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요약

인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

초록

전립선 - 특이 항원 (PSA)은 임상 사용에서 전립선 암을위한 진단 바이오 마커 메인이지만, 특히 낮은 투여 한 값에, 특이성 및 감도 부족하다. 'PSA를 사용하는 방법'중 하나 명확한 감별법이 암과 noncancer 2 사이 또는 환자 다음에하는 것을 허용하지 않습니다 2.5-10 NG / ㎖의 혈청 농도에 해당하는 회색 영역으로 진단을 위해, 현재의 문제가 남아있다 업 수술 후 PSA의 분석으로 운동 매개 변수는 실용적인 응용 프로그램 3,4 상당한 도전을 제기 할 수 있습니다. 또한, 비 암호화 RNA를 (ncRNAs)는, 질병 등의 새로운 마커를 제공 전립선 암 5,6의 예 PCA3 종양 생물학의 특성화되지 않은 부분을 공개 할 잠재력을 지닌, 인간의 암의 핵심 분자로 부상하고있다. 또한 2012 년에 발표 된 ENCODE 프로젝트의 데이터는 다른 RNA 유형이 세대의 약 62 %를 커버 것으로 나타났다오메. 또한 전사 조절 모티브의 양이 단백질 - 코딩 엑손에 대응 한보다 적어도 4.5 배 더 높은 것으로 보인다. 그것은 전염성 레트로 바이러스에서의 기본 기능이기 때문에 따라서, 인간의 내인성 레트로 바이러스 (에 HERVs)의 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸는), 추정 / 후보 전사 조절 서열의 넓은 범위를 구성한다. 인간 게놈 전체에 퍼져에 HERVs는 복사 - 붙여 넣기 전파 과정 다음에 인간 게놈의 8 %를 차지하는 가족 (엑손은 우리의 게놈의 2 %에 걸쳐 있습니다 다중 사본을 선도 세균 라인 내 조상의 독립 감염에서 시작 ). 일부 HERV 궤적은 여전히 암 ~ 10 등 여러 가지 병리와 관련 된 단백질을 표현한다. 우리는 최적 나은 그들이 ncRNA 전사 또는 m을 구동하는 경우가, 활성화 될 수 있는지를 이해하기 위해, 개별 HERV 궤적 식의 특성을 목표로, 어피 메트릭스 형태로, 고밀도 마이크로 어레이를 설계했다odulate 유전자 발현을 코딩. 이 도구는 전립선 암 필드 (그림 1)에 적용되었습니다.

서문

(도에 HERVs라고도 함) 인간의 내인성 레트로 바이러스는 우리의 게놈을 통해 확산됩니다. 그들은 복사 - 붙여 넣기 전파 프로세스에 의해 다음과 다수 체 가족에 이르는 세균 라인 내 조상의 독립 감염에서 유래. 오늘날, 그들은 더 이상 전염되지 않습니다하지만 그들은 인간 게놈의 8 %를 차지, 비교 지점으로, 엑손은 인간 게놈의 2 %에 걸쳐. 2012 년에 발표 된 ENCODE 프로젝트의 데이터는 다른 RNA의 종류가 intergenic 지역의 삼분 포함, 게놈의 약 62 %를 커버 것으로 나타났다. 또한, 전사 조절 모티프의 양이 단백질 - 코딩 엑손에 대응 한보다 적어도 4.5 배 더 높은 것으로 보인다. 그것은 전염성 레트로 바이러스에서의 일반적인 기능입니다로에 HERVs 긴 터미널 반복 (LTR)은 잠재적 인 전사 조절 인자의 넓은 범위를 나타냅니다. 역사적으로 떨어져 태반이나 고환으로 표현 몇 가지 유전자 좌에서, 그것은 일반적으로 HERV 인해 EP에 침묵 것으로 생각되었다igenetic 규제. 그러므로, 우리는 최적 나은 그들이 lncRNA 전사를 구동 또는 유전자 발현을 코딩 변조하는 경우가 활성화되어 있는지 여부를 이해하기 위해, 개별 HERV 궤적 식을 특성화 목표 Affymetrix의 형식으로, 고밀도 마이크로 어레이를 설계했다. HERV-V2 유전자 칩 불리는이 도구는 23,583 HERV의 probesets을 통합하고 5573 솔로 LTR에 의해 둘러싸 구성 별개의 HERV 요소뿐만 아니라 전체 및 부분 proviruses (그림 2)를 구별 할 수 있습니다.

진단, 평가 및 계획 :

전립선 암의 진단은 임상 실험에서 전립선 특이 항원 (PSA) 바이오 마커, 형태 전립선의 변경 및 병리학 자에 의해 관찰 마지막으로 전립선 생검을 평가하는 직장​​ 수지 검사의 용량을 기반으로합니다. 전립선 암에 대한 PSA와 같은 기존의 암 바이오 마커 사이에 충분한 민감도와 특이도의 부족은 널리 AF를 인정 받고 있습니다임상 적 의미의 터 수십 년 1. 처음에, PSA는 전립선의 11 선암의 진단과 치료를 위해 제안되었다. 그것은 암 검사를 위해 제안하고 질병 (12)의 발전을 모니터 후자이었다. 그러나, 정기적으로 요구되는 질문은 남아있다 :​​ 'PSA를 사용하는 방법'. (II) 두 개의 큰 코호트 연구는 유럽에서 수십만 명의 사람들을 등록하고, (I) 2.5-10 NG의 혈청 농도에 해당하는 회색 영역 / ㎖는 분명 차이가 암과 noncancer 2 사이에하는 것을 허용하지 않습니다 , 이론 심플, 같은 PSA 통관, PSA 속도와 시간을 두 배로으로 수술 후 PSA 운동 매개 변수 (III) 분석, 미국 질병 별 사망률 (13, 14)의 측면에서 검사의 유용성에 대한 명확한 결론에 도달하는 데 실패 실용적인 응용 프로그램의 3,4에 상당한 도전을 제기 할 수 있습니다. 우리는 바이오 마커 응용 프로그램에게, 앞으로 것을 예상 할 수 있습니다lications은 감시 대기보다 또는 종양의 표현형에 따라 덜 공격적 치료 사이의 임상 적 선택을 지원합니다. 병리학 자에 의해 렌더링 진단에 관한 제 제한 요인은 (많은 암이 샘플링에 의해 놓친) 전립선 생검 내에서 20 %의 위음성 진단에서 비롯됩니다. 두 번째 문제는 악영향을 제시 할 수있다 음 하나, 다음과 같은 추가적인 조직 검사 절차의 필요성 다룬다.

과격한 전립선은 현재 전립선 암의 표준 치료의 하나입니다. 이는, (10 글리슨 7), 특히 적극적인 패턴의 경우, 45-65년 노화, 건강한 환자에서 종양 병소 또는 명백한 종양을 제안한다. 그것은 지금 로봇 보조 수술을 사용하여 우리 부서에서 수행됩니다. 때문에 분자 마커는 향후 몇 년 동안 가장 중요있을 것이라는 점을 성장의 증거, 우리는 우리의 모든 환자에게 전립선을위한 프로그램에 참여의 가능성을 제안하기로 결정조직 은행. 더 정확하게, 전립선 암의 확대 분자 연구 프로그램은 전립선 절제 표본에서 높은 품질의 신선한 종양 조직에 대한 액세스에 대한 요구 증가로 이어질. 이 연구는, 특히 게놈 접근 방식은 높은 DNA / RNA 품질의 큰 샘플을 요구했다. 종 양성과 같은 환자에서 인접 '비 종양의'조직이 필요합니다. 급진적 prostatectomies을 처리하고 처리하기위한 권장 사항은 무대와 마진 상태함으로써 잠재적 인 추가 치료 및 예후를 결정하는 병리학 적 기능을 유지하도록 설계되어 있습니다. 어떤 신선한 조직 표본 추출 방법은, 따라서 진단에 수용 할 수 있도록 후속 병리학 적 평가에 손상을주지해야한다. 전립선의 거시적 해부 어렵고 큰 관심 마진 조직과 캡슐의 침략에 지불해야합니다 : 전립선 은행에 대한 해부는 항상 동의에 따라 훈련 uropathologist에 의해 수행되어야한다D 프로토콜입니다. 의료 교수진과 국가 의료 보드의 윤리위원회는 이러한 조사에 동의하고 모든 환자가 전립선 조직 은행에 포함에 대한 동의를 얻었다 알렸다.

프로토콜

1. 외과

병리학 담당하고 촬영까지 한 번 외과 의사에 의해 제거, 얼음에 전립선을 유지합니다.

2. 전립선 조직의 취급

  1. 수술 국소 빈혈의 지연을 존중하기 위해, 수술 절제 후 30 분 이내에 헌신적 인 직원에 의해 실험실에 얼음에 과격한 전립선 절제 표본을 전송할 수 있습니다. 동결의 지연 미만 20 ~ 30 분 (그림 3A)해야한다.
  2. 무게와 일반적인 프로토콜 (왼쪽 블랙 오른쪽에 예를 들어, 녹색,도 3B 및 3C 참조)에 따라 전립선 얼룩.
  3. 후방 측 (그림 3D)에 선 (腺)의 큰 가로 섹션을 수행합니다. 전립선의 방향과 전방 측에 넣어. 멸균 된 수술 용 칼과 후방 측에 동맥의 큰 횡단면을 수행한다.
  4. 전환 영역에서 조직의 조각을 해부,(그림 3E) 그대로 여백을두고 왼쪽과 오른쪽 주변 지역에.
  5. 에펜 도르프 튜브에 조직의 코어를 넣어 액체 질소 (그림 3 층)에서 동결 및 저장 스냅. 당신이 결정하지 않는 경우 바이오 뱅크 단계 2.7로 직접 진행합니다.
  6. 조직 검사에서 암의 전체 길이 10 mm의 우수한 경우에만 전립선 은행 업무를 수행합니다. 전립선을 닫고 선 왜곡과 수술 이익률 (그림 3G)의 최소한의 중단을 방지하기 위해 봉합 실을 사용합니다. 그런 다음 조직 학적 분석을위한 일반적인 절차에 따라 파라핀에 포르말린 및 embed와 과격한 전립선 절제 표본을 고정합니다.
  7. 수직의 OCT 작은 마운드에 냉동 조직 코어를 탑재하고 저온 ​​유지 장치의 섹션을 확인합니다. 첫 싱글 5 μm의 동결 절편을 가지고 블루 톨루이딘으로 얼룩.
  8. 조직의 특성을 분석하는 퀵 조직 학적 검사를 수행 (즉. 양성 또는 악성). 종양의에 대한조직, 종양의 세포의 양을 추정하고 종양의 세포의 80 % 이상 만 코어를 선택합니다.
  9. 이 후, 새로운 단일 5 μm의 동결 절편을 수행하고 헤 마톡 실린, 에오신과 사프란으로 얼룩. 그런 다음, X 30 μm의 15 부분을 잘라의 RNase 무료 에펜 도르프 튜브에 넣습니다.
  10. 헤 마톡 실린, 에오신과 사프란을 위해 지난 5 μm의 동결 절편을 가지고 프로 시저의 끝에서 종양의 세포의 양을 제어 할 얼룩.
  11. 드라이 아이스의 에펜 도르프 튜브를 넣고 분자 생물학 실험실에 샘플을 보내드립니다.

3. RNA 추출, 정제 및 품질 관리

  1. 균질화. 조직이 완전히 용액에 용해 될 때까지 Trizol/100 MG 티슈 1 ㎖의 존재하에 균질화를 수행한다. 점차적으로 트리 졸 솔루션을 추가하고 소형 분쇄기를 사용하여 얼음에 치료를 진행합니다. 일단 균질화, 에펜 도르프 튜브에 대한 해결책을 나누어지는 및 동안 실내 온도에서 트리 졸에 남겨오분.
  2. 상 분리. 300 ㎕의 클로로포름 (150 μL의 BCP/1.5 ML 트리 졸)를 추가합니다. 소용돌이 15 초 후 2 ~ 3 분 동안 실온에 둡니다. 2-8 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기
  3. RNA 침전. 새로운 튜브에 조심스럽게 상단 수성 단계를 전송합니다. 750 ㎕의 이소프로판올을 추가합니다. 10 분 (반전에 의해 선동)을 실온에서 품어. C. ° C/-31 ° -19에서 2 시간을 품어 2-8 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 샘플
  4. RNA 세척 및 서스펜션. 원심 분리 후, 상층 액을 제거합니다. 세척 RNA는 1 ㎖의 80 % EtOH로 (부드럽게 튜브 역)와 펠렛. 2-8 ℃에서 10 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기 샘플 P1000 및 P10을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 2 ~ 3 분 동안 건조한 공기에 EtOH로 남아 있습니다. 70 ° C 열 블록에 100 ㎕의 RNase가없는 물, 전송 관을 추가하고 펠렛을 용해 2 ~ 3 분 동안 앉아 보자. 그런 다음 얼음에 넣어. 에서 -19 ° C/-31 ° C에 대한 단기간의 저장 및 -장기 저장을 위해 80 ° C에서.
  5. RNA 정화. RNeasy 미니 키트 (Qiagen 사)를 사용하여 RNA를 정화. 간단히, 100 μL의 RNA 시료 350 μL 버퍼 RLT를 추가하여 시작하고 잘 혼합 한 후 키아의 절차를 따르십시오. 마지막으로, 품질 관리 (단계 3.6)에 대한 (50 μL)의 개 정제 된 제품의 나누어지는 3 μl를 가지고. 에 보관 RNA -19 ° C/-31 ° C 짧은 기간 동안 또는 장기 저장을 위해 -80 ° C에서.
  6. RNA QC (그림 4A). 제조업체의 지침에 따라, RNA의 품질과 Bioanalyzer (애질런트)와 Nanodrop (열)를 사용하여 RNA의 무결성을 확인합니다. RNA 무결성 번호 (RIN)은 RNA의 품질을 평가하는 데 사용된다. 특히, 18S와 28S 피크의 검출에 성공 강하게 추가 단계에서 샘플을 사용하는 것이 좋습니다.

4. WT-박수 RNA 증폭

WT-OV를 사용하여 증폭 단계를 수행하는 추천최적의 조건에서 ATION 증폭 키트 :

  • 피펫 정밀도를 보장하기 위해 한 번에 더 적은 여덟 증폭 샘플을 실행합니다. 8 반응의 3 배치로 키트의 분할을 필요로 마스터 믹스를 준비 할 때 다음, 1 폐기물 부피를 차지한다.
  • 특별한 지시가없는 한 항상 얼음에 고정 해제 시약과 반응 튜브를 유지.
  • 정화 만 신선한 80 % 에탄올 용액을 사용합니다.
  • 프로토콜의 모든 단계에서 중지하지 마십시오.

  1. 25 NG / μL의 농도를 얻기 위해 총 RNA를 희석. 희석 된 시료의 2 μl를 처리합니다.
  2. 준비 폴리 1:25,000 희석을 달성하기 위해 폴리-A 제어 희석 버퍼 (어피 메트릭스)와 폴리 RNA 주식의 일련의 희석에 의해 RNA 제어 스파이크의 솔루션을 제공합니다.에게

    1 단계 : 4.3 우선 물가의 cDNA 합성 - 4.8. 다음과 같이 언급 된 시약 공급 업체라고합니다 : A1 (제 스트랜드 프라이머 믹스), A2 (인터넷첫 스트랜드 버퍼 믹스), A3 (우선 물가 효소 믹스).

  3. 실온에서 A1 및 A2를 해동. 2 초 동안 2 초 스핀의 소용돌이 믹서를 사용하여 혼합. 그런 다음, 신속하게 얼음에 배치합니다. 얼음에 A3를 놓습니다.
  4. 0.2 ML PCR 튜브에 총 RNA (50 NG)의 2 μl를 넣고 A1의 2 μL (최종 부피 : 4 μL)를 추가합니다. 모자 2 초 동안 튜브를 스핀.
  5. 5 분 동안 65 ° C에서 부화 한 후 얼음에 튜브를 배치합니다.
  6. (하나의 반응에 주어진) 다음과 같이 첫 번째 가닥의 cDNA 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 간단히 스핀 다운. 즉시 얼음에 배치합니다.
    시약 음량
    먼저 스트랜드 버퍼 믹스 (A2) 5 μL
    폴리 RNA 제어 (1:25,000) 0.5 ㎕의
    우선 물가 효소 믹스 (A3) 0.5 ㎕의
  7. 추가 6 & #181, RNA / 프라이머 함유 튜브 마스터 믹스 L. 2 초 동안 튜브, 스핀을 쓸어 넘겨 혼합 빠르게 얼음 (최종 부피 10 μL)에 배치합니다.
  8. 15 분 후 1 다음 10 분 후 분, 25 ° C, 10 분 동안 42 ° C와 70 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 열 자전거 타는 사람에서 반응 관을 제거 간단히 회전과 얼음 계속. 두 번째 가닥의 cDNA 합성 단계로 바로 진행합니다.

    2 단계 : 4.8 초 물가의 cDNA 합성 - 4.12. B1 (둘째 스트랜드 버퍼 믹스)과 B2 (제 스트랜드 효소 믹스)를 다음과 같이 언급 된 시약 공급 업체라고합니다.

  9. 2 초 B2 및 B3 스핀 다운 빠르게 얼음에 배치합니다. 실온에서 B1을 해동. 2 초 동안 소용돌이 믹서를 사용하여 혼합, 빠르게 2 초 동안 스핀과 얼음에 배치합니다.
  10. (하나의 반응에 주어진)는 다음과 같이 두 번째 스트랜드 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 브리 스핀 다운비행. 즉시 얼음에 배치합니다.
    시약 음량
    둘째 스트랜드 버퍼 믹스 (B1) 9.75 μL
    두 번째로 물가 효소 믹스 (B2) 0.25 μL
  11. 각각의 첫 번째 스트랜드 반응 튜브에 마스터 믹스의 10 μl를 추가합니다. 배, 얼음 (: 20 μl의 최종 볼륨)에 2 초와 장소에 스핀을 피펫으로 섞는다.
  12. 5 분 후, 1 ~ 30 분 후, 10 분 후 분, 25 ° C, 50 ° C, 70 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 열 자전거 타는 사람에서 반응 관을 제거 간단히 회전과 얼음 계속. 후 두 번째로 물가 향상 단계로 바로 진행합니다.

    3 단계 : 4.13에서 후 두 번째로 물가 향상 - 4.15. 다음과 같이 언급 된 시약은 공급 업체에 의해 참조됩니다 B1 (둘째 스트랜드 버퍼 믹스), B3 (반응 향상 효소 믹스).

  13. (하나의 반응에 주어진) 다음과 같이 B1과 B3 믹스를 조합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 간단히 스핀 다운. 즉시 얼음에 배치합니다.
    시약 음량
    둘째 스트랜드 버퍼 믹스 (B1) 1.9 ㎕의
    반응 향상 효소 믹스 (B3) 0.1 ㎕의
  14. 각 두 번째 스트랜드 반응 튜브에 마스터 믹스 2 μl를 추가합니다. 배, 얼음 (: 22 μl의 최종 볼륨)에 2 초와 장소에 스핀을 피펫으로 섞는다.
  15. 20 분 후, 1 ~ 15 분 후 분, 37 ° C, 80 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 간단히 회전 및 얼음에 배치, 열 자전거 타는 사람에서 반응 관을 제거합니다. SPIA 증폭 단계로 바로 진행합니다.

    4 단계 : 4.16에서 SPIA 절차에 의해 단일 가닥의 cDNA (sscDNA)의 합성 -4.19. C1 (SPIA 프라이머 믹스), C2 (SPIA 버퍼 믹스), C3 (SPIA 효소 믹스)를 다음과 같이 언급 된 시약 공급 업체라고합니다.

  16. 실온에서 C1 및 C2를 해동. 2 초 동안 소용돌이 믹서, 스핀을 사용하여 신속하게 얼음에 배치하여 혼합. 얼음에 C3를 해동. 부드럽게 배를 반전 내용을 섞는다. 공기 방울을 도입하지 않도록하십시오. 그런 다음, 얼음에 2 초와 장소를 회전.
  17. 다음과 같이 0.5 폐기물의 부피를 차지 SPIA 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 간단히 스핀 다운. 즉시 얼음에 배치합니다.
    시약 음량
    SPIA-버퍼 믹스 (C2) 5 μL
    SPIA 입문서 믹스 (C1) 5 μL
    SPIA 효소 믹스 (C3) 10 μL
  18. 강화 된 두 번째 스트랜드 반응 t에 SPIA 마스터 믹스 20 μl를 추가합니다우베. 6 배속, 스핀을 피펫 팅 빠르게 얼음에 (: 42 μl의 최종 볼륨)을 배치하여 혼합.
  19. 5 분 후, 1 분 후, 60 분 동안 47 ° C와 95 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 열 자전거 타는 사람에서 튜브를 제거 짧게 스핀 얼음에 배치합니다.

5. sscDNA 정화 및 품질 관리

  1. sscDNA 정화. QIAquik PCR 정제 키트 (Qiagen 사)를 사용 sscDNA 정화. 간단히, 증폭 된 cDNA 제품의 42 μL에 200 μL 버퍼 PB를 추가하여 시작 혼합 열의 부하. 그런 다음 키아의 절차를 따르십시오. 마지막으로, 품질 관리 (단계 5.2)에 대한 (30 μL)의 개 sscDNA 정제 제품의 나누어지는 3 μl를 가지고.
  2. (도 4B)을 수득하고 크기 분포 검증 sscDNA. 제조업체의 지침에 따라, sscDNA 수율과 Bioanalyzer과 Nanodrop를 사용하여 크기 분포를 확인합니다. 증폭 된 cDNA의 분포의 크기는 ㄱ해야전자 일반적으로 600 기지 주변 피크 긴 100 1,500 기지 사이를 포함.

6. sscDNA 분열

  1. 핵산 분해 효소가없는 물과 볼륨 조정, 30 μL의 cDNA를 2 μg을 준비합니다.
  2. 10 배 OPA 버퍼 PLUS 솔루션에서 시작하여, 1X 한 포르 - 모든 버퍼 PLUS (OPA)를 준비합니다.
  3. 0.2 U / ㎕의 DNA 분해 효소를 준비 I (1 U / μL DNA 분해 효소 I의 5 배 희석).
  4. 다음과 같이 분열 마스터 믹스를 준비합니다 (하나의 반응에 주어진)
    시약 음량
    10X 한 포르 - 모든 버퍼 PLUS 3.6 ㎕의
    DNA 분해 효소 I (0.2 U / μL) 3 μL
  5. sscDNA의 30 μL로 분할 믹스의 6.6 μl를 추가합니다.
  6. 스핀 후 10 분 동안 95 ° C에서 DNA 분해 효소 I을 비활성화하고 얼음에 보관, 10 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 나누어지는 1 &# 181; 애질런트 기반 크기 분포 검증을위한 조각의 cDNA L.
  7. sscDNA 크기 분포 확인 (그림 4C). Bioanalyzer (애질런트)를 사용하여 sscDNA 크기 분포를 확인합니다. 단편화 된 cDNA의 크기 분포는 전형적으로 57과 200 사이의 염기로 구성되어야한다.

7. 파편이 sscDNA의 라벨링

  1. DEPC 물에 5 mm로 DLR-1A 7.5 밀리미터를 희석.
  2. 다음과 같이 레이블 마스터 믹스 (하나의 반응에 주어진)를 준비 :
    시약 음량
    배 TDT 반응 버퍼 14 μL
    의 CoCl2 (25 ㎜) 14 μL
    DLR-1A (5 ㎜) 1 μL
    터미널 트랜스퍼 (400 U / μL) 4.4 ㎕의
  3. 라벨 믹스의 33.4 μl를 추가각 조각의 cDNA 샘플.
  4. 튜브를 가볍게 치면 혼합 짧게 회전, 60 분 동안 37 ° C에서 배양 한 후 얼음에 보관하십시오.

8. HERV 칩 마이크로 어레이에 하이브리드

  1. 예비 혼성화 믹스 (어피 메트릭스) 200 μL와 HERV의 유전자 칩을 Prewet 10 분, 50 ° C, 60 rpm에서 배양한다.
  2. (하나의 반응에 주어진) 다음과 같이 하이브리드 믹스를 준비합니다
    시약 음량
    제어 올리고 B2 (3 ㎚) 3.3 ㎕의
    20 배 진핵 하이브리드 제어 10 μL
    배 하이브리드 믹스 100 μL
    99.9 %의 DMSO 17.7 μL
  3. 최종 할머니를 만들기 위해 실온에서 조각과 표지 된 cDNA의 69 μL에 하이브리드 믹스 131 μl를 추가합니다200 μL의 륨.
  4. 혼합하고 95 ° C에서 2 분간 변성 후 5 분간 최대 속도에서 5 분 원심 분리기 50 ° C에서 알을 품다.
  5. prewetted HERV의 유전자 칩을 비우고 200 ㎕의 목표 준비를로드합니다. 두 개의 격벽에 거친 반점을 적용합니다.
  6. 18 시간 동안 50 ° C, 60 rpm에서 하이브리드.
  7. 18 시간 후, HERV의 유전자 칩을 비우고 4 ℃에서 수집 된 하이브리드 솔루션을 저장 칩은 즉시 4 ° C.에 저장된 유체 상으로 실행되지 않는 경우 250 μL 세척 버퍼 A.와 프로브 배열 채우기

9. 세탁과 염색

  1. GCOS 메뉴 바에서 유체를 실행합니다. 유체 대화 상자에서 원하는 역 선택 - (1 - 4), 모든 모듈에 대한 Shutdown_450을 선택하고 실행합니다. 밀리 Q 물에 3 유체의 흡입 라인을 담근다. LCD 화면의 지시 사항을 따르십시오.
  2. 모든 모듈에 Prime_450 프로그램을 적용합니다. 세척 버퍼에 대한 튜브를 배치200 ㎖의 세척 버퍼 B를 포함하는 병에 400 ㎖의 세척 버퍼를 포함하는 병, 워시 버퍼 B에 대한 하나의 다시, LCD 화면의 지시 사항을 따르십시오.
  3. 바늘을 들어 올려 600 ㎕의 얼룩 칵테일 1 (SAPE 솔루션 믹스) 600 ㎕의 얼룩 칵테일을 배치 2 (항체 솔루션 믹스) 위치 # 1과 # 2의 마이크로 원심 튜브를 함유하고, 800 ㎕의 배열 위치 # 3에 완충 용액을 들고 .
  4. 화면의 지시에 따라, FS450-004 프로토콜을 선택하고 각 모듈을 실행, 각 모듈에 대한 권리 칩을 할당합니다.

10. 스캐닝

  1. GS3000 스캐너 워밍업. 그것은 빛이 켜졌을 때 스캔 할 준비가되어 있습니다.
  2. 누출 방지하기 위해 격벽에 거친 반점을 적용 한 후 스캐너에 직접 선택적으로 자동 로더에 칩을 놓습니다. 스캔을 시작합니다.
  3. 칩을 스캔 한 후. CEL 파일이 생성됩니다. <이미지를 확인하고 프로브 세포를 (확인하는 자리에 그리드를 정렬강한> 숫자 4D-F).

11. 데이터 분석

  1. 품질 관리. 표준 Affymetrix의 참조는 HERV-V2 칩 QC 기준을 충족하는지 확인하기 위해 제어합니다. 이를 위해 다음과 같은 표현이 사용될 수있다 : 강도 중앙값 대 로그 강도 값 분포 (농도 플롯 및 박스 플롯), 중앙값 절대 편차 (MAD) (MAD-메드) 플롯, 배경 플롯 정규화 비 눈금 표준 오차 (n 스위치) 플롯과 상대 로그 식 (RLE) 플롯.
  2. 정규화. 또한, 데이터 집합 예기치 않은 배치 효과를 강조하고 통계 분석을하기 전에를 해결하기 위해 탐구해야한다. 데이터 전처리 따라서 배경 보정 (예. 트립토판 프로브 기준 신호에 따라), RMA 정상화 및 요약 (15) 다음을 포함한다.
  3. 데이터 마이닝 및 차등 발현 유전자에 대한 검색. 칩을 정상화하고 계층 clusteri을 적용데이터 집합 (그림 6A)을 탐구하는 NG 방법. 그런 다음, 마이크로 어레이의 고전적인 의미 분석 (SAM) 거짓 발견 속도 (FDR) 수정 (17)에 의해 다음 절차 (16)를 사용하여 차등 발현 유전자 (DEG)에 대한 검색을 수행합니다. 이 단계가 완전히 PARTEK GS와 같은 일부 소프트웨어 분석 제품군에 통합되어 있지만, 대안 Bioconductor 프로젝트 19 패키지와 R 통계 소프트웨어 (18)를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 통계 분석을 한 후, 표현의 값이 2 이하 6 않은, probesets을 제외 할 데이터 집합을 필터링 할 수 있습니다.
  4. 시각화 및 해석. 주석 데이터베이스를 이용하여 전용 인터페이스 HERV-V2 마이크로 어레이의 결과를 해석한다.

결과

transcriptomic 연구 값은 생물학적 출발 물질의 품질에 주로있다. RNA 추출이 최적의 조건에서 수행되는 경우, RNA 무결성 번호 (RIN)은 일반적으로 7 이상 (그림 4A)입니다. 어피 메트릭스 HERV-V2 칩의 cDNA 2 μg을 혼성화 할 필요성은 증폭 과정의 사용을 의미한다. 성공적인 증폭 단계는 종 모양의 분포 (그림 4B)로 연결됩니다. 이어서, DNAse1 단편화는 약 100 뉴클레오타이드 혼성화 (도 4C)의 앞에 cDNA의 크기 분포를 균일화하기 위해 수행된다. 하이브리드 및 스캔 (그림 4D) 한 후, 이미지의 육안 검사 그리드가 아니라 반점 (그림 4E)에 정렬되어 있는지 확인하는 하나의 수 및 하이브리드 컨트롤이 일치하는 경우 (그림 4 층). 이 단계는 마이크로 어레이를 제외하기 위해 유용하는 공기 기포 나 오류 실험하는 동안 오류가 발생했습니다.

칩은 QC (그림 5)를 통과하고 정상화, 리옹 쉬 병원에서 5 경기 페어 종양과 정상 전립선 RNA 샘플의 통계 분석은 차등 발현 값으로 207 HERV의 probesets의 식별 (p.val을 주도하면 <0.05) (그림 6A). 이 기록을 지원하기 위해 전립선 관련 정보를 얻기 위해, 35 추가 일치 쌍 샘플 (결장, 난소, 고환, 유방, 폐, 전립선)은 결국 확인 된 분석 및 SAM-FDR 절차 (FDR은 = 20 %)에 추가 된 44 전립선 특이 HERV의 probesets. 그 중 가장 중요한 10 HERV 구조는 (그림 6B)에 설명되어 있습니다. 또한 임상 연구는 이러한 후보 생체의 감도 및 특이성의 값을 평가하기 위해 요구 될 것이다.

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. 병원에서 전반적인 절차의 그림 1 제도 후보 바이오 마커의 식별을 선도 : (샘플 준비, 목표 준비, 마이크로 어레이 처리 2-6) 벤치 (1 임상 및 병리학 자에 의해 조직 준비하여 전립선) (7 : HERV의 마이크로 어레이의 biocomputing 분석). 정상 조직에서 파생 된 핵산이 주황색으로 묘사되며, 종양의 지역에서 파생 된 핵산 (오렌지) 및 종양 특정 (블랙) 핵산 정상의 혼합으로 구성되어 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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. 그림 2 개념과 HERV-V2 칩의 내용 : HERV 시퀀스인간 게놈에서 검색 HERV-gDB3라는 데이터베이스에 저장되어, 다음 25 메르 후보 프로브는 결과 목표 하위 영역이 각각 그려져있다 (결국 배열에 합성되기 전에 전용 하이브리드 모델링 절차 (EDA +)를 통과 가족). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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병리학 자에 의해도 3. 전립선 취급. (A) 신선한 과격한 전립선 시험편은 실험실로 전달된다. (BC) 전립선은 (왼쪽에 검은 색 오른쪽에 녹색) 스테인드된다. (D) 후방 측의 선 (腺)의 큰 횡단면. (E) 그대로, 조각 복장 여백을 남겨조직의 에스는 전립선의 다른 지역에서 해부된다. 조직의 (F) 코어는 에펜 도르프 튜브에 배치됩니다. (G) 봉합 실이 전립선을 닫고 선 왜곡과 수술 여백의 최소한의 중단을 방지하기 위해 사용됩니다. 그 후, 과격한 전립선 절제 표본은 조직 학적 분석을위한 일반적인 절차에 따라 포르말린에 고정하기위한 준비가되어 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

figure-results-2768
핵산 준비와 혼성화 효율의 그림 4. 품질 관리. (A) RNA 무결성, (B)의 cDNA 표적과 혼성화 단계에서 사용되는 (C) 단편화 표적 증폭. 일세 가지 품질 관리가 RNA 나노 칩과 진핵 생물 나노 세리에 II의 분석을 사용하여 Bioanalyzer로 얻을 수 있었다 이거지. (D) 스캔 후 HERV-V2 마이크로 어레이 하이브리드 영역, (E) 왼쪽 상단에 보여주는 그리드 정렬 컨트롤의 확대 및 하이브리드 컨트롤을 탐지 보여주는 중심 영역의 (F) 확대의 전체 이미지. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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신호의 그림 5. 처리. (A) 어피 메트릭스 폴리 A는 스파이크의 증폭을 제어합니다. 폴리 A는 B에서 튐,의 Thr, 반페 및리스 성적을 제어 서브 틸리 유전자가 RNA 샘플에서 아군의 전반적인 성공을 평가하는 역할을하는 타겟의 준비 단계. 강도는 더 바이어스가 높은 저 발현 유전자의 WT-박수 증폭 동안 없었다 보장하기 위해 이러한 스파이크의 컨트롤 사이의 값을 감소에서 검출되어야한다. (B) Affymetrix의 스파이크에 하이브리드 제어합니다. E.에서 고립이 목표 대장균 및 P1 박테리오파지는 라벨 절차 전에 아군됩니다. BioB, BioC, BIOD과 크레에서 증가 값은 하이브리드의 전반적인 성공을 나타냅니다. RMA 정상화 후 칩 신호 (C) 강도 분포. 하위 2 6 (배경)보다 값 probesets 전시 신호의 대부분은 주로 어떤 특정 HERV의 궤적에 제한 전체 식을 나타낸다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 6. 데이터 분석. 정상 및 종양의 샘플 (A) 계층 적 클러스터링 분석. 아래 정상 및 종양의 샘플들 (블루) 레귤레이션 - 파티션 클러스터링은 유클리드 거리 함수 알고리즘을 사용하여 (빨강)까지로 probesets 그룹핑 정규화 발현 값을 적용 하였다. 전립선 암의 후보 바이오 마커로 확인 상위 10 HERV 구조 (B) 선택. 각 HERV 요소에 대해, 관련 HERV 제품군은, 게놈 좌표 (NCBI 36/hg18)과 HERV 구조에 대한 간략한 설명이 제공됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 7. HERV의 레퍼토리. (A) 인간 게놈의 시퀀싱 25,000 단백질 코딩 유전자 (엑손, 2 %) 20 만 긴 터미널 반복 (LTR) retrotransposons (HERV, 8 %) 등의 transposable 요소의 엄청난 금액을 공개했다. HERV-V2 칩의 내용에서 (B) 외삽 및 관련 발현 데이터 (종양의 조직 유형에 비해 보통 8에서 발생하는 79 샘플)는 HERV 레퍼토리의 3 분의 1이 전사적으로 활성화하는 것이 좋습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 8. 칩에서 신호의 기능 해석. (A) 발기인 식별하고 성적인 제어 : U3 부정적인 신호 (적색 프로브, 5'LTR) R-U5 긍정적 인 신호 대 (파란색 프로브, 5'LTR)는 다른 소비재 메틸화 (검은 색 원) 종양의 조직 대 peritumoral 정상에 U3의 내용에 의해 지원 U3 기반의 전사를, 제안한다. (B) 접합 전략 : mRNA의 종양에 독점적으로 표현 인코딩 추정 3.1 KB 봉투는 프로브를 중복 SD1/SA2 스플 라이스 접합을 사용하여 식별됩니다. * 기타 비 태반 조직과 비교하여 추론. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

지난 10 년 동안, HERV 발현 측정을위한 시도의 대부분은 RT-PCR 기법을 사용한 하나 HERV 장군 (25), (26) 내에서 일반적인 경향을 평가하는 폴 유전자의 상대 보전에 따라 특정 궤적 20-24 또는에 초점을 . 또한 HERV 패밀리 27,28의 발현을 검출하고 정량화하기위한 저밀도 마이크로 어레이와 결합 매우 퇴화 프라이머를 사용한 PCR의 증폭. 패밀리 내의 개별 궤적의 발현을 추적하기 위해, 클로닝 및 염기 서열과 결합 보존 영역의 PCR 증폭을 기반 접근법에 HML-2 29,30 또는 HERV E4.1-31 패밀리의 전사적으로 활성 고유 요소를 사용할 식별. 또한 복제 및 시퀀싱 단계로 끝나는, 활성 HML-2 특정 인간의 고독한 LTR에 의해 둘러싸 확인 반복 사이에 발기인을 파악하는 것을 목표로 게놈 반복 식 모니터링 기술 (32, 33). 우리는 연속적 가족 34,35 paralogous 내의 요소들 간의 상호 반응을 최소화하기 위해 반복 요소 프로브 설계를위한 적당한 방법론을 도입 HERV의 전 사체의 분석에 전용 고밀도 마이크로 어레이의 두 세대를 개발했다. HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2와 HERV-K HML-5 가족의 2,690 별개의 proviruses 및 2,883 솔로 LTR에 의해 둘러싸 대상으로 HERV-V2 칩은 발표 추정 전립선 암 바이오 마커의 식별 정보를 이용하여 본 논문에서 설명 조직 (35)의 넓은 범위에서 1,718 HERV의 궤적 (도 7a 및 B)의 식입니다. 또, 관련 궤적상의 여러 probesets의 사용은 그것의 전사 조절에 대해 유익하다. 첫째, U5 긍정적와 함께 U3 부정적인 신호가 발기인으로 LTR을 분류하고, 반대로 U3 긍정적 U5 부정적인 신호는 폴리아 데 닐화 역할을 반영 할 수있다. 우리는 그래서 난배열에 의해 제공이 U3-U5 이분법 정보를 기반으로 조직 (35)의 넓은 범위에서 326 프로모터 LTR에 의해 둘러싸 dentified, 우리가 제안하고 실험적으로 이러한 자율적 인 전사가 메틸화 따라 후생 유전 학적 과정 34 (그림에 의해 제어 된 몇 가지 선택된 경우에 확인 8). 태반이나 종양의 고환 34 ERVWE1/Syncytin1 발현 프로파일에 의해 그림과 같이 두 번째로, 예를 들어, LTR에서 신호의 검출, 개그와 ENV 독립 probesets 또는 특정 스플 라이스 접합을 대상으로 프로브에서 발행는 프로 바이러스 접합 전략에 대한 정보를합니다. 이 HERV 특정 프로브 선택의 과정은 (그림 8)로 효율적으로 기존의 유전자를 36으로, 조직 관련 접합 전략의 식별을 지원하기에 충분한 강력한 있음을 나타냅니다.

이 방법은 개별적 HERV 궤적 표현식을 식별하는 첫번째 시도어피 메트릭스 기술을 기반으로 정의 고밀도 마이크로 어레이를 사용. 마이크로 어레이 형식의 명확하게 식별의 장점은 (I)로 구성된 HERV의 사체를 해독하는 여러 HERV 가족의 조정 탐사 및 각 현장에 대한 다른 지역의 (II)를 동시에 독립적 인 분석, 예. 솔로 프로 바이러스 LTR에 의해 둘러싸, 개그 또는 ENV 지역 및 사전 HERV 요소의 기능에없는 프로 바이러스 구조와 관련된 가능한 접합 접합에 대한 U3 및 U5 도메인. 전망은 마이크로 어레이 관련 biocomputing 도구에서 주석의 개선에 의존한다. 이것은 하나의 예 입증 활동에 HERVs이 lncRNA 전사를 운전하거나 더 많거나 적은 근위 코딩 유전자 발현을 조절 여부와 같은 생물 학적 가설에 칩의 신호를 변환 할 수 있도록해야합니다. 사실, 이러한 가정은 V의 구성 요소를 포함하는 전립선 암 관련 ncRNA 성적 증명서를 확인 최근의 연구에 의해 지원됩니다HERV-K 내인성 레트로 바이러스의 가족이나 일부 바이러스 LTR 프로모터 영역 (37)의뿐만 아니라, 두 개의 유전자가 융합 이벤트 즉 HERV-K22q11-ETV1과 HERV-K17-ETV (38, 39)에서 iral의 ORF. 이와 함께, LTR 기능과 접합 전략 식별과 결합이 전체의 사체 방식은 트리거 만성 40, 41에 HERV 식의 구성 요소 및 감염 질환 42, 43 대 마커를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

공개

이 작품은 BIOMERIEUX SA, 호스피스 Civils 드 리옹과 프랑스 공공 기관 OSEO (새로운 치료 접근 방법에 대한 고급 진단, 맞춤 의학에 전념 프랑스 정부 지원 프로그램)에 의해 지원되었다. PP, VC, GO, 뉴 멕시코, 그리고 FM은 BIOMERIEUX SA의 직원입니다. PP, 뉴 멕시코와 FM이 논문의 연구 결과를 포함하는 특허 신청을 제출했다.

감사의 말

우리는 HERV-V2 프로토콜의 초기 개발 및 최적화에 기여를 위해 세실 Montgiraud, 줄리엣 Gimenez, 갈리 Jaillard와 버트 랜드 본느 와드 감사합니다. 우리는 또한 윤리적 고려 사항에 대한 자신의 지침을위한 hader Haidous을 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
TrizolInvitrogen15596-026
RNA poly-A control stockAffymetrix900433
DNAse 1PromegaM61011,000 U (1 U/µl)
Terminal transferaseRoche3333574001400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization ControlAffymetrix900454
GeneChip Hybridization, Wash and stainingAffymetrix900720Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions
10x One-Phor-All Buffer PLUSComposition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.
RNeasy Mini kitQiagen74104RNA cleanup protocol
WT-Ovation RNA amplification systemNugen2210-24
QIAquik PCR purification kitQiagen28104
EQUIPMENT
Material NameCompanyCatalogue NumberComments
Nanodrop 1000Thermo Scientific
GeneChip Scanner 3000 7GAffymetrixGS30007GOptional: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hybridization 640 OvenAffymetrix640Includes 4 GeneChip Probe array carriers
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chipAffymetrixCustom array.
For microarray availability (for research use only), please contact:
François Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux
Medical Diagnostic Discovery Department
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F
69495, Pierre Bénite cedex France
Phone: 33 (0)4 72 67 87 85
Email: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedicated database and annotations

The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35.

Locus-specific probes design
Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets.

Custom HERV GeneChip microarray
The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.

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