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형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.
보급은 종종 화학 반응 또는 생물 학적 과정에 중요한 속도 - 결정 단계이며, 세포내 이벤트 광범위한 역할을 담당하고 있습니다. 점성은 분자와 단백질의 확산에 영향을 미치는 주요 매개 변수 중 하나이며, 점도의 변화가 세포 수준에서 질병 및 장애로 연결되었습니다. 1-3 대량 점도를 측정하는 방법이 잘 개발되어 있지만, 이미징 microviscosity는 과제 남아 . 최근 얻을 힘들었 때까지 같은 단일 세포와 같은 미세한 물체의 점성지도는 있습니다. 기타 광학 기술과 유사, 그것이 비 파괴적인, 최소한 침략이며 생활 세포와 조직에 적용할 수 있기 때문에 형광 기술과 매핑 점도는 유리입니다.
형광 분자 rotors는 형광 수명과 microenvironment의 점성 함수가 양자 수율을 나타냅니다. 4,5 분자내 왜곡하고 있군요 또는회전은 흥분 상태 뒤쪽에서 바닥 상태로 비 발광 붕괴로 이어집니다. 점성 환경이 아닌 발광 붕괴 경로에 대한 액세스를 제한하는이 회전하거나 트위스트 느려집니다. 이것은 형광 양자 수율 및 형광 수명의 증가로 이어집니다. 형광 분자 rotors 역할 수정된 소수성 BODIPY 염료의 형광 수명 이미징 (FLIM)는 이러한 프로브의 형광 수명 자신의 환경 microviscosity의 함수임을 보여줍니다. 6-8에게 용매 점도 수확량 대 형광 수명의 대수 음모를 포스터 호프만 방정식을 따르는 직선 9.이 음모는 점도에 형광 수명을 변환하는 보정 그래프로 제공합니다.
수정된 BODIPY 형광 분자 로터와 살아있는 세포의 부화 후, 작은 반점이있는 염료 배포는 형광 이미지에서 관찰된다. 회에서 얻어진 점도 값살아있는 세포에서 전자 puncta는 약 100 배 물이보다 높은과 세포 세포질의입니다. 6,7 시간 해결 형광 이방성 측정이 큰 microviscosity 가치와 계약에 회전 상관 시간을 얻을 수 있습니다. 형광 수명을 매핑하는 것은 형광 강도의 독립적이며, 따라서 프로브 농도와 점성 효과의 분리가 가능합니다.
요약에서 우리는 형광 분자 rotors의 FLIM을 바탕으로 세포의 microviscosity를 매핑하기위한 실용적이고 다양한 접근 방식을 개발했습니다.
FLIM 샘플 준비를위한 프로토콜 공촛점 또는 넓은 필드 강도 기반의 형광 현미경 분들 다를하지 않습니다. 데이터 수집은 즉 원시 데이터의 형광 수명을 추출, 데이터 분석의 주요 작업은 다음에 있습니다. 일단 이들이 취득되어, 데이터 해석은 가설을 확인하거나 위조하는 데 도움이됩니다.
1. 분자 rotors있는 염색법 세포
2. 세포의 형광 분자 rotors의 FLIM
그림 1. AC를 사용하여 시간 도메인 FLIM위한 실험적 조치onfocal 레이저 현미경 스캐닝.
3. 대표 결과
형광 자연 붕괴를 위해 측정메탄올 / 글리세린 섞어으로 점도를 증가시 형광 분자 로터는 그림에 표시됩니다. 2. 형광 붕괴는 monoexponential이며, 형광 수명은 점성 함수로 현저하게 다릅니다. 그것은 메탄올에 약 300 PS (점도 0.6 CP)에서 95 % 글리세롤 (점도 950 CP)의 3.4 NS로 증가합니다.
BODIPY-C 그림 2. 형광 붕괴 프로필 다양한 점도의 메탄올 / 글리세린 섞어 12 6.
형광 수명의 로그 보정 줄거리는 τ 대 형광 분자 로터에 대한 점성 η는 그림에 표시됩니다. 3. 포스터 호프만 방정식 9 일까지 요구대로 그것은 직선이다
K 0 radiativ입니다전자 일정한 속도, 그리고 Z와 x는 0
X 어디는 직선의 기울기이다.
그림 3. 포스터 - 호프만 방정식에 따라 BODIPY-C 12 수확량 직선에 대한 로그 형광 수명 대 로그 점도의 줄거리 6.
형광 분자 로터와 살아있는 세포의 배양에 이어 작은 반점이있는 염료 배포는 형광 이미지에서 관찰된다. meso - 치환 BODIPY 색소를 incubated HELA 세포의 FLIM 이미지는 그림에 표시됩니다. 4. 이미지의 각 픽셀의 형광 붕괴는 적절 하나의 지수 감쇠 모델을 이용하여 장착할 수 있습니다.
그림 4. () 형광 강도 및 BODIPY-C 12 물들일 HELA 세포 (B) FLIM 이미지. 밝고 중단 지역은 다른 지역보다 짧은 수명을 나타냅니다. 이 짧은 liftime는 포스터 - 호프만 방정식에 의하면, puncta의 낮은 점도, 아마도 지질 방울에 해당합니다.
모든 픽셀에서 추출한 수명을하려함으로써, 우리는 그림과 같이 전체 이미지의 형광 수명 히스토그램을 구하십시오. 5.
그림 5. meso - 치환 BODIPY 분자 rotors 물들일 HELA 세포의 FLIM 이미지에서 형광 수명의 Histograms.
FLIM는 강도 기반의 형광 이미징 이상의 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 그것이 형광단 농도 효과에서 그들을 분리할 수 있기 때문에 그것은 형광 강도 이미징에 의해 관찰하기 어렵거나 불가능 photophysical 이벤트에 대한 리포트를 작성할 수 있습니다. 이것은 이미징 형광 분자 rotors하여 세포내 점도를 매핑에 특히 유용합니다. 그림과 같이 형광 수명은 쉽게, 보정 그래프를 사용하여 점도로 변환할 수 있습니다. 3, 형광 분자 rotors의 농도가 독립.
FLIM의 데이터 해석을 복잡 수 유물이있을 수 있습니다. 10 경음악 유물은 형광 부패의 시작 부분 위에 피크로 표시되며 짧은 붕괴 시간과 혼동 수 있습니다 흩어진 빛, 또는 이후에 작은 피크를 포함 IRF는 어떤 현미경 내부 반사에 의해 발생할 수 있습니다. 이 흩어져 빛이 유물은 같은 확인할 수 있습니다그들이 스펙트럼 차별로 구분할 수 있기 때문에 - 그들은 흥미로운 빛이 같은 파장에 항상있다. 공중에, 라이트는 1 nanosecond에서 30 센티미터 여행 것을 외우는 건 반사의 출처를 정확히 파악할 수 있도록 도와줍니다.
필터 혹은 유리 형광은 또한 특히 낮은 샘플 형광에서 유물을 일으킬 수 있지만, 이것은 쉽게 샘플없이 측정을 복용하여 확인하실 수 있습니다 부패가 이런 상황에서 얻은 것입한다면, 그것은 악기에 의한이며 아무 상관이 없어 샘플로! 반면에, 샘플 autofluorescence 또한 형광 부패에 기여할 수 있습니다.
시간이 서로 관련 단일 광자의 계산에서는 (TCSPC), 타임 - 투 - 진폭 컨버터 (TAC)가 아닌 linearities는 가난한 면에서 발생할 수 있으나, 여기를 차단하고 샘플로 전송 광원의 예 : 주위 조명, 빛나는하여 확인할 수 있습니다 그리고 타이밍을 측정. 상수 배경이 있어야이미지의 각 픽셀에 취득. 일정한 배경에서 편차가 발생 지역은 잘 맞는가 나올 않을 것이며 그들이 TCSPC 카드에 대한 매개 변수를 조정하여 제거될 수 없다면 측정을 위해 피해야한다.
TCSPC의 한 악명높은 유물이 너무 높이 광자 검출 률에 의해 발생되는 더미 업 광자입니다. 11,12 이것은 전자가 바쁜시기이기 때문에 후속 광자를 무시하고 최초로 광자를 처리, 시간 초과되는 첫 번째 광자로 안내합니다. 형광 수명의 단축, 그리고 이것을 방지하는 최선의 방법으로 연쇄 충돌 리드는 레이저 반복 율이 1 % 정도의 광자 개수 율을 유지하는 것입니다.
시야
응용 프로그램에 따라이 FLIM의 다양한 구현이 있으며, 각각은 장점과 단점이 있습니다. 13 이상적인 형광 현미경 획득 것이 전체 다차원 형광 emissio가단일 광자 감도, 최대 공간 해상도 및 최소 획득 시간과 단일 측정의 강도, 위치, 평생, 파장과 편광의 N 곡선. 이 기능이 독특한 조합을 가진 기술은 현재는 없으며, 하나를 구축하는 계기 개발자를위한 도전 남아있다. 세포 생물학에서 중요한 문제에 대한 새로운 물리 기술의 응용 프로그램은 종종 예상치 못한 발견의 경로이며, 우리는 세포 생물학을위한 형광 이미징의 포화 기능을 가까이에 위치하기 전에 갈 길이가 있습니다. 실제로, 그러한 수명, 스펙트럼 및 편광뿐만 아니라 높은 공간적 해상도에서 3D로보다 빠르게 영상과 같은 이미징 형광 파라미터는, 세포 생물학의 새로운 측면을 나타내기 위해 특정 수 있습니다.
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
MKK은 영국의 공학 및 개인 반지 원정대 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) 생명 과학 인터페이스 프로그램을 감사드립니다. 우리는 또한 영국의 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC)에 의해 자금을 인정하고 싶습니다.
형광 분자 rotors과 샘플
하드웨어 :
거꾸로 Leica TCS SP2 공촛점 스캐닝 현미경
일관된 미라 900 티 : 베르디 V6 펌프 레이저 또는 하마 마츠 PLP-10 470 picosecond 펄스 다이오드 레이저 여기 소스와 사파이어의 femtosecond 레이저
베커 & Hickl SPC 3GHz의 830 보드, 펜티엄 IV, Windows XP와 1기가바이트 램 컴퓨터
냉각 베커 & Hickl PMC100-01 검출기 헤드는 하마 마츠 H5773P-01 현미경의 X1 포트에 장착된 photomultipliers, 또는 하이브리드 탐지기에 기초
DCC 100 탐지기 제어 모듈
소프트웨어 :
TRI-2 14 베커 & Hickl하여 SPCImage 2.8
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