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요약

This protocol describes the process of constructing an insect-machine hybrid system and carrying out wireless electrical stimulation of the flight muscles required to control the turning motion of a flying insect.

초록

무선 호환 디지털 전자 기기의 상승은 비행 곤충의 행동을 연구하기위한 작은 무선 신경 근육 레코더 및 자극의 사용을 묻는 메시지가있다. 이 기술은이 프로토콜에서 설명 살아있는 곤충의 플랫폼을 사용하여 곤충 기계 하이브리드 시스템의 개발을 가능하게한다. 더욱이,이 프로토콜은 시스템 구성 및 풀려 곤충의 비행 근육의 기능을 평가하기위한 자유 비행 실험 절차를 나타낸다. 데모를 위해, 우리는 제어 및 비행 딱정벌레의 왼쪽 또는 오른쪽으로 회전을 달성하기 위해 세 번째 겨드랑이 sclerite (3AX) 근육을 대상으로. 얇은 실버 와이어 전극은 딱정벌레의 각 측면에 3AX 근육에 이식했다. 이들은 무선 배낭의 출력에 연결되어 (즉, 신경 근육 전기 자극)는 딱정벌레의 앞가슴 등판에 장착. 근육은 (왼쪽 또는 오른쪽) 자극 측 교대 또는 stimulatio를 변화시킴으로써 자유 비행 자극했다n 개의 주파수. 근육이 자극 증가 주파수에 대한 등급 화 반응을 나타냈다 때 딱정벌레는 동측 측에 돌렸다. 주입 공정 및 3 차원 모션 캡쳐 카메라 시스템의 볼륨 조정을 각각 근육 손상 및 마커 트랙의 손실을 방지하기 위해주의 깊게 수행되어야한다. 무료로 비행에 대한 관심의 비행 근육의 기능을 공개하는 데 도움이 방법은, 곤충 비행을 연구하는 것이 매우 유리하다.

서문

An insect-machine hybrid system, often referred to as a cyborg insect or biobot, is the fusion of a living insect platform with a miniature mounted electronic device. The electronic device, which is wirelessly commanded by a remote user, outputs an electrical signal to electrically stimulate neuromuscular sites in the insect via implanted wire electrodes to induce user desired motor actions and behaviors. In the early stages of this research field, researchers were limited to conducting wireless recording of the muscular action of an insect, using simple analog circuits comprised of surface-mounted components1-3. The development of system-on-a-chip technology with radio frequency functionality enabled not only the wireless recording of neuromuscular signals but also the electrical stimulation of the neuromuscular sites in living insects. At present, a built-in radio microcontroller is small enough to be mounted on living insects without causing any obstructions to their locomotion4-13.

The development of the built-in radio microcontroller allows researchers to determine electrical stimulation protocols to induce desired motor actions to control the locomotion of the insect of interest. On the ground, researchers have demonstrated walking control by stimulating the neuromuscular sites of cockroaches4,12,14, spiders15, and beetles16,17. In the air, the initiation and cessation of flight were achieved using different methods such as the stimulation of the optic lobes (the massive neural cluster of a compound eye) in beetles7,9 and brain sub-regions in bees18, whereas turning control has been demonstrated by stimulating the antennae muscles and nervous system of the abdomens in moths11,19 and the flight muscles of beetles7,9,13. In most cases, a built-in radio microcontroller was integrated on a custom-designed printed circuit board to produce a miniature wireless stimulator (backpack), which was mounted on the insect of interest. This allows wireless electrical stimulation to be applied to a freely walking or flying insect. Such a microcontroller-mounted insect is what is referred to as an insect-machine hybrid system.

This study describes the experimental protocols for building an insect-machine hybrid system, wherein a living beetle is employed as the insect platform, and instructs on how to operate the robot and test its flight control systems. The third axillary sclerite (3Ax) muscle was chosen as the muscle of interest for electrical stimulation and demonstration of left or right turning control13. A pair of thin silver wire electrodes was implanted in both the left and right 3Ax muscles. Moreover, a backpack was mounted on the living beetle. The other ends of the wire electrode were connected to the output pins of the microcontroller. The backpack was small enough for the beetle to carry in flight. Thus, this allows an experimentalist to remotely stimulate the muscle of interest of an insect in free flight and investigate its reactions to the stimulations.

프로토콜

1. 연구 동물

  1. 후면 개별 Mecynorrhina의 torquata 딱정벌레 나무 펠렛 침구 별도의 플라스틱 용기에 (6cm, 8g).
  2. 각 딱정벌레에게 설탕 젤리 (12 ml)을 3 일마다 한 잔을 공급.
  3. 각각 25 ° C, 60 %로 사육 실내의 온도와 습도를 유지한다.
  4. 얇은 와이어 전극을 주입하기 전에 각 딱정벌레의 비행 능력을 테스트합니다.
    1. 부드럽게 공기에 딱정벌레를 throw합니다. 딱정벌레는 5 연속 시험에 대한 이상 10 초 동안 비행 할 수있는 경우, 딱정벌레 일반 비행 기능을 가지고 결론 및 후속 비행 실험을 위해 그것을 사용한다. 어두워하기 위해 방에있는 모든 조명을 끄고, 딱정벌레를 탈환합니다. 이 비행을 종료 할 딱정벌레가 발생합니다.
      참고 : 공기 중으로 방출 할 때 딱정벌레가 자발적으로 멀리 비행을 시작합니다. 예컨대도 1 (16 × 8 × 4m에 도시 한 바와 같이 큰 폐 공간에서 비행 실험을 실시하는 것이 좋다 3 12.5 X 8 × 4m 3), 공중에서 회전 할 때 비행 딱정벌레 이동 매우 빠르게 (약 3-5m / 초)과 큰 호를 그립니다.

2. 전극 주입

  1. 1 분 13,16,20-24에 대한 CO 2로 채워진 플라스틱 용기에 배치하여 벌레를 마취.
  2. 10 초 동안 온수에 침지하여 치과 용 왁스를 발라. 나무 블록에 마취 딱정벌레를 놓고 연화 치과 왁스로 고정시킨다. 치과 왁스는 자연적으로 냉각하고 몇 분 이내에 굳은.
  3. 25mm의 길이로 잘라 절연은 전선 (127 μm의 맨 직경, 퍼플 루오로 코팅 된 178 μm의 직경) 주입을위한 얇은 와이어 전극을 사용할 수 있습니다.
  4. 각 와이어의 양 단부에 상기 절연체를 화염에 의해 베어 실버 3mm 노출.
  5. SMA를 만들 뾰족한 가위를 이용하여 딱정벌레의 큐티클의 표면을 해부하다metepisternum (그림 2C)에 약 4 × 4mm의 LL 창. 참고 :도 2c에 도시 된 바와 같이 부드러운 갈색 색상의 표피가 다음 노출 - 전자. 3AX 근육은 부드러운 표피 아래에 있습니다.
  6. 피어스 개의 구멍 (도 2D) 사이에 2mm의 거리 곤충 핀 (크기 00)를 사용하여 노출 된 갈색 표피 두 구멍.
  7. 주의 깊게 관통 구멍 (단계 2.4에서 제조 한 액티브 한 귀환 전극을 포함)이 와이어 전극을 넣고, 3 mm의 깊이로 각 3AX 근육로 이식.
  8. 이식 된 전극을 고정하고 구멍에 녹은 밀랍을 놓아 연락처 및 단락을 방지하기 위해 장소에 개최합니다. 필요한 경우, 뜨거운 납땜 인두의 끝과 밀랍을 터치하여 표피를 통해 밀랍을 리플 로우. 밀랍 빠르게 굳은 및 주입을 강화.
    참고 : 주입이 올 경우 무의 딱지 날개를 확인하려면제작 전기 자극 중 3AX 근육의 움직임을 관찰하기 위해 해제 될 수있다.

3. 무선 배낭 조립

주 : 배낭 내장 무선 마이크로 4 층 FR-4 기판 상에 (1.6 X 1.6 cm 2)로 구성되었다. 배낭은 리튬 폴리머 microbattery (3.7 V, 350 ㎎, 10 MAH)에 의해 구동되었다. 전지를 포함하는 배낭의 총 질량은 비틀 (10 g 체중의 30 %)의 페이로드 용량 미만 1.2 ± 0.26 g이었다. 배낭은 무선 통신을 수신하기 위해 미리 프로그램과 2 개의 출력 채널이었다.

  1. 앞가슴 등판의 표면을 청소 양면 테이프를 사용하여 (표피의 왁스 층을 제거). 그런 다음, 양면 테이프의 조각을 가진 딱정벌레의 앞가슴 등판의 배낭을 연결합니다.
  2. 배낭의 출력에 이식 된 전극의 끝을 연결합니다.
  3. fo를 마커를 생성하기 위해 microbattery 주위에 역 반사 테이프를 감싸R 모션 캡쳐 카메라를 검출한다.
  4. 되 반사 테이프가 모션 캡쳐 카메라에 의해 검출 할 수 있으므로, 양면 테이프의 조각을 사용하여 가방의 상부에 microbattery 첨부.

4. 무선 제어 시스템

주의 : 이러한 경우에, 용어 무선 제어 장치는 원격 제어기를위한 수신기를 포함하는, 커스텀 비행 제어 소프트웨어를 실행하기위한 노트북 컴퓨터, 기지국, 배낭 및 모션 캡쳐 시스템.

  1. USB 포트를 통해 랩탑 컴퓨터의 리모트 컨트롤러의 기지국 수신기에 연결한다.
  2. 모션 캡쳐 시스템에서 스위치 및 이더넷 포트를 통해 노트북 컴퓨터에 연결합니다.
  3. 완전 모션 캡쳐 공간을 커버 (모션 캡쳐 시스템의 공급 회사가 제공하는) 보정 지팡이를 흔들며 부피 보정을 수행한다.
    1. 노트북의 바탕 화면에서 모션 캡쳐 소프트웨어를 엽니 다. 클릭 한 박사AG는 "자원"패널의 "시스템"메뉴에서 모든 카메라를 선택합니다.
    2. 은 "3D 관점"메뉴를 클릭하고 카메라보기로 변경 "카메라"를 선택합니다. 교정 설정을 표시하는 "도구"패널에서 "카메라"탭을 클릭합니다. 카메라에서 잡음을 제거하기 위해 "카메라 마스크 만들기"메뉴에서 "시작"버튼을 클릭 잡음이 파란색 마스크 후 다음 "정지".
    3. 클릭하고 "지팡이"메뉴와 "카메라"탭에서 "L-프레임"메뉴에서 "5 마커 지팡이 & L-프레임"을 선택합니다. 2500에 "지팡이 카운트를"설정은 "교정 카메라"메뉴의 "시작"을 클릭하고 전체 모션 캡처 공간을 통해 교정 지팡이를 흔들어. 막대 수가 2,500에 도달하면 교정 프로세스가 중지됩니다.
    4. ( "도구"패널의 "카메라"탭의 하단에있는) 이미지 오류가보다 높은 0.3 F 인 경우 교정 과정을 반복또는 카메라. 교정 후, 모션 캡처 공간의 중앙에 바닥에 지팡이를 넣어 모션 캡쳐 공간의 원점을 설정하려면 "설정 볼륨 기원"메뉴의 "시작"을 클릭합니다.
  4. 모션 캡쳐 공간에서 사용자에 의해 흔들어 마커의 이동 경로를 기록하고 마커가 검출 및 추적 여부를 확인하기 위해 테스트 더미를 이용하여 모션 캡쳐 시스템의 범위를 확인한다. 마커가 자주 검색하는 동안 손실 된 경우 더미 테스트가 성공할 때까지, 볼륨 교정을 반복합니다.
    1. "도구"패널에서 "캡처"탭을 클릭 한 다음 그 궤적을 기록 전체 모션 캡처 공간을 통해 샘플 마커를 흔들며하기 전에 "캡처"메뉴의 "시작".
    2. 기록 후, 클릭 마커의 위치를​​ 재구성하고 기록의 품질을 확인하기 "를 재구성 파이프 라인을 실행합니다."
  5. microb의 단자에 연결attery 배낭의 전원 핀 (단계 3.4에서 배낭에 부착).
  6. 랩톱과 맞춤 비행 제어 소프트웨어를 사용하여 배낭 사이의 무선 통신을 테스트한다. 소프트웨어의 "시작"명령을 클릭하고 표시된 연결 상태를 확인합니다.

5. 무료 비행 실험

  1. 16 × 8 × 4m (3)을 측정하는 비행 분야에서 자유 비행 실험을 실시하고 있습니다.
  2. 입력 비행 제어 소프트웨어 (전압, 펄스 폭, 주파수 및 자극 지속 시간)에 해당하는 파라미터. 참고 : 데모, 우리는 3 밀리로 3 V까지 펄스 폭의 전압을 고정하고, 자극 지속 시간이 1 초에 60 내지 100 Hz로 주파수를 변경.
    1. 은 "전압"상자에 3 V에 대한 소프트웨어 화면, 유형 3은 "자극 기간"상자에 1,000 밀리의 "펄스 폭"상자에 3 밀리 3 1,000, 및에서 Hz 단위 원하는 주파수에서 " 주파수 "박스 오n은 명령 창을여십시오.
  3. 이 비행 경기장 내에서 자유롭게 비행 할 수 있도록 공중으로 배낭에 장착 된 딱정벌레를 놓습니다. 딱정벌레는 모션 캡쳐 공간에 진입 할 때 수동 자극을 발생시킨다. 를 눌러 원격에서 해당 명령 단추 (왼쪽 또는 오른쪽)는 딱정벌레의 왼쪽이나 오른쪽에있는 대상 근육을 자극합니다.
    주의 :이 버튼이 눌러지면, 랩톱에서 실행되는 비행 제어 소프트웨어 명령을 생성하고, 배낭으로 보낸다. 배낭은 (왼쪽 또는 오른쪽) 관심의 근육에 전기 자극을 출력한다.
  4. 자극하는 동안 실시간으로 딱정벌레의 반응을 관찰하고 3D 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 재구성.
    1. 은 "비틀 디스플레이"윈도우의 데이터 목록에 기록 된 시험 중 하나를 선택하고 분석 폴더에 그 재판의 데이터를 복사하고 3 차원 그래프 모듈을 실행하는 "수출 팬더"를 클릭합니다.
    2. 눌러 "N"키보드 기록 궤도에 자극 신호를 결합한다. I를 눌러 강조 표시된 자극 기간이 딱정벌레의 궤도를 표시합니다.

결과

전극 주입 절차는 그림 2에 제시되어 얇은 실버 와이어 전극 근육 (도 2D - 전자)의 부드러운 표피에 피어싱 작은 구멍을 통해 딱정벌레의 3AX 근육에 이식했다.. 이 부드러운 표피는 metepisternum의 앞쪽 부분을 제거한 후 바로 basalar 근육의 apodema 위에서 발견된다 (도 2 차원을 - 다). 전극은 다음 밀랍 (도 2F)?...

토론

이 실험의 신뢰도에 영향을 미치는, 상기 주입 공정은 중요하다. 전극은 3mm 비틀 (주변 근육과의 접촉을 회피)의 크기에 따라 이하의 깊이에서 근육에 삽입되어야한다. 전극이 근처의 근육을 터치하면 바람직하지 않은 모터 행동과 행동은 주변 근육의 수축으로 인해 발생할 수 있습니다. 두 개의 전극이 아니라 더 단락이 발생하지 않도록 정렬되어야합니다. 용융 및 납땜을 사용하여 밀랍을 리플 ...

공개

The authors declare that there are no conflicts of interest.

감사의 말

This material is based on the works supported by Nanyang Assistant Professorship (NAP, M4080740), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) Public Sector Research Funding (PSF, M4070190), A*STAR-JST (The Japan Science and Technology Agency) joint grant (M4070198), and Singapore Ministry of Education (MOE2013-T2-2-049). The authors would like to thank Mr. Roger Tan Kay Chia, Prof. Low Kin Huat, Mr. Poon Kee Chun, Mr. Chew Hock See, Mr. Lam Kim Kheong and Dr. Mao Shixin at School of MAE for their support in setting up and maintaining the research facilities. The authors thank Prof. Michel Maharbiz (U.C. Berkeley) his advice and discussion, Prof. Kris Pister and his group (U.C. Berkeley) for their support in providing the GINA used in this study.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Mecynorrhina torquata beetleKingdom of Beetle Taiwan10 g, 8 cm, pay load capacity is 30% of the body mass
Aproval of importing and using by Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore (AVA; HS code: 01069000, product code: ALV002).
Wireless backpack stimulatorCustomTI CC2431 micocontroler
The board is custom made based on the GINA board from Prof. Kris Pister’s lab. The layout of GINA board can be found at    https://openwsn.atlassian.net/wiki/display/OW/GINA
Wii Remote controlNintendoBluetooth remote control to send the command to the operator laptop
BeetleCommander v1.8Custom. Maharbiz group at UC Berkeley and Sato group at NTUEstablish the wireless communication of the backpack and the operator laptop. Configure the stimulus parameters and log the positional data. Visualize the flight data.
GINA base stationKris Pister group at UC BerkeleyTI MSP430F2618 and AT86RF231
Motion capture systemVICONT1608 cameras for a flight arena of 12.5 m x 8 m x 4 m
Motion capture systemVICONT40s12 cameras for a flight arena of 12.5 x 8 x 4 m
Micro batteryFullriver 201013HS10C 3.7V, 10 mAh
Retro reflective tapeReflexiteV92-1549-010150V92 reflective tape, silver color
PFA-Insulated Silver Wire A-M systems786000127 µm bare, 177.8 µm coated, 3 mm bare silver flame exposed at tips
SMT Micro Header SAMTECFTSH-110-01-L-DV0.3 mm x 6 mm, bend to make a 3 mm long slider to secure the electrode into the PCB header.
BeeswaxSecure the electrodes
Dental WaxVertexImmobilize the beetle
Insect pinROBOZRS-6082-30Size  00; 0.3 mm Rod diameter; 0.03 mm tip width; 38 mm Length 
Make electrode guiding holes on cuticle
TweezersDUMONTRS-5015Pattern #5; .05 mm x .01 mm Tip Size; 110 mm Length
Dissecting and implantation
ScissorsROBOZRS-5620Vannas Micro Dissecting Spring Scissors; Straight; 3mm Cutting Edge; 0.1 mm Tip Width; 3" Overall Length 
Dissecting and implantation
Potable soldering ironDAIYODS241Reflow beeswax
Hotplate CORNINGPC-400DMelting beeswax and dental wax
Flourescent lampPhilipsTL5 14WLight the entire flight arena with 30 panels (60 x 60 cm2). Each panel has 3 lamps.
14 W, 549 mm x 17 mm 

참고문헌

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