;&#xB41C; endopeptidases &#xC81C;&#xD488;&#xAD70;&#xC774; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD6A8;&#xC728; (&#xB3C4;&#xC2EC; &#xACF5;&#xD56D;/KM &amp;gt; 10 (40 M(-1) s(-1)) &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xACE0;&#xCC29; &#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294;. &#xC120;&#xD0DD; counterselection &#xAE30;&#xD310; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCC0;&#xD615; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0; &#xCDA9;&#xC804;, &#xD06C;&#xAE30; &#xBC0F; hydrophobicity &#xC18D;&#xC131; GluArg, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC9C0;&#xC2DD; &#xAC00;&#xC6B4;&#xB370; &#xC790;&#xC5F0; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; &#xD558;&#xC9C0; &#xAD00;&#xCC30; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; scissile &#xBCF8;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xC778;&#xC811; &#xD55C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC778;&#xC2DD; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB798;&#xBC0D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC778;&#xACF5; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; &#xC81C; &#xAC00;&#xC871;&#xC758; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xB97C; &#xD568;&#xC720;&#xD55C; &#xC0B0; &#xC131; &#xB300;&#xCCB4;&#xC758; &#xBE44;&#xAD50;&#xC801; &#xC801;&#xC740; &#xC218;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; (&#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xD55C; &#xACBD;&#xC6B0;) epistatic &#xAC83;&#xC744; &#xC785;&#xC99D; &#xD588;&#xB2E4;.

&#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB798;&#xBC0D; &#xB41C; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC778; endopeptidases.

Se ha creado una familia de ingenier&iacute;a endopeptidasas que es capaz de unirse a una gran variedad de secuencias de p&eacute;ptidos con alta selectividad y eficacia catal&iacute;tica (kcat/KM &gt; 10 (40 M(-1) s(-1)). Por proyecci&oacute;n bibliotecas con un m&eacute;todo de selecci&oacute;n-counterselection sustrato, variantes de proteasa estaban programadas para reconocer haber alterado la carga, el tama&ntilde;o y la hidrofobicidad propiedades adyacentes al enlace scissile del sustrato, incluyendo GluArg, una especificidad que, a nuestro conocimiento, no se ha observado entre proteasas naturales de amino&aacute;cidos. Miembros de esta familia de proteasa artificial resultaron de un n&uacute;mero relativamente peque&ntilde;o de substituciones del amino&aacute;cido que (al menos en un caso) demostr&oacute; para ser epist&aacute;ticas.

Endopeptidasas altamente activas y selectivas con especificidad de sustrato programada.

&#x5177;&#x4F53;&#x540E;&#x786B;&#x9178;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x88C2;&#x7684;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x3002;

An engineered protease that cleaves specifically after sulfated tyrosine.

Une prot&eacute;ase machin&eacute;e qui s&#39;attache plus particuli&egrave;rement apr&egrave;s la tyrosine sulfat&eacute;e.

Ein ver&auml;nderter Protease, die speziell nach sulfatiertes Tyrosin spaltet.

Una proteasi ingegnerizzati che fende in particolare dopo la tirosina solfato.

&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x306F;&#x786B;&#x9178;&#x5316;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5F8C;&#x5207;&#x65AD;&#x3059;&#x308B;&#x3001;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3002;

Sulfated &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD6C4; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC55E;&#xC744; &#xC124;&#xACC4;&#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;.

Una proteasa ingenier&iacute;a que hiende espec&iacute;ficamente despu&eacute;s de tirosina sulfatada.

&#x672C;&#x6587;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7528;&#x4E8E;&#x4FEE;&#x6539;&#x8868;&#x793A;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x7684;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x7684;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x56FE;&#x4E66;&#x9986;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x672C;&#x673A;&#x5916;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#xFF0C;OmpT&#xFF0C;&#x88AB;&#x7528;&#x4F5C;&#x4E00;&#x79CD;&#x6A21;&#x578B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B; &#x4F7F;&#x7528;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x7684;&#x4F9D;&#x8D56;&#xFF0C;&#x5BB9;&#x6613;&#x9002;&#x5E94;&#x4FE1;&#x606F;&#xFF0C;&#x5047;&#x5B9A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7F51;&#x7AD9;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x6709;&#x4EFB;&#x4F55;&#x9176;&#x3002;&#x65E5;&#x76CA;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x5E93;&#x53EF;&#x4EE5;&#x751F;&#x6210;&#x4EE5;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x548C;&#x7504;&#x522B;&#x4F7F;&#x7528;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F; (&#x8367;&#x5149;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x9009;&#x3001; &#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#xFF09; &#x663E;&#x793A;&#x66F4;&#x6539;&#x7684;&#x51FD;&#x6570;&#x7684;&#x53D8;&#x4F53;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5982;&#x679C;&#x4E0D;&#x9610;&#x660E;&#x4E86;&#x886C;&#x5E95;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x53E3;&#x888B;&#xFF0C;&#x5C40;&#x90E8;&#x591A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x9971;&#x548C;&#x56FE;&#x4E66;&#x9986;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#x88AB;&#x63D0;&#x51FA;&#x7684;&#x5141;&#x8BB8;&#x53D6;&#x6837;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x7EF4;&#x6301;&#x9002;&#x5F53;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x6574;&#x4E2A;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x5F00;&#x59CB;&#x5230;&#x7ED3;&#x675F;&#xFF0C;&#x5E94;&#x91C7;&#x53D6;&#x5927;&#x7EA6; 2-3 &#x5468;&#x3002;

&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x9176;&#x56FE;&#x4E66;&#x9986;&#x7684;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x4E0E;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x7B5B;&#x67E5;&#x3002;

Herein, we describe a methodology for the construction of targeted libraries intended to modify the substrate specificity of proteases expressed on the cell surface of Escherichia coli. The native outer membrane protease, OmpT, is used as a model system. The protocol relies on gene assembly using oligonucleotides and is easily adaptable to any enzyme in which information is available on the putative active site residues. Increasingly complex libraries can be generated in a systematic manner and screened using flow cytometry (fluorescence-activated cell sorting, FACS) for variants displaying altered function. Furthermore, if the substrate-binding pockets have not been elucidated, a protocol for partial multi-site saturation library construction is presented that allows for sampling a large number of residues, while maintaining an appropriate level of protein function. The entire procedure, from start to finish, should take approximately 2-3 weeks.

Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries.

Ici, nous d&eacute;crivons une m&eacute;thodologie pour la construction de biblioth&egrave;ques cibl&eacute;es visant &agrave; modifier la sp&eacute;cificit&eacute; de substrat de prot&eacute;ases exprim&eacute;e &agrave; la surface de cellules d&#39;Escherichia coli. La prot&eacute;ase native de la membrane externe, od&egrave;le, est utilis&eacute;e comme syst&egrave;me mod&egrave;le. Le protocole repose sur l&#39;assemblage de g&egrave;nes &agrave; l&#39;aide d&#39;oligonucl&eacute;otides et est facilement adaptable &agrave; n&#39;importe quel enzyme dans lequel les informations sont disponibles sur les r&eacute;sidus du site actif putatif. Biblioth&egrave;ques de plus en plus complexes peuvent &ecirc;tre g&eacute;n&eacute;r&eacute;s de mani&egrave;re syst&eacute;matique et projet&eacute; &agrave; l&#39;aide de cytom&eacute;trie en flux (fluorescence-lanc&eacute;e de cellules tri, FACS) pour afficher la fonction alt&eacute;r&eacute;e de variantes. En outre, si les poches de la liaison du substrat n&#39;ont pas &eacute;t&eacute; &eacute;lucid&eacute;s, un protocole pour la construction de biblioth&egrave;que de saturation multi-sites partielle est pr&eacute;sent&eacute; qui permet pour l&#39;&eacute;chantillonnage d&#39;un grand nombre de r&eacute;sidus, tout en conservant un niveau appropri&eacute; de la fonction des prot&eacute;ines. L&#39;ensemble de la proc&eacute;dure, de bout en bout, devrait prendre environ 2-3 semaines.

Construction et &eacute;coulement par cytom&eacute;trie en flux d&eacute;pistage des biblioth&egrave;ques de l&#39;enzyme cibl&eacute;e.

Hier beschreiben wir eine Methodik f&uuml;r den Bau von gezielten Bibliotheken gedacht, die Substratspezifit&auml;t der Proteasen ausgedr&uuml;ckt auf der Zelloberfl&auml;che von Escherichia coli zu &auml;ndern. Die native Au&szlig;enmembran Protease, OmpT, dient als Modellsystem. Das Protokoll basiert auf Gen Assembly mithilfe von Oligonukleotiden und ist leicht anpassbar an jedes Enzym, in denen Informationen &uuml;ber die vermeintliche aktive Website-R&uuml;ckst&auml;nde verf&uuml;gbar ist. Zunehmend komplexere Bibliotheken erzeugt werden, systematisch und abgeschirmt mit Durchflusszytometrie (Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren, FACS) f&uuml;r Varianten anzeigen ver&auml;nderte Funktion. Wenn die Substrat bindenden Taschen nicht gekl&auml;rt haben, ist dar&uuml;ber hinaus ein Protokoll f&uuml;r partielle Multisite S&auml;ttigung Bibliotheksbau dargestellt, das erm&ouml;glicht eine gro&szlig;e Anzahl von R&uuml;ckst&auml;nde, und gleichzeitig einen angemessenen Proteinfunktion Probenahme. Die gesamte Prozedur dauert von Anfang bis Ende, ca. 2-3 Wochen.

Bau und Flow Cytometric Screening gezielte Enzymbibliotheken.

Qui, descriviamo una metodologia per la costruzione di librerie mirate destinati a modificare la specificit&agrave; di substrato della proteasi espressi sulla superficie delle cellule di Escherichia coli. La proteasi di membrana esterna nativo, salvataggi, &egrave; utilizzata come sistema di modello. Il protocollo si basa sull&#39;Assemblea gene utilizzando oligonucleotidi ed &egrave; facilmente adattabile a qualsiasi enzima in cui le informazioni sono disponibili sui residui putativo sito attivo. Librerie sempre pi&ugrave; complesse possono essere generate in modo sistematico e proiettati mediante citometria a flusso (fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento, FACS) per varianti visualizzazione alterata funzione. Inoltre, se non, non &egrave; state chiarite la tasche di substrato-associazione, un protocollo per la costruzione della libreria parziale saturazione multisito &egrave; presentato che permette per il campionamento di un gran numero di residui, pur mantenendo un adeguato livello di funzione della proteina. L&#39;intera procedura, dall&#39;inizio alla fine, dovrebbe prendere circa 2-3 settimane.

Costruzione e flusso cytometric screening di librerie di enzima mirati.

&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3059;&#x308B;&#x5BFE;&#x8C61;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x306E;&#x69CB;&#x7BC9;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;OmpT&#x3001;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x5916;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3;&#x9175;&#x7D20;&#x7CFB;&#x3092;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x306E;&#x63A8;&#x5B9A;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x6B8B;&#x57FA;&#x304C;&#x3059;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x306B;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;&#x9069;&#x5FDC;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x3059;&#x307E;&#x3059;&#x8907;&#x96D1;&#x5316;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x3092;&#x7CFB;&#x7D71;&#x7684;&#x306B;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC; (&#x86CD;&#x5149;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x4E26;&#x3079;&#x66FF;&#x3048;&#x3001;FACS) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x95A2;&#x6570;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3059;&#x308B;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x9078;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x30DD;&#x30B1;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F;&#x89E3;&#x660E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x5834;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306A;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x98FD;&#x548C;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x69CB;&#x7BC9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x591A;&#x6570;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x305F;.&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x958B;&#x59CB;&#x304B;&#x3089;&#x7D42;&#x4E86;&#x307E;&#x3067;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x7D04; 2 &#x301C; 3 &#x9031;&#x9593;&#x3092;&#x53D6;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x76EE;&#x6A19;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9175;&#x7D20;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3068;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;

&#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544;&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xC218;&#xC815; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758; &#xAD6C;&#xCD95;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860; &#xC124;&#xBA85;. &#xAE30;&#xBCF8; &#xC678;&#xBD80; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; protease OmpT, &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xACFC; oligonucleotides&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; putative &#xC561;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC801;&#xC751;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC810;&#xC810; &#xB354; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; cytometry (&#xD615;&#xAD11; &#xD65C;&#xC131; &#xC140; &#xC815;&#xB82C;, FACS)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCC0;&#xACBD; &#xB41C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xBCC0;&#xD615;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C1;&#xC601;. &#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC8FC;&#xBA38;&#xB2C8; &#xD574;&#xBA85; &#xD558;&#xC9C0;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xB610;&#xD55C;, &#xBD80;&#xBD84; &#xBA40;&#xD2F0; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xCC44;&#xB3C4; &#xB3C4;&#xC11C;&#xAD00; &#xAC74;&#xCD95;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xB9CE;&#xC740; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;, &#xC0D8;&#xD50C;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC804;&#xCCB4; &#xC808;&#xCC28;&#xB97C; &#xCC98;&#xC74C;&#xBD80;&#xD130; &#xB05D;&#xAE4C;&#xC9C0;, &#xC57D; 2-3 &#xC8FC; &#xC18C;&#xC694; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAC74;&#xC124; &#xBC0F; &#xD750;&#xB984; cytometric &#xC2EC;&#xC0AC; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758;.

En este documento, se describe una metodolog&iacute;a para la construcci&oacute;n de bibliotecas espec&iacute;ficas que pretende modificar la especificidad de sustrato de proteasas expresado en la superficie celular de Escherichia coli. La proteasa de la membrana externa nativo, OmpT, se utiliza como modelo. El protocolo se basa en el conjunto de genes utilizando oligonucle&oacute;tidos y es f&aacute;cilmente adaptable a cualquier enzima en el que la informaci&oacute;n est&aacute; disponible en los residuos de la supuesta sitio activo. Bibliotecas cada vez m&aacute;s complejas pueden generarse de manera sistem&aacute;tica y defendido mediante citometr&iacute;a de flujo (c&eacute;lulas activado por fluorescencia clasificaci&oacute;n, FACS) para mostrar la alteraci&oacute;n de la funci&oacute;n de variantes. Adem&aacute;s, si no se han aclarado los bolsillos de uni&oacute;n a sustrato, se presenta un protocolo para la construcci&oacute;n de la biblioteca de saturaci&oacute;n multisitio parcial que permite para el muestreo de una gran cantidad de residuos, manteniendo un nivel adecuado de funci&oacute;n de la prote&iacute;na. El proceso, de principio a fin, debe tomar aproximadamente 2-3 semanas.

Construcci&oacute;n y flujo cytometric proyecci&oacute;n de bibliotecas de enzimas espec&iacute;ficas.

&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x7684;&#x9AD8;&#x6D3B;&#x6027;&#x9694;&#x79BB; &#xFF08;k(cat)/K(M) &#x7EA6;&#x53D8;&#x79CD;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x80BD;&#x94FE;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x50AC;&#x5316;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x80BD;&#x6C34;&#x89E3;&#x540E; 3-&#x785D;&#x57FA;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7684;&#x540C;&#x65F6;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x6B67;&#x89C6;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x80BD; (160-fold)&#xFF0C;&#x5305;&#x542B;&#x672A;&#x4FEE;&#x6539;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178; sulfotyrosine (3600-fold)&#xFF0C;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7684; OmpT &#x7684; 10(5) M(-1)s(-1)) (&gt; 8000-fold)&#xFF0C;&#x548C;&#x4E1D;&#x6C28;&#x9178; (&gt; 8000-fold)&#x3002;&#x53EF;&#x4EE5;&#x533A;&#x5206;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x7684;&#x6587;&#x5316;&#x9057;&#x8FF9;&#x7684;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x540E;&#x4FEE;&#x9970;&#x7684;&#x80BD;&#x94FE;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x53D8;&#x4F53;&#x5206;&#x79BB;&#x53D1;&#x53EF;&#x80FD;&#x5B9E;&#x65BD;&#x7684;&#x5927;&#x578B;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x5E93;&#x7B5B;&#x9009;&#x591A;&#x8272;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x591A;&#x8272;&#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x9009;&#x9879;&#x886C;&#x5E95;&#x662F;&#x540C;&#x65F6;&#x4F7F;&#x7528;&#x591A;&#x4E2A; counterselection &#x8367;&#x5149;&#x886C;&#x5E95;&#x9694;&#x79BB;&#x663E;&#x793A;&#x7CBE;&#x7EC6;&#x8C03;&#x8C10;&#x7684;&#x57FA;&#x7247;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7684;&#x7F55;&#x89C1;&#x9176;&#x53D8;&#x79CD;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6F14;&#x793A;&#x4E0E;&#x7CBE;&#x81F4;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x9176;&#x53EF;&#x4EE5;&#x9694;&#x79BB;&#x4ECE;&#x5927;&#x578B;&#x56FE;&#x4E66;&#x9986;&#x4F7F;&#x7528;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x7B5B;&#x9009;&#x65B9;&#x6CD5;&#x548C;&#x6784;&#x6210;&#x751F;&#x4EA7; 3-&#x785D;&#x57FA;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;-&#x7279;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x4E00;&#x6B65;&#x3002;

&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x533A;&#x5206;&#x4E0D;&#x540C;&#x53CA;&#x5176;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7269;&#x5F62;&#x5F0F;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x4F7F;&#x7528;&#x591A;&#x8272;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F;&#x3002;

We report the isolation of a highly active (k(cat)/K(M) approximately 10(5) M(-1)s(-1)) variant of the E. coli endopeptidase OmpT that selectively hydrolyzes peptides after 3-nitrotyrosine while effectively discriminating against similar peptides containing unmodified tyrosine (160-fold), sulfotyrosine (3600-fold), phosphotyrosine (>8000-fold), and phosphoserine (>8000-fold). The isolation of endopeptidase variants that can discriminate between substrates based on the post-translational modification of Tyr was made possible by implementing a multicolor flow cytometric assay for the screening of large mutant libraries. For the multicolor assay, a desired selection substrate was used simultaneously with multiple counterselection fluorescent substrates to isolate rare enzyme variants that displayed finely tuned substrate specificity. This work demonstrates that enzymes with exquisite selectivity can be isolated from large libraries using appropriate high throughput screening approaches and constitutes a critical step toward the production of a 3-nitrotyrosine-specific protease useful for proteomic applications.

Proteases that can distinguish among different post-translational forms of tyrosine engineered using multicolor flow cytometry.

Les auteurs rapportent l&#39;isolement d&#39;un tr&egrave;s actif (k(cat)/K(M) environ 10 5 M(-1)s(-1)) variante de l&#39;endopeptidase d&#39;e. coli od&egrave;le qui hydrolyse s&eacute;lectivement le peptides apr&egrave;s 3-nitrotyrosine tandis que discriminer efficacement les peptides similaires contenant de la tyrosine non modifi&eacute; (160-fold), sulfotyrosine (3600-fold), phosphotyrosine (&gt; 8000-fold) et la phosphos&eacute;rine (&gt; 8000-fold). L&#39;isolement des variantes endopeptidase qui peut distinguer les substrats bas&eacute;s sur la modification post-traductionnelle de Tyr a &eacute;t&eacute; rendue possible en mettant en place un multicolor flow cytometric assay pour le d&eacute;pistage des grandes biblioth&egrave;ques de mutants. Pour le dosage multicolor, un substrat de s&eacute;lection d&eacute;sir&eacute;e servait simultan&eacute;ment avec plusieurs substrats fluorescents de contre-s&eacute;lection pour isoler les variantes rares enzyme qui affiche la sp&eacute;cificit&eacute; de substrat finement r&eacute;gl&eacute;. Ce travail d&eacute;montre que les enzymes avec s&eacute;lectivit&eacute; exquise peuvent &ecirc;tre isol&eacute;s des grandes biblioth&egrave;ques utilisant appropri&eacute; approches de criblage &eacute;lev&eacute; et constituent une &eacute;tape cruciale vers la production d&#39;une prot&eacute;ase sp&eacute;cifique 3-nitrotyrosine utile pour les applications de la prot&eacute;omique.

Prot&eacute;ases qui peuvent distinguer les diff&eacute;rentes formes post-traductionnelles de tyrosine con&ccedil;u &agrave; l&#39;aide de multicolor cytom&eacute;trie en flux.

Wir berichten die Isolation einer hochaktiven (k(cat)/K(M) ca. 10 Absatz 5 M(-1)s(-1)) Variante von der E. Coli-Endopeptidase OmpT, die selektiv Peptide nach 3-Nitrotyrosine beim effektiv diskriminieren &auml;hnliche Peptide mit unver&auml;nderten Tyrosin (160-fold), Sulfotyrosine (3600-fold), Spalten Phosphotyrosine (&gt; 8000-fold), und Phosphoserinphosphatase (&gt; 8000-fold). Die Isolation der Endopeptidase-Varianten, die Substrate, die auf der Grundlage der post-translationale Modifikation von Tyr unterscheiden k&ouml;nnen wurde m&ouml;glich durch die Implementierung einer mehrfarbigen flie&szlig;en Cytometric Tests f&uuml;r das Screening von gro&szlig;en mutant Bibliotheken. F&uuml;r den mehrfarbigen-Assay war eine gew&uuml;nschte Auswahl-Substrat gleichzeitig mit mehreren Counterselection fluoreszierende Substrate verwendet, um seltene Enzymvarianten zu isolieren, die fein abgestimmte Substratspezifit&auml;t angezeigt. Diese Arbeit zeigt, dass Enzyme mit exquisiten Selektivit&auml;t aus gro&szlig;en Bibliotheken mit entsprechenden high-Throughput screening Ans&auml;tze isoliert werden k&ouml;nnen und einen entscheidenden Schritt in Richtung der Produktion von einer 3-Nitrotyrosine-spezifische Protease f&uuml;r Proteomic Anwendungen n&uuml;tzlich stellt.

Proteasen, die unter verschiedenen POSTTRANSLATIONELLE Formen Tyrosin entwickelt mit mehrfarbigen unterscheiden k&ouml;nnen Durchflusszytometrie.

Riportiamo l&#39;isolamento di un attivissimo (k(cat)/K(M) circa 5 M(-1)s(-1)) variante dell&#39;e. coli endopeptidasi salvataggi che idrolizza selettivamente peptidi dopo 3-nitrotyrosine mentre efficacemente discriminando contro peptidi simili contenenti tirosina non modificato (160-fold), sulfotyrosine (3600-fold), phosphotyrosine (&amp;gt; 8000-fold) e phosphoserine (&amp;gt; 8000-fold). L&#39;isolamento delle varianti endopeptidasi che pu&ograve; discriminare tra substrati basati sulla modifica alberino-di traduzione di Tyr &egrave; stato reso possibile mediante l&#39;implementazione di un dosaggio di cytometric di flusso multicolor per lo screening di grandi biblioteche mutante. Per il dosaggio di multicolor, un substrato di selezione desiderata &egrave; stato utilizzato simultaneamente con pi&ugrave; substrati fluorescenti counterselection per isolare varianti rare enzima che visualizzato specificit&agrave; di substrato finemente sintonizzato. Questo lavoro dimostra che gli enzimi con squisita selettivit&agrave; possono essere isolati da grandi biblioteche utilizzando appropriati high throughput screening approcci e costituiscono un passo fondamentale verso la produzione di una proteasi 3-nitrotyrosine-specifiche utile per applicazioni proteomic.

Le proteasi che possono distinguere tra diverse forme di alberino-di traduzione di tirosina progettato utilizzando multicolor citometria a fluiscono.

&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x9AD8;&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x5206;&#x96E2; (k(cat)/K(M) &#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; sulfotyrosine &#x985E;&#x4F3C;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9; (160-fold)&#x3001;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3092;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089; 3-&#x30CB;&#x30C8;&#x30ED;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5F8C; (3600-fold) &#x3059;&#x308B; OmpT &#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E; M(-1)s(-1)) &#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x7D04; 10 (5) (&#x76EE; 8000-fold&#xFF09; &#x3068;&#x5F79;&#x5272; (&#x76EE; 8000-fold&#xFF09;&#x3002;Tyr &#x306E;&#x4FEE;&#x98FE;&#x57FA;&#x677F;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC; &#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x3001;&#x591A;&#x8272;&#x306E;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5B9F;&#x88C5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x591A;&#x8272;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x9078;&#x629E;&#x57FA;&#x677F;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x7D30;&#x304B;&#x304F;&#x8ABF;&#x6574;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x307E;&#x308C;&#x306A;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x8907;&#x6570; counterselection &#x86CD;&#x5149;&#x57FA;&#x677F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x7D76;&#x5999;&#x306A;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x3068;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; &#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0; &#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x304B;&#x3089;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30FC;&#x30E0; &#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x5F79;&#x306B;&#x7ACB;&#x3064; 3-&#x30CB;&#x30C8;&#x30ED;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x56FA;&#x6709;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3092;&#x69CB;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x591A;&#x8272;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7FFB;&#x8A33;&#x5F8C;&#x4FEE;&#x98FE;&#x5F62;&#x5F0F;&#x306E;&#x9593;&#x3067;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3002;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xD65C;&#xC131;&#xC758; &#xACA9;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C; (k(cat)/K(M) &#xC57D; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; endopeptidase OmpT &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xD6C4; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; sulfotyrosine &#xC720;&#xC0AC; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; (160-fold), &#xC218;&#xC815; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;&#xC774; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC28;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; 3-nitrotyrosine (3600-fold) hydrolyzes phosphotyrosine 10(5) M(-1)s(-1)) &#xBCC0;&#xC885; (&amp;gt; 8000-fold), &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; phosphoserine (&amp;gt; 8000-fold). Tyr &#xD3EC;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBC88;&#xC5ED; &#xC0C1; &#xC218;&#xC815;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAE30;&#xD310; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xCC28;&#xBCC4;&#xC744; &#xC218; endopeptidase &#xBCC0;&#xC885; &#xBD84;&#xB9AC; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xB300;&#xD615; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBE5B;&#xAE54;&#xC758; &#xD750;&#xB984; cytometric &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xAD6C;&#xD604; &#xD558; &#xC5EC; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5B4;&#xC84C;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBE5B;&#xAE54;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xB300; &#xD55C; &#xC6D0;&#xD558;&#xB294; &#xC120;&#xD0DD; &#xAE30;&#xD310;&#xC740; &#xC138;&#xBC00; &#xD558; &#xAC8C; &#xC870;&#xC815; &#xB41C; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xBCF4;&#xAE30; &#xB4DC;&#xBB38; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBCC0;&#xC885; &#xACA9;&#xB9AC; &#xC5EC;&#xB7EC; counterselection &#xD615;&#xAD11; &#xAE30;&#xD310;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC791;&#xD488; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC808;&#xBB18; &#xD55C; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xD568;&#xAED8; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD558;&#xB294; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD070; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACA9;&#xB9AC; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; proteomic &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; 3 nitrotyrosine &#xD2B9;&#xC815; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xD5A5;&#xD574; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB97C; &#xAD6C;&#xC131; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBA40;&#xD2F0; &#xCEEC;&#xB7EC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB2E2; &#xD615;&#xD0DC; &#xC0AC;&#xC774;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xBCC4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xD504;&#xB85C; &#xD14C;&#xC544; cytometry &#xD750;&#xB984;.

Divulgamos el aislamiento de un altamente activo (k(cat)/K(M) aproximadamente 10 M(-1)s(-1)) variante de la endopeptidasa de e. coli OmpT que hidroliza selectivamente p&eacute;ptidos despu&eacute;s de 3-nitrotirosina mientras efectivamente discriminar contra p&eacute;ptidos similares que contienen tirosina sin modificar (160-fold), sulfotyrosine (3600-fold), phosphotyrosine (&gt; 8000-fold) y la Fosfoserina (&gt; 8000-fold). El aislamiento de variantes de la endopeptidasa que puede discriminar entre sustratos basados en la modificaci&oacute;n poste-de translaci&oacute;n de Tyr fue posible mediante la aplicaci&oacute;n de un an&aacute;lisis de citometr&iacute;a de flujo multicolor para la proyecci&oacute;n de grandes bibliotecas mutantes. Para el an&aacute;lisis multicolor, un sustrato de selecci&oacute;n deseada fue utilizado simult&aacute;neamente con m&uacute;ltiples sustratos fluorescente de counterselection para aislar variantes raras de la enzima que muestra especificidad de sustrato finamente sintonizada. Este trabajo demuestra que las enzimas con selectividad exquisita pueden ser aisladas de grandes bibliotecas usando apropiado alto rendimiento detecci&oacute;n enfoques y constituyen un paso crucial hacia la producci&oacute;n de una proteasa espec&iacute;fica 3-nitrotirosina &uacute;til para aplicaciones de la prote&oacute;mica.

Las proteasas que pueden distinguir entre diferentes formas de poste-de translaci&oacute;n de tirosina dise&ntilde;ado usando multicolor citometr&iacute;a de flujo.

CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#x662F;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x611F;&#x67D3;&#x7684;&#x81EA;&#x9002;&#x5E94;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5173;&#x952E;&#x7EC4;&#x6210;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x7684; CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#x53CD;&#x5E94;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x662F;&#x4E3A;&#x6301;&#x7EED;&#x7684;&#x6162;&#x6027;&#x611F;&#x67D3;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2;&#x611F;&#x67D3;&#x540E;&#x4EA7;&#x751F;&#x8D1F;&#x90E8;&#x5206;&#x8D23;&#x4EFB;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#x8981;&#x786E;&#x5B9A;&#x5982;&#x4F55;&#x5B9A;&#x4E49;&#x4F55;&#x8C13;&#x9002;&#x5F53;&#x6216;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &gamma; &#x751F;&#x4EA7;&#x4E00;&#x76F4;&#x88AB;&#x7528;&#x4F5C;&#x8861;&#x91CF; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x4F46;&#x7EC6;&#x80DE;&#x56E0;&#x5B50;&#x751F;&#x4EA7;&#x548C;&#x81EA;&#x6EB6;&#x75C5;&#x6BD2;&#x611F;&#x67D3;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x80FD;&#x529B;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x5173;&#x7CFB;&#x4E0D;&#x6E05;&#x695A;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x8BC4;&#x4F30;&#x591A;&#x4E2A; CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x4E0E;&#x4F7F;&#x7528;&#x65B0;&#x9C9C;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x51B3;&#x8BAE;&#x80FD;&#x529B;&#x9694;&#x79BB;&#x8840;&#x6DB2;&#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x5E76;&#x968F;&#x540E;&#x6062;&#x590D;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x8FDB;&#x884C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x4E00;&#x76F4;&#x672A;&#x80FD;&#x5B9E;&#x73B0;&#x3002;&#x6B64;&#x5904;&#x6240;&#x8FF0;&#xFF0C;&#x4E3A;&#x4E86;&#x6EE1;&#x8DB3;&#x8FD9;&#x4E00;&#x9700;&#x8981;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5236;&#x8BA2;&#x4E86;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x3001; 125 pl &#x5FAE;&#x5B54;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x8BC4;&#x4F30;&#x4E2A;&#x522B; CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#x611F;&#x67D3;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684;&#x60A3;&#x8005;&#x4ECE;&#x6210;&#x5343;&#x4E0A;&#x4E07;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x6765;&#x8C03;&#x89E3;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5E76;&#x4EA7;&#x751F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x81EA;&#x52A8;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5E76;&#x53D1;&#x7684;&#x3001; &#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x4F7F;&#x6211;&#x4EEC;&#x80FD;&#x591F;&#x8C03;&#x67E5;&#x76F4;&#x63A5;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6BD2;&#x6D3B;&#x6027;&#x548C;&#x77ED;&#x671F;&#x5206;&#x6CCC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x76F8;&#x5173;&#x6027;&#x3002;&#x4F53;&#x5185;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x5F85;&#x53D1;&#x3001; &#x5FAA;&#x73AF;&#x7279;&#x5B9A;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684; CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#x662F;&#x514D;&#x75AB;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x5206;&#x6CCC;&#xFF0C;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#x5E72;&#x6270;&#x7D20; &gamma;&#xFF0C;&#x524D;&#x671F;&#x9047;&#x5230;&#x540C;&#x6E90;&#x6297;&#x539F;&#x63D0;&#x51FA;&#x4E86;&#x5173;&#x4E8E;&#x5B9A;&#x4E49;&#x6570;&#x5B57;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x65F6;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x505A;&#x6CD5;&#x5E94;&#x4FBF;&#x5229;&#x786E;&#x5B9A;&#x7B7E;&#x540D;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x5DEE;&#x5F02;&#x4E4B;&#x95F4;&#x4E2A;&#x522B;&#x6548;&#x5E94; CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC;&#x4ECE;&#x9ECF;&#x819C;&#x6837;&#x54C1;&#x4EE5;&#x53CA;&#x90A3;&#x4E9B;&#x75AB;&#x82D7;&#x6240;&#x81F4;&#x3002;

&#x4EBA;&#x7C7B; CD8&#x207A; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x51FA;&#x5206;&#x6CCC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x56E0;&#x5B50;&#x548C;&#x514D;&#x75AB;&#x7684;&#x98CE;&#x6CE2;&#x3002;

CD8+ T cells are a key component of the adaptive immune response to viral infection. An inadequate CD8+ T cell response is thought to be partly responsible for the persistent chronic infection that arises following infection with HIV. It is therefore critical to identify ways to define what constitutes an adequate or inadequate response. IFN-Î³ production has been used as a measure of T cell function, but the relationship between cytokine production and the ability of a cell to lyse virus-infected cells is not clear. Moreover, the ability to assess multiple CD8+ T cell functions with single-cell resolution using freshly isolated blood samples, and subsequently to recover these cells for further functional analyses, has not been achieved. As described here, to address this need, we have developed a high-throughput, automated assay in 125-pl microwells to simultaneously evaluate the ability of thousands of individual CD8+ T cells from HIV-infected patients to mediate lysis and to produce cytokines. This concurrent, direct analysis enabled us to investigate the correlation between immediate cytotoxic activity and short-term cytokine secretion. The majority of in vivo primed, circulating HIV-specific CD8+ T cells were discordant for cytolysis and cytokine secretion, notably IFN-Î³, when encountering cognate antigen presented on defined numbers of cells. Our approach should facilitate determination of signatures of functional variance among individual effector CD8+ T cells, including those from mucosal samples and those induced by vaccines.

A high-throughput single-cell analysis of human CD8âº T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.

Lymphocytes t CD8 + est un &eacute;l&eacute;ment cl&eacute; de la r&eacute;ponse immunitaire adaptative &agrave; l&#39;infection virale. Une r&eacute;ponse inad&eacute;quate des cellules T CD8 + est cens&eacute;e &ecirc;tre en partie responsable de l&#39;infection chronique persistante qui survient suite &agrave; une infection par le VIH. Il est donc essentiel de trouver les moyens de d&eacute;finir ce qui constitue une r&eacute;ponse ad&eacute;quate ou inad&eacute;quate. Production d&#39;IFN-&gamma; a &eacute;t&eacute; utilis&eacute;e comme une mesure de la fonction des cellules T, mais la relation entre la production de cytokines et la capacit&eacute; d&#39;une cellule &agrave; lyser les cellules infect&eacute;es par le virus n&#39;est pas claire. En outre, la capacit&eacute; d&#39;&eacute;valuer les multiples fonctions de lymphocytes T CD8 + avec une r&eacute;solution de cellule unique utilisant fra&icirc;chement isol&eacute;es des &eacute;chantillons de sang, et par la suite pour r&eacute;cup&eacute;rer ces cellules pour approfondir les analyses fonctionnelles, n&#39;a pas &eacute;t&eacute; atteint. Tel que d&eacute;crit ici, pour r&eacute;pondre &agrave; ce besoin, nous avons d&eacute;velopp&eacute; un haut d&eacute;bit, le test automatis&eacute; dans des micropuits de 125-pl &agrave; &eacute;valuer simultan&eacute;ment la capacit&eacute; des milliers de cellules T CD8 + individuelles provenant de patients infect&eacute;s par le VIH &agrave; la m&eacute;diation de lyse et &agrave; produire des cytokines. Cette analyse simultan&eacute;e, directe nous a permis d&#39;&eacute;tudier la corr&eacute;lation entre l&#39;activit&eacute; cytotoxique imm&eacute;diate et la s&eacute;cr&eacute;tion de cytokines &agrave; court terme. La majorit&eacute; in vivo appr&ecirc;t&eacute;, T CD8 + sp&eacute;cifiques du VIH en circulation les cellules &eacute;taient discordants pour la s&eacute;cr&eacute;tion d&#39;une cytolyse et cytokines, notamment IFN-&gamma;, lorsqu&#39;il rencontre l&#39;antig&egrave;ne apparent&eacute; pr&eacute;sent&eacute; sur un nombre d&eacute;fini de cellules. Notre approche devrait faciliter la d&eacute;termination des signatures de variance fonctionnelle des cellules T CD8 + effectrices individuels, y compris ceux provenant d&#39;&eacute;chantillons de muqueuses et ceux induits par les vaccins.

Une analyse d&#39;unicellulaire de haut d&eacute;bit des fonctions des cellules T de le CD8&#x207A; humaines r&eacute;v&egrave;le une discordance pour la s&eacute;cr&eacute;tion de cytokines et cytolyse.

CD8 + T-Zellen sind eine Schl&uuml;sselkomponente der adaptiven Immunantwort auf virale Infektion. CD8 + T Zelle Antwort: eine ist vermutlich mitverantwortlich f&uuml;r die anhaltende chronische Infektionen, die nach Infektion mit HIV entsteht. Es ist daher wichtig, Wege zu definieren, was eine angemessene oder unangemessene Reaktion darstellt. IFN-&gamma; Produktion wird als Ma&szlig; f&uuml;r die T-Zell-Funktion, aber es ist nicht klar, die Beziehung zwischen Cytokine Produktion und die F&auml;higkeit einer Zelle Virus-infizierten Zellen aufzul&ouml;sen. Dar&uuml;ber hinaus die M&ouml;glichkeit, mehrere CD8 + T-Zell-Funktionen mit einzelligen Aufl&ouml;sung mit frisch bewerten isoliert Blutproben und sp&auml;ter zum Wiederherstellen dieser Zellen f&uuml;r weitere Funktionsanalysen, wurde nicht erreicht. Wie hier beschrieben, um dieses Bed&uuml;rfnis zu beheben entwickelten wir eine Hochdurchsatz, automatisierten Bluttest in 125-pl Vertiefungen, die F&auml;higkeit von Tausenden von einzelnen CD8 + T-Zellen von HIV-infizierten Patienten, Lyse zu vermitteln und Zytokine produzieren gleichzeitig zu bewerten. Diese gleichzeitige, direkte Analyse konnten wir die Korrelation zwischen unmittelbaren zytotoxischen Aktivit&auml;t und kurzfristige Zytokin-Sekretion zu untersuchen. Die Mehrheit der in-vivo grundiert, zirkulierenden HIV-spezifische CD8 + T Zellen waren f&uuml;r Zytolyse und Zytokin-Sekretion, insbesondere IFN-&gamma;, unzutreffende beim cognate Antigen pr&auml;sentiert auf definierte Anzahl von Zellen zu erkennen. Unser Ansatz sollte die Bestimmung der Unterschriften der funktionelle Varianz zwischen den einzelnen Effektor CD8 + T Zellen, einschlie&szlig;lich die von Schleimhaut-Proben und induziert durch Impfstoffe erleichtern.

Eine Hochdurchsatz einzellige Analyse der menschlichen CD8&#x207A; T Zelle Funktionen offenbart Diskordanz Zytokin-Sekretion und Zytolyse.

Cellule T CD8 + sono una componente chiave della risposta immunitaria adattativa all&#39;infezione virale. Una risposta inadeguata di cellule T CD8 + &egrave; pensata per essere in parte responsabile dell&#39;infezione cronica persistente che insorge a seguito di infezione da HIV. Pertanto &egrave; fondamentale per individuare i modi per definire ci&ograve; che costituisce una risposta adeguata o inadeguata. Produzione di IFN-&gamma; &egrave; stato usato come una misura della funzione delle cellule T, ma non &egrave; chiaro il rapporto tra produzione di citochine e la capacit&agrave; di una cellula di lisare cellule infettate da virus. Inoltre, la capacit&agrave; di valutare le molteplici funzioni di cellule T CD8 + con cella singola risoluzione utilizzando appena isolato i campioni di sangue, e successivamente per recuperare queste cellule per ulteriori analisi funzionale, non &egrave; stata raggiunta. Come descritto qui, per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un alto-rendimento, dosaggio automatizzato in micropozzetti 125-pl contemporaneamente valutare la capacit&agrave; di migliaia di singole cellule T CD8 + da pazienti HIV-positivi a mediare Lisi e a produrre citochine. Questa analisi simultanea, diretta ci ha permesso di indagare la correlazione tra attivit&agrave; citotossica immediato e la secrezione di citochine a breve termine. La maggior parte di in vivo innescato, circolanti HIV specifici CD8 + T cellule erano discordanti per la secrezione di citolisi e citochine, in particolare IFN-&gamma;, quando incontrano l&#39;antigene cognata presentato su un numero definito di cellule. Il nostro approccio dovrebbe facilitare la determinazione delle firme di varianza funzionale tra singoli effettrici CD8 + T cellule, comprese quelle da campioni della mucosa e quelle indotte dai vaccini.

Un&#39;analisi di cella singola high-throughput di umane funzioni delle cellule T CD8&#x207A; rivela discordanza per la secrezione di citochine e citolisi.

Cd 8 + T &#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x611F;&#x67D3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x9069;&#x5FDC;&#x514D;&#x75AB;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4E0D;&#x5341;&#x5206;&#x306A; cd8 &#x967D;&#x6027; T &#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306F;&#x3001;&#x6B21;&#x306E;&#x611F;&#x67D3; hiv &#x611F;&#x67D3;&#x8005;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3001;&#x6C38;&#x7D9A;&#x7684;&#x306A;&#x6162;&#x6027;&#x7684;&#x306A;&#x611F;&#x67D3;&#x75C7;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306B;&#x8CAC;&#x4EFB;&#x3092;&#x8CA0;&#x3046;&#x3068;&#x8003;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4E0D;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x69CB;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3092;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x7279;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;IFN &gamma; &#x7523;&#x751F; T &#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x6307;&#x6A19;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; &#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x7523;&#x751F;&#x3068;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306B;&#x611F;&#x67D3;&#x3057;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x6EB6;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306F;&#x660E;&#x78BA;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x3044;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x8840;&#x6DB2;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E; cd 8 + T &#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x65B0;&#x9BAE;&#x306A;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5358;&#x4E00;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9054;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x305F;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30CB;&#x30FC;&#x30BA;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x6211;&#x3005; &#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x305F;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x3001;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x63DB;&#x6563;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x7523;&#x751F;&#x3092;&#x500B;&#x3005; &#x306E; cd 8 + T &#x7D30;&#x80DE; HIV &#x611F;&#x67D3;&#x60A3;&#x8005;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x4F55;&#x5343;&#x3082;&#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B; 125 pl &#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x306E;&#x4F5C;&#x6210;&#x306E;&#x81EA;&#x52D5;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x3001;&#x76F4;&#x63A5;&#x5206;&#x6790;&#x5373;&#x6642;&#x7D30;&#x80DE;&#x50B7;&#x5BB3;&#x6D3B;&#x6027;&#x3068;&#x77ED;&#x671F;&#x7684;&#x306A;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;In vivo &#x3067;&#x306E;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x3092;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DF;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;HIV &#x7279;&#x7570;&#x7684; cd 8 + T &#x3092;&#x5FAA;&#x74B0;&#x30BB;&#x30EB;&#x540C;&#x7A2E;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x6E08;&#x307F;&#x306E;&#x591A;&#x6570;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x7D30;&#x80DE;&#x5D29;&#x58CA;&#x3068;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;, IFN-&gamma; &#x7279;&#x306B;&#x8033;&#x969C;&#x308A;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x7C98;&#x819C;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30EF;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x3067;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x30A8;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC; cd8 &#x967D;&#x6027; T &#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x5206;&#x6563;&#x306E;&#x7F72;&#x540D;&#x306E;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x304C;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x89E3;&#x6790;&#x4EBA;&#x9593; CD8&#x207A; T &#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x5D29;&#x58CA;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

CD8 + T &#xC138;&#xD3EC;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xAC10;&#xC5FC;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xBA74;&#xC5ED; &#xBC18;&#xC751;&#xC758; &#xD575;&#xC2EC; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBD88; &#xCDA9; &#xBD84; &#xD55C; CD8 + T &#xC138;&#xD3EC; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; hiv &#xAC10;&#xC5FC;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xC601;&#xAD6C; &#xB9CC;&#xC131; &#xAC10;&#xC5FC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784;&#xC744; &#xC9C8; &#xC0DD;&#xAC01;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xBBC0;&#xB85C; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xB610;&#xB294; &#xBD80;&#xC801; &#xC808; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xAD6C;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xBB34;&#xC2A8;&#xC744; &#xC815;&#xC758; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC911;&#xC694; &#xD558;&#xB2E4;. IFN-&gamma; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC740; T &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5; &#xCE21;&#xC815;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; cytokine &#xC0DD;&#xC0B0; &#xBC0F; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; lyse &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC758; &#xAD00;&#xACC4;&#xB294; &#xBA85;&#xD655; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xAC13;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC5EC;&#xB7EC; CD8 + T &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC808;&#xC5F0; &#xD608;&#xC561; &#xC0D8;&#xD50C;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC774;&#xD6C4;&#xC5D0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC140; &#xCD94;&#xAC00; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xD558;&#xC9C0; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC124;&#xBA85;&#xD55C; &#xB300;&#xB85C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC694;&#xAD6C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;, &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC911;&#xC7AC; lysis &#xACE0; cytokines&#xC744; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xC218;&#xCC9C; &#xBA85;&#xC758; HIV &#xAC10;&#xC5FC; &#xD658;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC1C;&#xBCC4; CD8 + T &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; 125-pl microwells&#xC5D0; &#xC790;&#xB3D9;&#xB41C; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;. &#xC774; &#xB3D9;&#xC2DC;, &#xC9C1;&#xC811; &#xBD84;&#xC11D; &#xC989;&#xAC01;&#xC801;&#xC778; cytotoxic &#xD65C;&#xB3D9;&#xACFC; &#xB2E8;&#xAE30; cytokine &#xBD84; &#xBE44; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC0C1;&#xAD00; &#xAD00;&#xACC4;&#xB97C; &#xC870;&#xC0AC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xAC8C;. Vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84; &#xC561;, &#xC21C;&#xD658; HIV &#xAD00;&#xB828; CD8 + T &#xC138;&#xD3EC; cytolysis &#xBC0F; cytokine &#xBD84; &#xBE44;, &#xD2B9;&#xD788; IFN-&gamma;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xADC0;&#xC5D0; &#xAC70;&#xC2AC;&#xB9AC;&#xB294; &#xB3D9;&#xC871; &#xD56D; &#xC6D0; &#xC140;&#xC758; &#xC815;&#xC758; &#xB41C; &#xC22B;&#xC790;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xBC95; &#xACB0;&#xC815; &#xB4F1; &#xC810; &#xB9C9; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8; &#xBC31;&#xC2E0;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC720;&#xB3C4; &#xB41C; &#xAC1C;&#xBCC4; effector CD8 + T &#xC138;&#xD3EC; &#xAC04;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xCC28;&#xC774;&#xC758; &#xC11C;&#xBA85;&#xC758; &#xC6A9;&#xC774; &#xD574;&#xC57C;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; CD8&#x207A; T &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC2A4;&#xB8E8;&#xD48B; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D; cytolysis&#xC5D0; &#xB300; &#xC77C; &#xBD84; &#xBE44; &#xBD80;&#xC870;&#xD654;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

De c&eacute;lulas T CD8 + son un componente clave de la respuesta inmune adaptativa a la infecci&oacute;n viral. Una respuesta inadecuada de c&eacute;lulas T CD8 + se cree que en parte responsable de la infecci&oacute;n cr&oacute;nica persistente que surge tras la infecci&oacute;n con el VIH. Por lo tanto es fundamental para identificar formas de definir lo que constituye una respuesta adecuada o inadecuada. Producci&oacute;n de IFN-&gamma; se ha utilizado como una medida de la funci&oacute;n de la c&eacute;lula T, pero no est&aacute; clara la relaci&oacute;n entre la producci&oacute;n de citoquinas y la capacidad de una c&eacute;lula de lisar c&eacute;lulas infectadas por virus. Por otra parte, la capacidad de evaluar m&uacute;ltiples funciones de c&eacute;lulas T CD8 + con resoluci&oacute;n unicelular uso reci&eacute;n aislado de muestras de sangre, y posteriormente recuperar estas c&eacute;lulas para mayores an&aacute;lisis funcionales, no ha conseguido. Como se describe aqu&iacute;, para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado un alto rendimiento, an&aacute;lisis automatizado en 125-pl micropocillos simult&aacute;neamente, evaluar la capacidad de miles de c&eacute;lulas T CD8 + de pacientes infectados por el VIH para mediar la lisis y producen citoquinas. Este an&aacute;lisis concurrente, directa permitieron investigar la correlaci&oacute;n entre la actividad citot&oacute;xica inmediata y secreci&oacute;n de citoquinas a corto plazo. La mayor&iacute;a de in vivo preparado, relacionadas con el VIH T CD8 + de circulaci&oacute;n c&eacute;lulas estaban discordes para secreci&oacute;n cit&oacute;lisis y citocinas, en particular el IFN-&gamma;, al encontrar cognado ant&iacute;geno presentado en un n&uacute;mero definido de c&eacute;lulas. Nuestro enfoque debe facilitar la determinaci&oacute;n de las firmas de varianza funcional entre las c&eacute;lulas T CD8 + efectoras individuales, incluyendo las de muestras de mucosas y las inducidas por vacunas.

Un an&aacute;lisis de alto rendimiento unicelular de funciones de la c&eacute;lula de T de CD8&#x207A; humanas revela discordancia para la secreci&oacute;n de citoquinas y cit&oacute;lisis.

&#x67D0;&#x4E9B;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6837;&#x672C;&#x6D41;&#x4F53;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5207;&#x7247;&#xFF09; &#x6216;&#x5B66;&#x79D1;&#x672C;&#x8EAB;&#x65B0;&#x751F;&#x513F;&#x513F;&#x79D1;&#x5B66;&#x79D1;&#xFF09; &#x7684;&#x6027;&#x8D28;&#x5F80;&#x5F80;&#x9650;&#x5236;&#x53EF;&#x7528;&#x6765;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x529F;&#x80FD;&#x7684; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x611F;&#x67D3;&#x6216;&#x5E72;&#x9884;&#x6CBB;&#x7597;&#x5E72;&#x9884;&#x7684;&#x5E7F;&#x5EA6;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x6570;&#x76EE;&#x3002;&#x6700;&#x5E38;&#x7528;&#x6765;&#x8BC4;&#x4F30;&#x6B64;&#x529F;&#x80FD;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x6269;&#x589E;&#x548C;&#x6062;&#x590D;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x6269;&#x5927;&#x4F53;&#x5916;&#x901A;&#x5E38;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x9700;&#x8981;&#x66F4;&#x5927;&#x4E8E; 10(6) &#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x8BC6;&#x522B;&#x6297;&#x539F;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x53CD;&#x5E94;&#x6709;&#x6548;&#x6269;&#x589E;&#x4ECE; 10(4)-10(5) &#x5355;&#x4E2A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4ECE;&#x8840;&#x6DB2;&#x6216;&#x4F7F;&#x7528; subnanoliter &#x4E95;&#x7684;&#x7A20;&#x5BC6;&#x6570;&#x7EC4;&#x7684;&#x9ECF;&#x819C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x7247;&#x4E0A;&#x6210;&#x50CF;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x7ED3;&#x5408;&#x6280;&#x672F;&#x7528;&#x4E8E;&#x6355;&#x83B7;&#x5206;&#x6CCC;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;--&#x8C03;&#x7528;&#x65B9;&#x6CD5;&quot;microengraving&quot;&mdash; &mdash; &#x4EE5;&#x679A;&#x4E3E; ELISpot &#x548C;&#x80DE;&#x5185;&#x7EC6;&#x80DE;&#x56E0;&#x5B50;&#x67D3;&#x8272;&#x7B49;&#x5E38;&#x89C4;&#x5316;&#x9A8C;&#x76F8;&#x5AB2;&#x7F8E;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x4E0E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5316;&#x9A8C;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x540C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x786E;&#x5B9A;&#x5404;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x968F;&#x65F6;&#x901A;&#x8FC7;&#x6062;&#x590D;&#x4F5C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x9274;&#x5B9A;&#x4F53;&#x5916;&#x5FAE;&#x64CD;&#x4F5C;&#x3002;&#x5E94;&#x7528;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x8BC4;&#x4F30;&#x7279;&#x5B9A;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x53CD;&#x5E94;&#x8868;&#x660E;&#x5B83;&#x662F;&#x53EF;&#x80FD;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x65E0;&#x6027;&#x7CFB; CD8(+) T &#x7EC6;&#x80DE;&#x884C;&#x8868;&#x793A;&#x76EE;&#x524D;&#x4F7F;&#x7528; 100 1,000 &#x500D;&#x5C11;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6BD4;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x9700;&#x8981;&#x5E76;&#x6CA1;&#x6709;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x5206;&#x6790;&#x5148;&#x9A8C;&#x7684;&#x6D41;&#x901A;&#x4E2D;&#x6700;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x5177;&#x4F53;&#x60C5;&#x51B5;&#x3002;&#x6B64;&#x5FEB;&#x901F; &#xFF08;&lt; 24 h)&#x3001; &#x9AD8;&#x6548;&#x5EC9;&#x4EF7;&#x7684;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x5E94;&#x8DE8;&#x5E74;&#x9F84;&#x548C;&#x89E3;&#x5256;&#x5B66;&#x8F66;&#x53A2;&#x6539;&#x8FDB;&#x4EBA;&#x7C7B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x514D;&#x75AB;&#x7684;&#x6BD4;&#x8F83;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;

&#x5FEB;&#x901F;&#x3001; &#x9AD8;&#x6548;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x9274;&#x5B9A;&#x548C;&#x4F7F;&#x7528; microengraving &#x7684;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7279;&#x5B9A;&#x4EBA; CD8 + T &#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x6062;&#x590D;&#x3002;

The nature of certain clinical samples (tissue biopsies, fluids) or the subjects themselves (pediatric subjects, neonates) often constrain the number of cells available to evaluate the breadth of functional T-cell responses to infections or therapeutic interventions. The methods most commonly used to assess this functional diversity ex vivo and to recover specific cells to expand in vitro usually require more than 10(6) cells. Here we present a process to identify antigen-specific responses efficiently ex vivo from 10(4)-10(5) single cells from blood or mucosal tissues using dense arrays of subnanoliter wells. The approach combines on-chip imaging cytometry with a technique for capturing secreted proteins--called "microengraving"--to enumerate antigen-specific responses by single T cells in a manner comparable to conventional assays such as ELISpot and intracellular cytokine staining. Unlike those assays, however, the individual cells identified can be recovered readily by micromanipulation for further characterization in vitro. Applying this method to assess HIV-specific T-cell responses demonstrates that it is possible to establish clonal CD8(+) T-cell lines that represent the most abundant specificities present in circulation using 100- to 1,000-fold fewer cells than traditional approaches require and without extensive genotypic analysis a priori. This rapid (<24 h), efficient, and inexpensive process should improve the comparative study of human T-cell immunology across ages and anatomic compartments.

Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.

La nature de certains &eacute;chantillons cliniques (biopsies tissulaires, liquides) ou les sujets eux-m&ecirc;mes (sujets p&eacute;diatriques, nouveaux-n&eacute;s) souvent de limiter le nombre de cellules disponibles pour &eacute;valuer l&#39;ampleur des r&eacute;ponses fonctionnelles de T-cellule d&#39;infections ou d&#39;interventions th&eacute;rapeutiques. Les m&eacute;thodes couramment utilis&eacute;es pour &eacute;valuer cette diversit&eacute; fonctionnelle ex vivo et de r&eacute;cup&eacute;rer des cellules sp&eacute;cifiques pour d&eacute;velopper in vitro g&eacute;n&eacute;ralement n&eacute;cessitent plus que 10 6 cellules. Nous pr&eacute;sentons un processus visant &agrave; d&eacute;terminer les r&eacute;ponses sp&eacute;cifiques &agrave; l&#39;antig&egrave;ne efficacement ex vivo de cellules uniques 10(4)-10(5) du sang ou des tissus muqueuses &agrave; l&#39;aide de matrices denses de puits subnanoliter. L&#39;approche combine sur puce cytometry d&#39;imagerie avec une technique pour capturer des prot&eacute;ines s&eacute;cr&eacute;t&eacute;es--appel&eacute;s &laquo; microengraving &raquo;--pour &eacute;num&eacute;rer les r&eacute;ponses sp&eacute;cifiques de l&#39;antig&egrave;ne par les cellules T unique d&#39;une mani&egrave;re comparable &agrave; des tests classiques comme ELISpot et coloration des cytokines intracellulaires. Contrairement &agrave; ces essais, cependant, les cellules individuelles identifi&eacute;s peuvent &ecirc;tre r&eacute;cup&eacute;r&eacute;s facilement par micromanipulation pour davantage de caract&eacute;risation in vitro. En appliquant cette m&eacute;thode pour &eacute;valuer les r&eacute;ponses des cellules T sp&eacute;cifiques au VIH montre qu&#39;il est possible de cr&eacute;er des lign&eacute;es de cellules T CD8 clonales qui repr&eacute;sentent les sp&eacute;cificit&eacute;s plus abondantes pr&eacute;sentes dans la pratique, selon 100 &agrave; 1,000 fois moins de cellules que d&#39;exigent des approches traditionnelles et sans une vaste analyse g&eacute;notypique a priori. Ce rapide (&lt; 24h), efficace et peu co&ucirc;teuse devrait grandement am&eacute;liorer l&#39;&eacute;tude comparative de l&#39;immunologie de lymphocytes humain &agrave; travers les &acirc;ges et les compartiments anatomiques.

Caract&eacute;risation fonctionnelle rapide, efficace et r&eacute;cup&eacute;ration des cellules T CD8 + humaines de sp&eacute;cifiques au VIH &agrave; l&#39;aide de microengraving.

La naturaleza de ciertas muestras cl&iacute;nicas (biopsias, l&iacute;quidos) o los temas (temas pedi&aacute;tricos, los reci&eacute;n nacidos) a menudo limitan el n&uacute;mero de c&eacute;lulas disponibles para evaluar la amplitud de las respuestas de c&eacute;lulas T funcionales a las infecciones o las intervenciones terap&eacute;uticas. Los m&eacute;todos m&aacute;s utilizados para evaluar esta diversidad funcional ex vivo y recuperar c&eacute;lulas espec&iacute;ficas para ampliar in vitro generalmente requieren m&aacute;s de 10 (6) las c&eacute;lulas. Aqu&iacute; presentamos un proceso para identificar respuestas ant&iacute;geno-espec&iacute;fica eficientemente ex vivo de c&eacute;lulas de la sangre o tejidos mucosas usando matrices densas de pozos de subnanoliter 10(4)-10(5). El enfoque combina la en-viruta citometr&iacute;a de imagen con una t&eacute;cnica para la captura de prote&iacute;nas secretadas, llamadas &quot;microengraving&quot;--a enumerar ant&iacute;geno-espec&iacute;fica las respuestas de las c&eacute;lulas T de manera comparable a los ensayos convencionales como ELISpot y tinci&oacute;n de citocinas intracelulares. A diferencia de los ensayos, sin embargo, las c&eacute;lulas individuales identificadas pueden recuperarse f&aacute;cilmente por micromanipulaci&oacute;n m&aacute;s caracterizaci&oacute;n in vitro. Aplicar este m&eacute;todo para evaluar las respuestas relacionadas con el VIH t-c&eacute;lula demuestra que es posible establecer l&iacute;neas clonales de c&eacute;lulas T CD8 que representan las especificidades m&aacute;s abundantes presentes en circulaci&oacute;n usando 100 a 1.000 veces menos c&eacute;lulas que requieren de enfoques tradicionales y sin extensos an&aacute;lisis genot&iacute;pico a priori. Este r&aacute;pido (&lt; 24 h), eficiente y de bajo costo proceso debe mejorar el estudio comparativo de la inmunolog&iacute;a de c&eacute;lulas T humana a trav&eacute;s de las edades y compartimentos anat&oacute;micos.

Caracterizaci&oacute;n funcional r&aacute;pido, eficiente y recuperaci&oacute;n de c&eacute;lulas T CD8 + humanas relacionadas con el VIH, utilizando microengraving.

Die Natur der bestimmten klinischen Proben (Gewebe-Biopsien, Fl&uuml;ssigkeiten) oder die Subjekte selbst (p&auml;diatrische Themen, Neonaten) oft beschr&auml;nken die Anzahl von Zellen f&uuml;r die Breite der funktionellen T-Zell-Antworten zu Infektionen oder therapeutische Interventionen zu evaluieren. Am h&auml;ufigsten verwendeten, um diese Funktionsvielfalt ex Vivo zu beurteilen und bestimmte Zellen in der Regel in-vitro erweitern wiederherzustellen Methoden erfordern mehr als 10 6 Zellen. Hier pr&auml;sentieren wir einen Prozess zur Identifizierung von Antigen-spezifische Antworten effizient ex Vivo von 10(4)-10(5) einzelne Zellen aus Blut oder Schleimhaut-Gewebe mit dichtem Arrays von Subnanoliter Brunnen. Der Ansatz kombiniert auf dem Chip Bildbearbeitung Cytometry mit einer Technik zur Erfassung von sekretierten Proteine (Eiwei&szlig;) namens &quot;Mikrogravuren&quot;--Antigen-spezifische Antworten durch einzelne T-Zellen in gewissem Sinne vergleichbar mit konventionellen Assays wie ELISpot und intrazellul&auml;re Cytokine Beflecken aufgelistet werden. Im Gegensatz zu diesen Proben k&ouml;nnen die einzelnen Zellen identifiziert jedoch leicht durch Mikromanipulation zur weiteren Charakterisierung von in-vitro wiederhergestellt werden. Wenn Sie diese Methode zur Bewertung von HIV-spezifische T-Zell-Antworten zeigt, dass es m&ouml;glich ist, die klonale CD8(+) T-Zell-Linien zu schaffen, die die am h&auml;ufigsten vorkommenden Besonderheiten im Verkehr mit 100 und 1,000 8-fach weniger Zellen als traditionelle Ans&auml;tze erfordern und ohne umfangreiche genotypische Analyse apriorische darstellen. Diese schnelle (&lt; 24 h), effizienten und kosteng&uuml;nstigen Prozess d&uuml;rfte die vergleichende Studie der menschlichen T-Zell-Immunologie &uuml;ber anatomische F&auml;cher und Altersstufen.

Schnelle und effiziente Funktionelle Charakterisierung und Wiederherstellung von HIV-spezifische menschliche CD8 + T-Zellen mit Mikrogravuren.

La natura di certi campioni clinici (biopsie di tessuti, fluidi) o i soggetti stessi (soggetti pediatrici, neonati) spesso vincola il numero di cellule disponibili per valutare l&#39;ampiezza delle risposte delle cellule T funzionale a infezioni o interventi terapeutici. I metodi pi&ugrave; comunemente utilizzati per valutare questa diversit&agrave; funzionale ex vivo e recuperare cellule specifiche di espandere in vitro di solito richiedono pi&ugrave; di 10 celle. Presentiamo qui un processo per identificare le risposte antigene-specifiche efficientemente ex vivo da 10(4)-10(5) le singole cellule da sangue o tessuti della mucosa con folte schiere di subnanoliter wells. L&#39;approccio combina cytometry imaging on-chip con una tecnica per catturare le proteine secrete - chiamate &quot;microengraving&quot; - per enumerare le risposte antigene-specifiche di singole cellule T in modo paragonabile ai dosaggi convenzionali quali ELISpot e colorazione delle citochine intracellulari. A differenza di quei saggi, tuttavia, le singole celle identificate possono essere recuperate facilmente da micromanipolazione per ulteriore caratterizzazione in vitro. Applicando questo metodo per valutare le risposte di cellule T specifiche per l&#39;HIV dimostra che &egrave; possibile stabilire linee di cellule T-cellule clonali che rappresentano la specificit&agrave; pi&ugrave; abbondanti presenti in circolazione utilizzando 100 - a 1,000 volte poche cellule che richiedono approcci tradizionali e senza analisi genotipica estesa a priori. Questo rapido (&lt; 24 h), efficiente e poco costoso processo dovrebbe migliorare lo studio comparato di immunologia delle cellule T umana attraverso compartimenti anatomici e le epoche.

Caratterizzazione funzionale rapido, efficiente e recupero delle cellule CD8 + T umane HIV specifici utilizzando microengraving.

&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x81E8;&#x5E8A;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB; (&#x751F;&#x691C; &#xFF08;&#x7D44;&#x7E54;&#x3001;&#x6D41;&#x4F53;) &#x3084;, &#x88AB;&#x9A13;&#x8005;&#x81EA;&#x8EAB;&#x65B0;&#x751F;&#x5150;&#x30FB;&#x5C0F;&#x5150;&#x5598;&#x606F;&#x306E;&#x6027;&#x8CEA;&#x306F;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684; T &#x7D30;&#x80DE;&#x53CD;&#x5FDC;&#x611F;&#x67D3;&#x75C7;&#x3092;&#x6CBB;&#x7642;&#x4E0A;&#x306E;&#x4ECB;&#x5728;&#x306E;&#x5E45;&#x5E83;&#x3055;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x6570;&#x304C;&#x5236;&#x9650;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x3082;&#x3088;&#x304F;&#x3053;&#x306E;&#x524D;&#x306E;&#x30F4;&#x30A3;&#x30F4;&#x30A9;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x901A;&#x5E38; in vitro &#x3067;&#x5C55;&#x958B;&#x3059;&#x308B;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F; 10 (6) &#x30BB;&#x30EB;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F; 10(4)-10(5) &#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x304B;&#x3089;&#x8840;&#x6DB2;&#x3084;&#x7C98;&#x819C;&#x7D44;&#x7E54; subnanoliter &#x4E95;&#x6238;&#x306E;&#x5BC6;&#x306A;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B; ex vivo &#x6297;&#x539F;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x5206;&#x6CCC;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x6280;&#x8853;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x306B;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x305F;&quot;microengraving&quot;- &#x3092;&#x8FFD;&#x52A0;&#x3057;&#x306A;&#x3055;&#x3044;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30AB;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x6C5A;&#x640D;&#x306A;&#x3069;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x8A66;&#x91D1;&#x306B;&#x5339;&#x6575;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E; 1 &#x3064;&#x306E; T &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x6297;&#x539F;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x5217;&#x6319;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8A66;&#x91D1;&#x3068;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x308A;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x7279;&#x6027;&#x306E; in vitro &#x3067;&#x306E;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30CB;&#x30D4;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x30EA;&#x30AB;&#x30D0;&#x30EA;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;HIV &#x7279;&#x7570;&#x7684; T &#x7D30;&#x80DE;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x9069;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x4F1D;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x3001;&#x5E83;&#x7BC4;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x89E3;&#x6790;&#x305B;&#x305A;&#x4E8B;&#x524D;&#x3067; 100 &#xFF5E; 1,000 &#x500D;&#x3088;&#x308A;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x30BB;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5FAA;&#x74B0;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x306E;&#x6700;&#x3082;&#x8C4A;&#x5BCC;&#x306A;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x3060;&#x308D;&#x3046;&#x3053;&#x306E; T &#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7CFB;&#x7D71;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x6025;&#x901F;&#x306A; (&lt; 24 h&#xFF09;&#x3001;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3001;&#x304B;&#x3064;&#x5B89;&#x4FA1;&#x306A;&#x5E74;&#x9F62;&#x3068;&#x89E3;&#x5256;&#x5B66;&#x7684;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x9593;&#x3067;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306F;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; T &#x7D30;&#x80DE;&#x514D;&#x75AB;&#x5B66;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7814;&#x7A76;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x8FC5;&#x901F;&#x3067;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x3068; microengraving &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066; HIV &#x7279;&#x5B9A; cd 8 + T &#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3002;

&#xD2B9;&#xC815; &#xC784;&#xC0C1; &#xC0D8;&#xD50C; (&#xC0DD; &#xAC80; &#xC870;&#xC9C1;, &#xCCB4;&#xC561;) &#xB610;&#xB294; &#xACFC;&#xBAA9; (&#xACFC;&#xBAA9; &#xC18C;&#xC544;, &#xC2E0;&#xC0DD;&#xC544;) &#xC790;&#xCCB4;&#xC758; &#xC131;&#xACA9; &#xC885;&#xC885; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC131; T-&#xC140; &#xC751;&#xB2F5; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB610;&#xB294; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC801; &#xAC1C;&#xC785;&#xC758; &#xD3ED;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC140;&#xC758; &#xC218;&#xB97C; &#xC81C;&#xD55C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; ex vivo &#xAE30;&#xB2A5; &#xB2E4;&#xC591;&#xC131;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD655;&#xC7A5;&#xC744; &#xD2B9;&#xC815; &#xC140;&#xC744; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95; &#xC2DC;&#xBBFC;&#xAD8C;&#xC774; &#xC140; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD604;&#xC7AC; &#xD608;&#xC561; &#xB610;&#xB294; subnanoliter &#xC6F0; &#xC2A4;&#xC758; &#xACE0;&#xBC00;&#xB3C4; &#xC5B4;&#xB808;&#xC774; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC810; &#xB9C9; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; 10(4)-10(5) &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBE44;&#xBCF4; &#xC804; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD2B9;&#xC815; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;. &#xC811;&#xADFC; &#xBE44; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;-&#xB77C;&#xB294; &#xCEA1;&#xCC98; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xCE69;&#xC5D0; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; cytometry &#xACB0;&#xD569; &#xD55C; &quot;microengraving&quot;-&#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; ELISpot &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; cytokine &#xC5BC;&#xB8E9; &#xAC19;&#xC740; &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB2E8;&#xC77C; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD2B9;&#xC815; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xC5F4;&#xAC70; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xADF8; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xACFC; &#xB2EC;&#xB9AC;, &#xC2DD;&#xBCC4; &#xB41C; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC140;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC27D;&#xAC8C; &#xCD94;&#xAC00; &#xCCB4; &#xC678; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; micromanipulation. &#xC5D0;&#xC774;&#xC988; &#xAD00;&#xB828; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC801;&#xC6A9; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC694;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; genotypic &#xBD84;&#xC11D; &#xC5C6;&#xC774; &#xC120;&#xD5D8;&#xC801; 100-&#xD558; 1,000 &#xBC30; &#xC801;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xC774;&#xC6A9;&#xD55C; &#xD608;&#xC561; &#xC21C;&#xD658;&#xC5D0; &#xAC00;&#xC7A5; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xD074;&#xB860; CD8(+) T-&#xC140; &#xB77C;&#xC778;&#xC744; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE09;&#xC99D; (&lt; 24 h) &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xC800;&#xB834; &#xACFC;&#xC815; &#xD574;&#xBD80;&#xD559; &#xAD6C;&#xD68D;&#xACFC; &#xC5F0;&#xB839;&#xB300;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC; &#xBA74;&#xC5ED;&#xD559;&#xC758; &#xBE44;&#xAD50; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xAC1C;&#xC120; &#xD55C;&#xB2E4;.

&#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xACE0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xAE30;&#xB2A5; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xBC0F; microengraving&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC5D0;&#xC774;&#xC988; &#xAD00;&#xB828; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; CD8 + T &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xBCF5;&#xAD6C;.

&#x91CD;&#x7EC4;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x4F4E;&#x6536;&#x76CA;&#x7387;&#x4EE3;&#x8868;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7269;&#x7406;&#x7279;&#x6027;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x969C;&#x788D;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86;&#x5168;&#x7403;&#x8303;&#x56F4;&#x5185;&#x63D0;&#x9AD8;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x6B63;&#x786E;&#x6298;&#x53E0; G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#x4F53; (GPCRs) &#x5728;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x4E2D;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;&#x56FE;&#x4E66;&#x9986;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x7247;&#x6BB5;&#x88AB;&#x7504;&#x522B;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E24;&#x4E2A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x76D1;&#x6D4B;&#xFF1A; (i) &#x9AD8;&#x67B6;&#x8367;&#x5149;&#x6240;&#x8D4B;&#x4E88;&#x7684;&#x589E;&#x5F3A;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x6C14;&#x76F8;&#x5316;&#x5B66;&#x8FD8;&#x539F; GFP &#x878D;&#x5408;&#x548C; (&#x4E8C;) &#x589E;&#x52A0;&#x4EA7;&#x751F;&#x66F4;&#x79EF;&#x6781;&#x7684;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x914D;&#x4F53;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x4E09;&#x590D;&#x5F0F;&#x547D;&#x4E2D;&#x4E86;&#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF1A; nagD&#xFF0C;&#x7F16;&#x7801;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; NagD &#xFF1B;nlpD&#xFF0C;&#x7F16;&#x7801;&#x4E2D;&#x622A;&#x65AD;&#x9884;&#x6D4B;&#x8102;&#x86CB;&#x767D; NlpD&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4E09;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7C07;&#x4E2D;-yhbJ-npr&#xFF0C;&#x7F16;&#x7801;&#x4E09;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x6C2E;&#x78F7;&#x9178;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7247;&#x6BB5;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x4F7F;&#x4E0D;&#x540C;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269; GPCRs &#x7684;&#x6536;&#x76CA;&#x7387;&#x5728; 3 &#x5230; 10 &#x500D;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x662F; periplasm &#x7684;&#x7B26;&#x5408;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x5047;&#x8BBE;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x53EF;&#x7EF4;&#x6301;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7684;&#x5B8C;&#x6574;&#x6027;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x6709;&#x5229;&#x7684;&#x73AF;&#x5883;&#xFF0C;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6298;&#x53E0;&#xFF0C;&#x53EF;&#x80FD;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x5FAE;&#x8C03;&#x7684;&#x5E94;&#x6FC0;&#x53CD;&#x5E94;&#x548C;/&#x6216;&#x7ECF;&#x4FEE;&#x6539;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x5C01;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;

&#x590D;&#x5F0F;&#x63D0;&#x9AD8;&#x4EA7;&#x91CF;&#x7684;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269; G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#x53D7;&#x4F53;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;

Low yields of recombinant expression represent a major barrier to the physical characterization of membrane proteins. Here, we have identified genes that globally enhance the production of properly folded G protein-coupled receptors (GPCRs) in Escherichia coli. Libraries of bacterial chromosomal fragments were screened using two separate systems that monitor: (i) elevated fluorescence conferred by enhanced expression of GPCR-GFP fusions and (ii) increased binding of fluorescent ligand in cells producing more active receptor. Three multi-copy hits were isolated by both methods: nagD, encoding the ribonucleotide phosphatase NagD; a fragment of nlpD, encoding a truncation of the predicted lipoprotein NlpD, and the three-gene cluster ptsN-yhbJ-npr, encoding three proteins of the nitrogen phosphotransferase system. Expression of these genes resulted in a 3- to 10-fold increase in the yields of different mammalian GPCRs. Our data is consistent with the hypothesis that the expression of these genes may serve to maintain the integrity of the bacterial periplasm and to provide a favorable environment for proper membrane protein folding, possibly by inducing a fine-tuned stress response and/or via modifying the composition of the bacterial cell envelope.

Multi-copy genes that enhance the yield of mammalian G protein-coupled receptors in Escherichia coli.

Faibles rendements d&#39;expression recombinante repr&eacute;sentent un obstacle majeur &agrave; la caract&eacute;risation physique des prot&eacute;ines membranaires. Ici, nous avons identifi&eacute; les g&egrave;nes qui am&eacute;liorent globalement la production de correctement pli&eacute;es G protein-coupled receptors (RCPG) chez Escherichia coli. Biblioth&egrave;ques de fragments chromosomiques bact&eacute;riennes ont &eacute;t&eacute; examin&eacute;s &agrave; l&#39;aide de deux syst&egrave;mes distincts qui surveillent: (i) &eacute;lev&eacute;e de fluorescence conf&eacute;r&eacute;e par une expression accrue des fusions de GPCR-GFP et (ii) a augment&eacute; de fixation du ligand fluorescent dans les cellules qui produisent les r&eacute;cepteurs plus actif. Trois touches multi-copie ont &eacute;t&eacute; isol&eacute;es par les deux m&eacute;thodes : nagD, codant la phosphatase de ribonucl&eacute;otide NagD ; un fragment de nlpD, codant une troncation de la lipoprot&eacute;ine pr&eacute;dite NlpD et le cluster de trois g&egrave;nes ptsN-yhbJ-npr, codant pour trois prot&eacute;ines du syst&egrave;me azote phosphotransf&eacute;rase. L&#39;expression de ces g&egrave;nes a entra&icirc;n&eacute; une augmentation de 3 &agrave; 10 fois dans les rendements des RCPG mammif&egrave;res diff&eacute;rents. Nos donn&eacute;es sont coh&eacute;rentes avec l&#39;hypoth&egrave;se selon laquelle l&#39;expression de ces g&egrave;nes peut servir &agrave; maintenir l&#39;int&eacute;grit&eacute; du p&eacute;riplasme bact&eacute;rienne et d&#39;offrir un environnement favorable pour la prot&eacute;ine de la membrane bon pliage, &eacute;ventuellement en induisant une r&eacute;action de stress affin&eacute; et/ou au moyen de modifier la composition de l&#39;enveloppe de la cellule bact&eacute;rienne.

G&egrave;nes multi-copie qui am&eacute;liorent le rendement des mammif&egrave;res G protein-coupled receptors chez Escherichia coli.

Niedrige Ertr&auml;gen von rekombinanten Ausdruck stellen ein gro&szlig;es Hindernis auf die physikalische Charakterisierung von Membranproteinen. Hier haben wir Gene identifiziert, die die Produktion von richtig gefaltete G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) in Escherichia coli weltweit zu verbessern. Bibliotheken der Bakterielle chromosomale Fragmente wurden &uuml;berpr&uuml;ft, mit zwei separate Systemen, die &uuml;berwachen: i erh&ouml;hte Fluoreszenz durch erh&ouml;hte Expression von GPCR-GFP Fusionen &uuml;bertragen und (Ii) erh&ouml;hte Bindung fluoreszierenden Liganden in Zellen produzieren aktiver Rezeptor. Drei Mehrfachkopie Hits wurden von beiden Methoden isoliert: NagD, Codierung die RIBONUKLEOTID-Phosphatase NagD; ein Fragment des NlpD, Codierung ein Abschneiden von den vorhergesagten Lipoprotein NlpD, und die drei-gen-Cluster PtsN-YhbJ-npr, Codierung drei Proteine von der Stickstoff-Phosphotransferase-System. Ausdruck dieser Gene resultierten in einer 3 und 10 8-fach erh&ouml;hten die Ertr&auml;ge der verschiedenen S&auml;ugetier-GPCRs. Unsere Daten steht im Einklang mit der Hypothese, die der Ausdruck dieser Gene, die Integrit&auml;t der bakteriellen Periplasm erhalten und ein g&uuml;nstiges Umfeld f&uuml;r reibungslose Membran Proteinfaltung, m&ouml;glicherweise durch induzieren eine fein abgestimmte Stressantwort und/oder &uuml;ber die &Auml;nderung der Zusammensetzung des Umschlags Bakterienzelle bereitzustellen dienen kann.

Mehrfachkopie Gene, die den Ertrag der S&auml;ugetier-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in Escherichia coli zu verbessern.

Basse rese di espressione recombinant rappresentano un grave ostacolo per la caratterizzazione fisica delle proteine di membrana. Qui, abbiamo identificato geni che migliorano globalmente la produzione di correttamente piegati proteine recettori accoppiati G (GPCR) in Escherichia coli. Librerie di frammenti cromosomici batteriche sono state proiettate utilizzando due sistemi separati che monitorano: (i) elevata fluorescenza conferito da una maggiore espressione delle fusioni GPCR-GFP e (ii) aumentato legame del ligando fluorescente in cellule producendo il recettore pi&ugrave; attivo. Tre colpi di formulari sono stati isolati da entrambi i metodi: nagD, codifica la fosfatasi ribonucleotide NagD; un frammento di nlpD, che codifica un troncamento della lipoproteina predetto NlpD e i tre-gene cluster ptsN-yhbJ-npr, codificano per tre proteine del sistema fosfotransferasi azoto. Espressione di questi geni ha comportato un aumento di 3 a 10 volte i rendimenti di diversi mammiferi GPCR. I nostri dati sono coerenti con l&#39;ipotesi che l&#39;espressione di questi geni possa servire per mantenere l&#39;integrit&agrave; della periplasm batterica e per fornire un ambiente favorevole per la proteina della membrana adeguata ripiegamento, possibilmente da indurre una risposta di stress perfezionato e/o tramite modifica della composizione della busta delle cellule batteriche.

Formulari geni che migliorano il rendimento dei recettori dei mammiferi accoppiati a proteine G in Escherichia coli.

&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x4F4E;&#x5229;&#x56DE;&#x308A;&#x304C;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x969C;&#x58C1;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7269;&#x7406;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30B0;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D0;&#x30EB;&#x306B;&#x6B63;&#x3057;&#x304F;&#x6298;&#x308A;&#x7573;&#x307E;&#x308C;&#x305F; G &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5171;&#x5F79;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; &#xFF08;Gpcr&#xFF09; &#x306E;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x3092;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x65AD;&#x7247;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x304C;&#x4E0A;&#x6620;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B; 2 &#x3064;&#x306E;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;: (i) &#x4E0A;&#x6607;&#x86CD;&#x5149; GPCR GFP &#x878D;&#x5408;&#x306E;&#x5F37;&#x5316;&#x306E;&#x5F0F;&#x3067;&#x4E0E;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x3057;&#x3001;(ii) &#x3088;&#x308A;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306A;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x7523;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;3 &#x8907;&#x6570;&#x90E8;&#x6570;&#x5B89;&#x6253;&#x4E21;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5206;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;: &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9; &#x30EA;&#x30DC;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9; &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC; NagD; nagDnlpD&#x3001;&#x5207;&#x308A;&#x6368;&#x3066;&#x306E;&#x4E88;&#x6E2C;&#x306E;&#x30EA;&#x30DD;&#x86CB;&#x767D; NlpD &#x3068;&#x3001;3 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC; &#x30B5;&#x30C3;&#x30C8;&#x30CC;&#x30B5;&#x30D7;&#x30EB;&#x30B5;&#x30C0;&#x793E;-yhbJ - 3 &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x7A92;&#x7D20;&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; npr&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x65AD;&#x7247;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306F; 3 &#x301C; 10 &#x500D;&#x306E;&#x5225;&#x306E;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E; Gpcr &#x306E;&#x53CE;&#x91CF;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306B;&#x7D50;&#x679C;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x7D30;&#x83CC;&#x30DA;&#x30EA;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30E0;&#x306E;&#x6574;&#x5408;&#x6027;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6298;&#x308A;&#x7573;&#x307F;&#x3001;&#x304D;&#x3081;&#x7D30;&#x3084;&#x304B;&#x306A;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30B9;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x8A98;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3084;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;&#x69CB;&#x6210;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x826F;&#x597D;&#x306A;&#x74B0;&#x5883;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x54FA;&#x4E73;&#x985E; G &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5171;&#x5F79;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x306E;&#x53CE;&#x91CF;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B;&#x8907;&#x6570;&#x90E8;&#x6570;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3002;

&#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xC2DD;&#xC758; &#xB0AE;&#xC740; &#xC218;&#xC728; &#xC8FC;&#xC694; &#xC7A5;&#xBCBD;&#xC744; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xBB3C;&#xB9AC;&#xC801; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC138;&#xACC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xC811;&#xD78C;&#xB41C; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; (GPCRs) &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xAC15;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC138;&#xADE0; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xBCC4;&#xB3C4; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0C1;&#xC601; &#xD588;&#xB2E4;: (i) &#xB192;&#xC740; &#xD615;&#xAD11; GPCR GFP fusions&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC2DD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC218; &#xC5EC; &#xD558; &#xACE0; (ii) &#xC99D;&#xAC00; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC778; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD558;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xD615;&#xAD11; ligand &#xBC14;&#xC778;&#xB529;. 3 Multi-copy &#xC548;&#xD0C0; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;: nagD, ribonucleotide &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; NagD; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; nlpD, &#xC608;&#xCE21; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31; NlpD, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; 3-&#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; ptsN-yhbJ-npr, 3 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC9C8;&#xC18C; phosphotransferase &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC798;&#xB9AC;&#xB294; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC870;&#xAC01;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD45C;&#xD604; 3-&#xB97C; 10 &#xBC30; &#xC99D;&#xAC00; &#xB2E4;&#xB978; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; Gpcrs&#xC758; &#xC218;&#xC728;&#xC5D0; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD45C;&#xC815;&#xC744; &#xC138;&#xADE0; periplasm&#xC758; &#xBB34;&#xACB0;&#xC131;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558; &#xACE0; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD3F4;&#xB529;, &#xBC8C;&#xAE08;&#xB41C; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xC2A4; &#xC751;&#xB2F5;&#xC744; &#xC720;&#xB3C4; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558; &#xAC8C; &#xB610;&#xB294; &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD09;&#xD22C;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131; &#xC218;&#xC815;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC720;&#xB9AC;&#xD55C; &#xD658;&#xACBD;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xC81C;&#xACF5;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4; &#xAC00;&#xC124;&#xACFC; &#xC77C;&#xCE58; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Multi-copy &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xAC00; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC758; &#xC218;&#xC775;&#xB960; &#xD5A5;&#xC0C1;.

Bajos rendimientos de expresi&oacute;n recombinante suponen una barrera importante para la caracterizaci&oacute;n f&iacute;sica de prote&iacute;nas de membrana. Aqu&iacute;, se han identificado genes que aumentan a nivel mundial la producci&oacute;n de correctamente dobladas G prote&iacute;na-junt&oacute; los receptores (GPCRs) en Escherichia coli. Bibliotecas de fragmentos cromos&oacute;micos bacterianas fueron defendidas mediante dos sistemas independientes que monitorean: (i) elevada fluorescencia confiere expresi&oacute;n realzada de fusiones GPCR-GFP y (ii) aumenta la Uni&oacute;n del ligando fluorescente en c&eacute;lulas productoras m&aacute;s activo receptor. Se aislaron tres hits m&uacute;ltiple por ambos m&eacute;todos: nagD, codificaba la fosfatasa de la ribonucle&oacute;tido NagD; un fragmento de nlpD, codificaci&oacute;n un truncamiento de la lipoprote&iacute;na predijo NlpD y el racimo de tres-gen ptsN-yhbJ-npr, codificaci&oacute;n de tres prote&iacute;nas del sistema de Fosfotransferasa de nitr&oacute;geno. Expresi&oacute;n de estos genes result&oacute; en un incremento de 3 a 10 veces en las producciones de diferentes mam&iacute;feros GPCRs. Nuestros datos est&aacute;n consistentes con la hip&oacute;tesis de que la expresi&oacute;n de estos genes puede servir para mantener la integridad del periplasma bacteriano y para proporcionar un entorno favorable para la prote&iacute;na de membrana adecuada plegable, posiblemente induciendo una respuesta de estr&eacute;s ajustada y/o modificar la composici&oacute;n de la envoltura celular bacteriana.

M&uacute;ltiple genes que mejoran el rendimiento de los receptores acoplados a prote&iacute;na de G mam&iacute;feros en Escherichia coli.

Autotransporters &#xFF08;ATs&#xFF09; &#x662F;&#x4E00;&#x5BB6;&#x4EBA;&#xFF0C;&#x7EC6;&#x83CC;&#x86CB;&#x767D;&#x542B; C &#x7EC8;&#x7AEF; &beta; &#x6876;&#x6210;&#x5F62;&#x7684;&#x57DF;&#xFF0C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x5176;&#x804C;&#x80FD;&#x8303;&#x56F4;&#x4ECE;&#x7C98;&#x9644;&#x5230;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x964D;&#x89E3;&#x7684; N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x5BA2;&#x8FD0;&#x57DF;&#x7684;&#x6613;&#x4F4D;&#x3002;&#x672C;&#x673A;&#x5BA2;&#x8FD0;&#x57DF;&#x4E0E;&#x5916;&#x6E90;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7F6E;&#x6362;&#x662F;&#x5438;&#x5F15;&#x529B;&#x7684;&#x6218;&#x7565;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x4EC5;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x751F;&#x7269;&#x50AC;&#x5316;&#x3001; &#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x75AB;&#x82D7;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7B49;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x83B7;&#x5F97;&#x673A;&#x68B0;&#x8D70;&#x5411;&#x7406;&#x89E3;&#x5728;&#x6613;&#x4F4D;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#x3002;&#x5B89;&#x975E;&#x4ED6;&#x660E;&#x7C7B;&#x5174;&#x594B;&#x5242;&#x7684;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x663E;&#x793A;&#x5305;&#x542B;&#x591A;&#x4E2A;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x7269;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x4E00;&#x76F4;&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x6709;&#x4E89;&#x8BAE;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5229;&#x7528;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5730;&#x5C55;&#x5F00;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x6297;&#x539F; 43 (Ag43) &#x5728;&#x663E;&#x793A;&#x4E24;&#x79CD;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x8BB0;&#x8005;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x5355;&#x94FE;&#x6297;&#x4F53; (M18 &#x5355;&#x94FE;&#x6297;&#x4F53;&#xFF09;&#xFF0C;&#x5B83;&#x5305;&#x542B;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x7269;&#x548C;&#x7CDC;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x5305;&#x542B;&#x56DB;&#x4E2A;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x7269;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x80BD;&#x548C;&#x5220;&#x9664;&#x672C;&#x673A;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x57DF;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x53EA;&#x6709; C &#x7EC8;&#x7AEF; &beta;-&#x6876;&#x548C;&#x87BA;&#x7EB9;&#x7684; &alpha;-&#x87BA;&#x65CB;&#x9AD8;&#x6548;&#x8868;&#x9762;&#x663E;&#x793A;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x542B;&#x6709;&#x591A;&#x4E2A;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x7269;&#x7684;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x610F;&#x5473;&#x7740;&#x6CA1;&#x6709;&#x56FA;&#x6709;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x529F;&#x80FD;&#x6027;&#x79FB;&#x4F4D;&#x548C;&#x663E;&#x793A;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x503A;&#x5238;&#x542B;&#x86CB;&#x767D;&#x4ECB;&#x5BFC; AT &#x7CFB;&#x7EDF;&#x548C;&#x5E94;&#x6253;&#x5F00;&#x86CB;&#x767D;&#x663E;&#x793A;&#x4E0E;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7684;&#x65B0;&#x9014;&#x5F84;&#x3002;

Autotransporter &#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x5F81;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A;&#x7684;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x503A;&#x5238;&#x542B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;

Autotransporters (ATs) are a family of bacterial proteins containing a C-terminal Î²-barrel-forming domain that facilitates the translocation of N-terminal passenger domain whose functions range from adhesion to proteolysis. Genetic replacement of the native passenger domain with heterologous proteins is an attractive strategy not only for applications such as biocatalysis, live-cell vaccines, and protein engineering but also for gaining mechanistic insights toward understanding AT translocation. The ability of ATs to efficiently display functional recombinant proteins containing multiple disulfides has remained largely controversial. By employing high-throughput single-cell flow cytometry, we have systematically investigated the ability of the Escherichia coli AT Antigen 43 (Ag43) to display two different recombinant reporter proteins, a single-chain antibody (M18 scFv) that contains two disulfides and chymotrypsin that contains four disulfides, by varying the signal peptide and deleting the different domains of the native protein. Our results indicate that only the C-terminal Î²-barrel and the threaded Î±-helix are essential for efficient surface display of functional recombinant proteins containing multiple disulfides. These results imply that there are no inherent constraints for functional translocation and display of disulfide bond-containing proteins mediated by the AT system and should open new avenues for protein display and engineering.

Single-cell characterization of autotransporter-mediated Escherichia coli surface display of disulfide bond-containing proteins.

Autotransporters (ATs) sont une famille de prot&eacute;ines bact&eacute;riennes contenant un domaine formant des &beta;-baril de C-terminal qui facilite la translocation du domaine N-terminal de passagers dont la gamme des fonctions de l&#39;adh&eacute;rence &agrave; la prot&eacute;olyse. Remplacement g&eacute;n&eacute;tique du domaine natif de passager avec des prot&eacute;ines h&eacute;t&eacute;rologues est une strat&eacute;gie s&eacute;duisante non seulement pour des applications telles que la biocatalyse, vaccins de cellules vivantes et ing&eacute;nierie des prot&eacute;ines, mais aussi pour gagner les perspicacit&eacute;s m&eacute;canistes vers translocation AT compr&eacute;hension. La capacit&eacute; des ATs d&#39;afficher efficacement les prot&eacute;ines recombinantes fonctionnels contenant plusieurs disulfures est rest&eacute;e largement controvers&eacute;e. En employant la cytom&eacute;trie en flux haut d&eacute;bit unicellulaire, nous avons syst&eacute;matiquement &eacute;tudi&eacute; la possibilit&eacute; de l&#39;Escherichia coli &agrave; l&#39;antig&egrave;ne 43 (Ag43) d&#39;afficher deux prot&eacute;ines diff&eacute;rentes journaliste recombinant, un anticorps de cha&icirc;ne unique (M18 scFv) qui contient deux disulfures et chymotrypsine qui contient quatre disulfures, en variant le peptide signal et en supprimant les diff&eacute;rents domaines de la prot&eacute;ine native. Nos r&eacute;sultats indiquent que seulement le &beta;-Canon C-terminal et l&#39;h&eacute;lice &alpha; filet&eacute;e sont indispensables pour l&#39;affichage de surface efficace de prot&eacute;ines recombinantes fonctionnelles, contenant plusieurs disulfures. Ces r&eacute;sultats laissent entendre qu&#39;il n&#39;y a aucune contrainte inh&eacute;rente pour translocation fonctionnelle et affichage des prot&eacute;ines liaison disulfure m&eacute;di&eacute;e par le syst&egrave;me AT et devrait ouvrir de nouvelles avenues pour l&#39;affichage de la prot&eacute;ine et de g&eacute;nie.

Caract&eacute;risation des cellules individuelles d&#39;autotransporter v&eacute;hicul&eacute;e par des surface Escherichia coli afficher des prot&eacute;ines liaison disulfure.

Autotransporters (ATs) sind eine Familie von bakteriellen Proteinen mit eine C-terminale &beta;-Fass-bildende Dom&auml;ne, die die Translokation der N-terminalen Passagier Dom&auml;ne dessen Funktionen reichen von Adh&auml;sion zu Proteolyse erleichtert. Genetischen Austausch der native Passagier Dom&auml;ne mit heterologen Proteinen ist eine attraktive Strategie nicht nur f&uuml;r Anwendungen wie Biokatalyse, Leben-Zelle Impfstoffen und Protein-Engineering, sondern auch f&uuml;r mechanistische Einblicke in Richtung Verst&auml;ndnis AT Translokation zu gewinnen. Die F&auml;higkeit von ATs effizient funktionelle rekombinante Proteine, enth&auml;lt mehrere Disulfiden angezeigt ist weitgehend umstritten geblieben. Durch den Einsatz von Hochdurchsatz einzellige Durchflusszytometrie, haben wir systematisch die F&auml;higkeit das Escherichia coli in Antigen-43 (Ag43), zwei verschiedene rekombinante Reporter Proteine, ein Einzel-Kette-Antik&ouml;rper (M18 ScFv) anzuzeigen, enth&auml;lt zwei Disulfiden und Chymotrypsin, die vier Disulfiden enth&auml;lt durch Variation des Signal-Peptids und L&ouml;schen von die verschiedenen Bereichen des nativen Proteins, untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass nur die C-terminale &beta;-Fass und das Gewinde &alpha;-Helix f&uuml;r effiziente Oberfl&auml;che Display funktionale rekombinanter Proteine, enth&auml;lt mehrere Disulfiden notwendig sind. Diese Ergebnisse bedeuten, dass es keine inh&auml;renten Einschr&auml;nkungen f&uuml;r funktionale Translokation und Anzeige von Disulfid Bond-haltige Proteine vermittelt durch das AT-System und sollte neue Wege zu Protein-Display und Engineering.

Einzeller-Charakterisierung von Escherichia-coli-Oberfl&auml;che Autotransporter-vermittelte Darstellung von Disulfid Bond-haltige Proteine.

Autotransporters (ATs) sono una famiglia di proteine batteriche contenenti un dominio C-terminale formando &beta;-barilotto che facilita la traslocazione del dominio N-terminale passeggeri la cui gamma di funzioni dall&#39;adesione alla proteolisi. Sostituzione genetica del dominio nativo passeggero con proteine eterologa &egrave; una strategia interessante non solo per applicazioni quali biocatalysis, live-cella vaccini e ingegneria della proteina, ma anche per guadagnando meccanicistiche intuizioni verso traslocazione AT comprensione. La capacit&agrave; di visualizzare in modo efficiente funzionale proteine ricombinanti contenenti pi&ugrave; disulfides ATs &egrave; rimasto in gran parte controversa. Mediante l&#39;impiego di alto-rendimento cella singola flusso cytometry, abbiamo studiato sistematicamente la capacit&agrave; di Escherichia coli all&#39;antigene 43 (Ag43) per visualizzare due proteine differenti reporter ricombinante, un anticorpo catena singola (M18 scFv) che contiene due disulfides e chimotripsina che contiene quattro disulfides, variando il peptide segnale e l&#39;eliminazione di diversi domini della proteina nativa. I nostri risultati indicano che solo il C-terminale &beta;-barilotto e filettata &alpha;-elica sono essenziali per la visualizzazione di superficie efficiente di proteine ricombinanti funzionali contenenti pi&ugrave; disulfides. Questi risultati implicano che non sono presenti vincoli inerenti per traslocazione funzionale e visualizzazione delle proteine contenenti legame disolfuro mediata dal sistema AT e dovrebbe aprire nuove vie per la visualizzazione di proteine e di ingegneria.

Cella singola caratterizzazione del autotransporter-mediata superficie di Escherichia coli visualizzare delle proteine contenenti legame disolfuro.

Autotransporters (ATs) N &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB;&#x65C5;&#x5BA2;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x79FB;&#x884C;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x305D;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306F;&#x63A5;&#x7740;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3; &#xFF5E; C &#x672B;&#x7AEF; &beta; &#x30D0;&#x30EC;&#x30EB;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x7D30;&#x83CC;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5BB6;&#x65CF;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x65C5;&#x5BA2;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x7570;&#x7A2E;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x4EA4;&#x63DB;&#x306F;&#x9B45;&#x529B;&#x7684;&#x306A;&#x6226;&#x7565;&#x751F;&#x4F53;&#x89E6;&#x5A92;&#x3001;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x30EF;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5DE5;&#x5B66;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x3082;&#x7406;&#x89E3;&#x3067;&#x8EE2;&#x6D41;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x5F97;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3067;&#x3059;&#x3002;ATs &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x8907;&#x6570;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x6A5F;&#x80FD;&#x6027;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x5927;&#x3044;&#x306B;&#x7269;&#x8B70;&#x3092;&#x7D9A;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x5358;&#x4E00;&#x30BB;&#x30EB; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F; 2 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; 2 &#x3064;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x3068; 4 &#x3064;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x4FE1;&#x53F7;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x5225;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x524A;&#x9664;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x308B;&#x30AD;&#x30E2;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x5358;&#x9396;&#x6297;&#x4F53; &#xFF08;M18 &#x7121;&#x7D30;&#x80DE;) &#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x6297;&#x539F; 43 (Ag43) &#x306E;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x306B;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x306E;&#x307F; C &#x672B;&#x7AEF; &beta; &#x30D0;&#x30EC;&#x30EB;&#x3068;&#x30B9;&#x30EC;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E; &alpha; &#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x304C;&#x8907;&#x6570;&#x4E8C;&#x786B;&#x5316;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x6A5F;&#x80FD;&#x6027;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x793A;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x8EE2;&#x6D41;&#x306E;&#x56FA;&#x6709;&#x5236;&#x7D04;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3001;&#x30B8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8868;&#x793A;&#x3067;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3057;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30D7;&#x30EC;&#x30A4;&#x3068;&#x5DE5;&#x5B66;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x9053;&#x3092;&#x958B;&#x304F;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3092;&#x610F;&#x5473;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5358;&#x4E00;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x8A55;&#x4FA1; autotransporter &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x8868;&#x9762;&#x306E;&#x30B8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Autotransporters (ATs)&#xB294; &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; N-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC5EC;&#xAC1D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xC804; &#xC811;&#xCC29;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCA0;&#xC774;&#xC2A4;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBC94;&#xC704;&#xB97C; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &beta; &#xBC30;&#xB7F4; &#xD615;&#xC131; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC81C;&#xD488;&#xAD70; &#xC774;&#xB2E4;. &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC2B9;&#xAC1D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBD84;&#xB9AC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC720;&#xC804; &#xAD50;&#xCCB4;&#xB294; biocatalysis, &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC31;&#xC2E0;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACF5;&#xD559; &#xB4F1; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC774;&#xD574; AT &#xC804; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC73C;&#xB85C; &#xAE30;&#xACC4; &#xB860; &#xC801;&#xC778; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC5BB;&#xACE0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB9E4;&#xB825;&#xC801;&#xC778; &#xC804;&#xB7B5; &#xC774;&#xB2E4;. &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5EC;&#xB7EC; disulfides&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; Ats&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC740; &#xD06C;&#xAC8C; &#xB17C;&#xB780;&#xC774; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140; cytometry &#xCC44;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD56D; &#xC6D0; 43 (Ag43)&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC;&#xD560; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB9AC;&#xD3EC;&#xD130; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB450; disulfides &#xBC0F; &#xC2E0;&#xD638; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xCC9C;&#xC5F0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xC0AD;&#xC81C; &#xD558; &#xC5EC; 4 &#xAC1C;&#xC758; disulfides&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBC94;&#xC6A9;&#xC131;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xCCB4;&#xC778; &#xD56D; &#xCCB4; (M18 scFv) &#xC870;&#xC0AC; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC6B0;&#xB9AC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &beta;-&#xBC30;&#xB7F4;&#xACFC; &#xC2A4;&#xB808;&#xB4DC; &alpha;-&#xB098;&#xC120; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xC5EC;&#xB7EC; disulfides&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xD45C;&#xBA74; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD568;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xC554;&#xC2DC; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC804; &#xC88C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACE0;&#xC720;&#xC758; &#xC544;&#xBB34; &#xC81C;&#xC57D; &#xBC0F; &#xC774;&#xD669;&#xD654; &#xBCF8;&#xB4DC; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; AT &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; &#xBC0F; &#xC5D4;&#xC9C0;&#xB2C8;&#xC5B4;&#xB9C1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4;&#xB3C4; &#xC5F4;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD55C;&#xB2E4;.

&#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xD45C;&#xBA74; autotransporter &#xC911;&#xC7AC;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xC774;&#xD669;&#xD654; &#xBCF8;&#xB4DC; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD45C;&#xC2DC;.

Autotransporters (ATs) son una familia de prote&iacute;nas bacterianas que contiene un dominio c-terminal de &beta;-barril-formaci&oacute;n que facilita el desplazamiento del dominio de N-terminal de pasajeros cuya gama de funciones de adhesi&oacute;n a la proteolisis. Reemplazo gen&eacute;tico del dominio nativo pasajeros con prote&iacute;nas heter&oacute;logas es una estrategia atractiva no s&oacute;lo para aplicaciones tales como ingenier&iacute;a de prote&iacute;nas, Biocat&aacute;lisis y vacunas de c&eacute;lulas vivas, sino tambi&eacute;n para obtener ideas mecanicistas hacia el desplazamiento de comprensi&oacute;n en. La capacidad de ATs quieras eficientemente funcionales prote&iacute;nas recombinantes que contiene m&uacute;ltiples disulfuros se ha mantenido en gran medida controvertida. Mediante el empleo de citometr&iacute;a de flujo unicelular de alto rendimiento, hemos investigado sistem&aacute;ticamente la capacidad de la Escherichia coli en ant&iacute;geno 43 (Ag43) para mostrar dos prote&iacute;nas diferentes reportero recombinante, un anticuerpo de cadena simple (M18 scFv) que contiene dos disulfuros y quimotripsina que contiene cuatro disulfuros, variando el p&eacute;ptido se&ntilde;al y eliminando los diferentes dominios de la prote&iacute;na nativa. Nuestros resultados indican que s&oacute;lo el terminal C &beta;-barril y la &alpha;-h&eacute;lice roscada son esenciales para la exhibici&oacute;n de superficie eficiente de prote&iacute;nas recombinantes funcionales que contiene m&uacute;ltiples disulfuros. Estos resultados implican que no hay limitaciones inherentes para desplazamiento funcional y visualizaci&oacute;n de prote&iacute;nas que contiene el enlace de disulfuro hab&iacute;a mediada por el sistema de AT y deber&iacute;a abrir nuevas avenidas para la exhibici&oacute;n de la prote&iacute;na y la ingenier&iacute;a.

Caracterizaci&oacute;n unicelular de superficie de coli Escherichia autotransporter mediada por la visualizaci&oacute;n de prote&iacute;nas que contiene el enlace de disulfuro.

&#x6BCF;&#x4E2A; B &#x7EC6;&#x80DE;&#x53D7;&#x4F53;&#x7531;&#x6210;&#x5BF9;&#x91CD;&#x578B;&#x548C;&#x8F7B;&#x578B;&#x94FE;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x627E;&#x51FA;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x91CD;&#x548C;&#x8F7B;&#x94FE;&#x53EF;&#x53D8;&#x533A; &#xFF08;V(H) &#x548C; V(L)) &#x5728;&#x7ED9;&#x5B9A;&#x7684; B &#x7EC6;&#x80DE;&#x6C47;&#x8F91; &#x300B;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5173;&#x4E8E;&#x91CD;&#x578B;&#x548C;&#x8F7B;&#x578B;&#x94FE;&#x7684;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x914D;&#x5BF9;&#x4FE1;&#x606F;&#x4E22;&#x5931;&#x540E;&#x662F;&#x6279;&#x91CF;&#x6EB6;&#x89E3;&#x7684; B &#x7EC6;&#x80DE;&#x7FA4;&#x4F53;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4FDD;&#x7559;&#x6B64;&#x914D;&#x5BF9;&#x4FE1;&#x606F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x65B9;&#x9488;&#xFF0C;&#x5728;&#x5355;&#x4E2A; B &#x7EC6;&#x80DE; (&gt; &#x5B9E;&#x9A8C;&#x6BCF; 5 &times;&#xFF09; &#x80FD;&#x529B;&#xFF09; &#x662F;&#x5B58;&#x653E;&#x4E8E;&#x9AD8;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x5FAE;&#x5B54;&#x677F; &#xFF08;125 pl/&#x4E95;&#xFF09; &#x548C;&#x53D1;&#x751F;&#x88C2;&#x89E3;&#x539F;&#x4F4D;&#x3002;&#x4E0A;&#x78C1;&#x73E0;&#xFF0C;&#x53CD;&#x5411;&#x8F6C;&#x5F55;&#x548C;&#x4E73;&#x6DB2; V(H):V(L) &#x8054;&#x7CFB; PCR &#x6269;&#x589E;&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x6355;&#x83B7;&#x7684; mRNA&#x3002;&#x94FE;&#x63A5;&#x7684;&#x6210;&#x7EE9;&#x5355;&#x7531;&#x7167;&#x6392;&#x80F6;&#x7247;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9A8C;&#x8BC1; V(H):V(L) &#x5BF9;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x8FD9;&#x79CD;&#x505A;&#x6CD5;&#x7684;&#x4FDD;&#x771F;&#x5EA6;&#x548C;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7528;&#x4E8E;&#x5E8F;&#x5217;&#x6C47;&#x8F91; &#x300B; &#x4E09;&#x4EBA;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E9A;&#x7FA4;&#x5916;&#x5468;&#x8840; IgG(+) B &#x7EC6;&#x80DE;&#x3001; &#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x7834;&#x4F24;&#x98CE;&#x7C7B;&#x6BD2;&#x7D20;&#x75AB;&#x82D7;&#x63A5;&#x79CD;&#x540E;&#x7684;&#x5916;&#x56F4; plasmablasts &#x548C;&#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x5B63;&#x8282;&#x6027;&#x6D41;&#x611F;&#x75AB;&#x82D7;&#x63A5;&#x79CD;&#x540E;&#x7684;&#x8BB0;&#x5FC6; B &#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;

&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x6210;&#x5BF9;&#x4EBA;&#x4F53;&#x514D;&#x75AB;&#x7403;&#x86CB;&#x767D;&#x91CD;&#x578B;&#x548C;&#x8F7B;&#x578B;&#x94FE;&#x6C47;&#x8F91; &#x300B;&#x3002;

Each B-cell receptor consists of a pair of heavy and light chains. High-throughput sequencing can identify large numbers of heavy- and light-chain variable regions (V(H) and V(L)) in a given B-cell repertoire, but information about endogenous pairing of heavy and light chains is lost after bulk lysis of B-cell populations. Here we describe a way to retain this pairing information. In our approach, single B cells (>5 Ã— 10(4) capacity per experiment) are deposited in a high-density microwell plate (125 pl/well) and lysed in situ. mRNA is then captured on magnetic beads, reverse transcribed and amplified by emulsion V(H):V(L) linkage PCR. The linked transcripts are analyzed by Illumina high-throughput sequencing. We validated the fidelity of V(H):V(L) pairs identified by this approach and used the method to sequence the repertoire of three human cell subsets-peripheral blood IgG(+) B cells, peripheral plasmablasts isolated after tetanus toxoid immunization and memory B cells isolated after seasonal influenza vaccination.

High-throughput sequencing of the paired human immunoglobulin heavy and light chain repertoire.

Chaque r&eacute;cepteur des cellules B se compose d&#39;une paire de cha&icirc;nes lourdes et l&eacute;g&egrave;res. S&eacute;quen&ccedil;age haut-d&eacute;bit permet d&#39;identifier un grand nombre de r&eacute;gions variables de cha&icirc;ne lourde et la lumi&egrave;re (V(H) et V(L)) dans un r&eacute;pertoire donn&eacute; de B-cellule, mais les informations sur l&#39;appariement endog&egrave;ne des cha&icirc;nes lourdes et l&eacute;g&egrave;res est perdue apr&egrave;s la lyse des populations de cellules B en vrac. Nous d&eacute;crivons ici une fa&ccedil;on de conserver cette information d&#39;appariement. Dans notre approche, simple &agrave; cellules B (&gt; 5 &times; 10 4 capacit&eacute; par exp&eacute;rience) sont d&eacute;pos&eacute;s dans une plaque de microtitration &agrave; haute densit&eacute; (125 pl/puits) et lys&eacute;es in situ. ARNm est ensuite captur&eacute;e sur billes magn&eacute;tiques, inverses transcrit et amplifi&eacute; par l&#39;&eacute;mulsion V(H):V(L) lien PCR. Les relev&eacute;s de notes li&eacute;es sont analys&eacute;s par s&eacute;quen&ccedil;age haut d&eacute;bit Illumina. Nous avons valid&eacute; la fid&eacute;lit&eacute; des paires V(H):V(L) identifi&eacute; par cette approche et utilis&eacute; la m&eacute;thode pour s&eacute;quencer le r&eacute;pertoire des trois globules cellules humaines sous-ensembles-p&eacute;riph&eacute;rique IgG(+) B, plasmablasts p&eacute;riph&eacute;riques isol&eacute;es apr&egrave;s vaccination d&#39;anatoxine t&eacute;tanique et cellules B m&eacute;moire isol&eacute;s apr&egrave;s la vaccination contre la grippe saisonni&egrave;re.

S&eacute;quen&ccedil;age haut-d&eacute;bit du r&eacute;pertoire appari&eacute;s immunoglobuline humaine des cha&icirc;nes lourdes et l&eacute;g&egrave;res.

Jeder B-Zell-Rezeptor besteht aus einem Paar von schweren und leichten Ketten. Hochdurchsatz-Sequenzierung kann identifizieren zahlreicher Variablen Regionen der schweren Kette und Licht (V(H) und V(L)) in einem bestimmten B-Zell-Repertoires, aber Informationen &uuml;ber endogene Paarung von schweren und leichten Ketten geht verloren nach Massen-Zerst&ouml;rung der B-Zell-Populationen. Hier beschreiben wir eine M&ouml;glichkeit, diese Kopplungs-Information zu behalten. In unserem Ansatz, einzelne B-Zellen (&gt; 5 &times; 10 4 Kapazit&auml;t pro Experiment) sind in einem platzsparenden Mikrotiterplatte (125 pl/Mulde) hinterlegt und Tauwetterprotokoll aufgel&ouml;st in-situ. mRNA wird dann auf den magnetischen Perlen, umgekehrte transkribiert und verst&auml;rkt durch Emulsion V(H):V(L) Gest&auml;nge PCR erfasst. Die verkn&uuml;pften Abschriften werden von Illumina Hochdurchsatz-Sequenzierung analysiert. Wir &uuml;berpr&uuml;ft die Treue des V(H):V(L)-Paare, die durch diesen Ansatz identifiziert und verwendet die Methode das Repertoire der drei menschliche Zelle Teilmengen-peripheren Blutzellen IgG(+) B, periphere Plasmablasts isoliert nach Tetanus-Toxoid-Immunisierung und B Ged&auml;chtniszellen isoliert nach der saisonalen Grippe-Impfung zu sequenzieren.

Hochdurchsatz-Sequenzierung des gekoppelten menschlichen Immunoglobulins schwere und leichte Kette Repertoires.

Ogni recettore delle cellule B &egrave; costituito da una coppia di catene pesanti e leggere. Sequenziamento ad alta velocit&agrave; in grado di identificare un gran numero di regioni variabili di catene pesanti e leggere (V(H) e V(L)) in un determinato repertorio di cellule B, ma informazioni sull&#39;abbinamento endogeno delle catene pesanti e leggere si perde dopo lisi di massa delle popolazioni di cellule B. Qui descriviamo un modo per mantenere questa informazioni di accoppiamento. Nel nostro approccio, singole cellule B (&amp;gt; 5 &times; 10, paragrafo 4 capacit&agrave; per esperimento) sono depositati in una piastra microtiter ad alta densit&agrave; (125 pl/pozzetto) e lisati in situ. mRNA &egrave; quindi catturato su perline magnetici, inverso trascritto e amplificato da emulsione V(H):V(L) sollevatore PCR. Le trascrizioni collegate vengono analizzate mediante sequenziamento high-throughput Illumina. Abbiamo convalidato la fedelt&agrave; di coppie V(H):V(L) identificato da questo approccio e utilizzato il metodo per sequenziare il repertorio di tre cellule umane sottoinsiemi-periferico globuli B IgG(+), plasmablasts periferico isolato dopo immunizzazione Toxoide di tetano e cellule di memoria B isolate dopo la vaccinazione contro l&#39;influenza stagionale.

High-throughput sequencing del repertorio accoppiati immunoglobulina umana catena pesante e leggera.

&#x5404; B &#x7D30;&#x80DE;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x91CD;&#x304F;&#x3001;&#x8EFD;&#x9396;&#x306E;&#x30DA;&#x30A2;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x91CD;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8EFD;&#x9396;&#x53EF;&#x5909;&#x9818;&#x57DF;&#x6570;&#x304C;&#x591A;&#x3044;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059; (V(H) &#x3068; V(L)) &#x7279;&#x5B9A;&#x306E; B &#x7D30;&#x80DE;&#x30EC;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x304C;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x91CD;&#x304F;&#x3001;&#x8EFD;&#x9396;&#x306E;&#x30DA;&#x30A2;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x306F;&#x5931;&#x308F;&#x308C;&#x307E;&#x3059; B &#x30BB;&#x30EB;&#x4EBA;&#x53E3;&#x306E;&#x4E00;&#x62EC;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5F8C;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x3053;&#x306E;&#x30DA;&#x30A2;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x60C5;&#x5831;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;1 &#x3064;&#x306E;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3067;&#x306F;&#x3001;B &#x7D30;&#x80DE; (&#x76EE; 5 &times; 10 (4) &#x5BB9;&#x91CF;&#x5B9F;&#x9A13;) &#x306F;&#x9AD8;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB; &#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8; &#xFF08;125 pl/&#x3088;&#x304F;&#xFF09; &#x3092;&#x5806;&#x7A4D;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5834;&#x5206;&#x96E2;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;mRNA &#x8EE2;&#x5199;&#x3057;&#x3001;&#x30A8;&#x30DE;&#x30EB;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3; V(H):V(L) &#x30EA;&#x30F3;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B8; PCR &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5897;&#x5E45;&#x78C1;&#x6C17;&#x30D3;&#x30FC;&#x30BA;&#x3001;&#x9006;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6210;&#x7E3E;&#x8A3C;&#x660E;&#x66F8;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30EB;&#x30DF;&#x30CA;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x540C;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F; V(H):V(L) &#x30DA;&#x30A2;&#x306E;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3057;&#x3001;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E; 3 &#x3064;&#x306E;&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x672B;&#x68A2;&#x8840; IgG(+) B &#x7D30;&#x80DE;&#x3001;&#x7834;&#x50B7;&#x98A8;&#x30C8;&#x30AD;&#x30BD;&#x30A4;&#x30C9;&#x4E88;&#x9632;&#x63A5;&#x7A2E;&#x5F8C;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5468;&#x8FBA;&#x306E; plasmablasts &#x3068;&#x5B63;&#x7BC0;&#x6027;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D5;&#x30EB;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B6; &#x30EF;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x63A5;&#x7A2E;&#x5F8C;&#x8A18;&#x61B6; B &#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30EC;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30DA;&#x30A2;&#x3072;&#x3068;&#x514D;&#x75AB;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#x91CD;&#x9396;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8EFD;&#x9396;&#x306E;&#x30EC;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x3002;

&#xBB34; &#xAC81; &#xACE0; &#xAC00;&#xBCBC;&#xC6B4; &#xCCB4;&#xC778; &#xC30D; &#xAC01; B &#xC138;&#xD3EC; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD558;&#xC5EC; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC838; &#xC788;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xB9CE;&#xC740; &#xBB34;&#xAC70;&#xC6B4; &#xBC0F; &#xBE5B; &#xCCB4;&#xC778; &#xAC00;&#xBCC0; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; (V(H) &#xBC0F; V(L)) &#xC8FC;&#xC5B4;&#xC9C4;&#xB41C; B-&#xC140; &#xB808; &#xD37C; &#xD1A0;&#xB9AC;&#xB9CC; &#xBB34; &#xAC81; &#xACE0; &#xAC00;&#xBCBC;&#xC6B4; &#xC0AC;&#xC2AC; &#xC30D;&#xC744; &#xC0DD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC815;&#xBCF4;&#xB294; &#xC190;&#xC2E4; B &#xC138;&#xD3EC; &#xC778;&#xAD6C;&#xC758; &#xB300;&#xB7C9; lysis &#xD6C4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00;&#xC774; &#xC5F0;&#xACB0; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC77C; B &#xC140; (&amp;gt; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB2F9; 5 &times; 10(4) &#xC6A9;&#xB7C9;) &#xACE0;&#xBC00;&#xB3C4; microwell &#xD50C;&#xB808;&#xC774;&#xD2B8; (125 pl/&#xC6B0;&#xBB3C;)&#xC5D0; &#xC608;&#xCE58; &#xB418;&#xBA70; lysed &#xC6D0;&#xB798;&#xC758; &#xC7A5;&#xC18C;&#xC5D0;. mRNA &#xB2E4;&#xC74C; &#xC790;&#xAE30; &#xAD6C;&#xC2AC;, &#xC5ED;&#xBC29;&#xD5A5; &#xBCC0;&#xD558;&#xAC8C; &#xD558; &#xACE0; &#xC5D0;&#xBA40;&#xC83C; V(H):V(L) &#xC5F0;&#xACC4; PCR&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC99D;&#xD3ED;&#xC5D0; &#xCEA1;&#xCC98;&#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xB179;&#xCDE8; &#xB85D; Illumina &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; V(H):V(L) &#xC30D;&#xC774; &#xC811;&#xADFC;&#xC774; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC758; &#xC815;&#xD655;&#xB3C4; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131;&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC; &#xD558; &#xACE0; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC; &#xD558;&#xC704; &#xC9D1;&#xD569;-&#xB9D0; &#xCD08; &#xD608;&#xC561; IgG(+) B &#xC140;, &#xC8FC;&#xBCC0; plasmablasts &#xD30C;&#xC0C1;&#xD48D; toxoid &#xC608;&#xBC29; &#xC811;&#xC885; &#xD6C4; &#xC808;&#xC5F0; &#xBC0F; &#xACC4;&#xC808; &#xC778;&#xD50C;&#xB8E8;&#xC5D4;&#xC790; &#xC608;&#xBC29; &#xC811;&#xC885; &#xD6C4; &#xC808;&#xC5F0; &#xBA54;&#xBAA8;&#xB9AC; B &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB808; &#xD37C; &#xD1A0;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;.

&#xC30D;&#xC744; &#xC774;&#xB8E8;&#xB294; &#xC778;&#xAC04; &#xBA74;&#xC5ED; &#xAE00;&#xB85C;&#xBD88;&#xB9B0; &#xBB34; &#xAC81; &#xACE0; &#xAC00;&#xBCBC;&#xC6B4; &#xCCB4;&#xC778; &#xB808; &#xD37C; &#xD1A0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC2A4;&#xB8E8;&#xD48B; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Cada receptor de c&eacute;lulas B consiste en un par de cadenas pesadas y ligeras. Secuenciaci&oacute;n de alto rendimiento puede identificar gran cantidad de regiones variables de cadena pesada y ligera (v (h) y v en un determinado repertorio de c&eacute;lulas B, pero la informaci&oacute;n sobre end&oacute;geno emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras se pierde despu&eacute;s de la lisis de la mayor parte de las poblaciones de c&eacute;lulas B. Aqu&iacute; describimos una forma de conservar esta informaci&oacute;n de emparejamiento. En nuestro enfoque, solo las c&eacute;lulas B (&gt; 5 &times; 10 (4) capacidad por experimento) son depositados en una placa de micropocillos de alta densidad (125 pl/pocillo) y lisis in situ. mRNA es capturado en bolas magn&eacute;ticas, inversas transcrito y amplificado por la emulsi&oacute;n V(H):V(L) acoplamiento PCR. Las transcripciones vinculadas son analizadas por secuenciaci&oacute;n de alto rendimiento de Illumina. Hemos validado la fidelidad de V(H):V(L) pares identificados por este enfoque y utiliza el m&eacute;todo para secuenciar el repertorio de tres c&eacute;lulas humanas subconjuntos-perif&eacute;rico IgG(+) B gl&oacute;bulos, plasmablasts perif&eacute;ricos aislados despu&eacute;s de la inmunizaci&oacute;n de toxoide de t&eacute;tanos y c&eacute;lulas de memoria B aisladas despu&eacute;s de la vacunaci&oacute;n de la gripe estacional.

Article	Year
Engineering of protease variants exhibiting high catalytic activity and exquisite substrate selectivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 15867160	2005
Substrate specificity of the Escherichia coli outer membrane protease OmpP. Journal of bacteriology\| PubMed ID: 17085556	2007
Highly active and selective endopeptidases with programmed substrate specificities. Nature chemical biology\| PubMed ID: 18391948	2008
An engineered protease that cleaves specifically after sulfated tyrosine. Angewandte Chemie (International ed. in English)\| PubMed ID: 18780393	2008
Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nature protocols\| PubMed ID: 19478805	2009
Proteases that can distinguish among different post-translational forms of tyrosine engineered using multicolor flow cytometry. Journal of the American Chemical Society\| PubMed ID: 19924991	2009
A high-throughput single-cell analysis of human CD8âº T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of clinical investigation\| PubMed ID: 21965332	2011
Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 22355106	2012
Multi-copy genes that enhance the yield of mammalian G protein-coupled receptors in Escherichia coli. Metabolic engineering\| PubMed ID: 22609824	2012
Single-cell characterization of autotransporter-mediated Escherichia coli surface display of disulfide bond-containing proteins. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 23019324	2012
High-throughput sequencing of the paired human immunoglobulin heavy and light chain repertoire. Nature biotechnology\| PubMed ID: 23334449	2013

Navin Varadarajan

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