해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

요약

우리는 뇌 하 수 체 동맥 해 부 개발 쥐에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 프로토콜을 제시.

초록

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 그것은 별도 배아 기원과 기능을 가진 두 개의 동맥 이루어져 있다-는 neurohypophysis와는 adenohypophysis. 개발 마우스 뇌 하 수 체는 길쭉한 타원형 모양으로 섬세 하 고 작은. 마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다.

이 프로토콜의 목표 달성 마우스 개발에서 잘 보존 된 조직 구조와 적절 한 뇌 코로나 섹션 것입니다. 이 프로토콜에서 우리 자세히 해 부 제대로 개발 하는 쥐에서 뇌 하 수 체 분 비를 처리 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 쥐 해 부 하기 전에 포름알데히드의 transcardial 관류에 의해 고정 됩니다. 다음 세 가지 다른 해 기술 쥐의 나이 따라 그대로 뇌 하 수 체 땀 샘을 얻을에 적용 됩니다. 태아 쥐 세 일 최대 배아 일 (전자) 17.5-18.5와 신생아, trigeminal 신경, 동맥, 설상 골을 포함 하 여 전체 sella 지구는 해 부. 강아지에 대 한 세 출생 후 일 (P) 5 월 14 일, 뇌 하 수 체 땀 샘 삼차 신경으로는 전체적으로 해 부. 마우스 3 주 이상, 뇌 하 수 체 분 비는 신중 하 게 해 부 무료 주변 조직에서. 우리는 또한 코로나 섹션 만족을 얻기 위해 주변 조직 랜드마크로 서 사용 하 여 적절 한 방향에서 뇌 하 수 체 땀 샘을 포함 하는 방법을 표시 합니다. 이 메서드는 마우스 개발에 뇌 하 수 체 동맥의 조직학 및 발달 기능 분석에 유용 합니다.

서문

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성^1,2에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 해부학, 뇌 하 수 체는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 구성 된 ' 2-에-하나 ' 구조 이다. 이 부분 매우 다르게 다른 배아 기원과 기능 있다. neurohypophysis 신경 ectoderm에서 파생 되 고 옥 시 토 신과 antidiuretic 호르몬을 secretes. adenohypophysis Rathke의 주머니에서 유래 되며 성장 호르몬, 갑 상선-자극 호르몬, 여 포-자극 호르몬, 황 호르몬, prolactin adrenocorticotropic 호르몬 등 호르몬의 출시에 대 한 책임 및 melanocyte-자극 호르몬^3,,45.

뇌 하 수 체 마우스 두개골의 설상 골 (sella turcica)의 등 쪽 표면에 그리고 연약한 줄기로는 뇌의 바닥에 연결. 삼차 신경 및 anteriorly 광학 chiasm^6,7옆으로 포위 된다. 선 그것의 긴 축 머리의 수직으로 길쭉한 타원형 모양이 있다. 그것의 등 쪽 표면에는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 수 쉽게 수 구분, 등 쪽 중간 지역 및 옆으로 및 ventrally 후자의 확장 점령 전와. 출생 후 개발 하는 동안 뇌 하 수 체의 크기 출생^8,9후 첫 번째 달에서 급속 하 게 증가 한다. 그럼에도 불구 하 고, 마우스 뇌 하 수 체는 여전히 매우 작습니다 1.9 mg의 평균 무게와 긴 축 직경 3 m m의 크기에 성인¹⁰, 21 (P21), 출생 후 하루에 2-2.5 mm P0에만 1-1.5 m m의 긴 축 직경에.

마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다. 그러나, 몇 가지 기술은 개발 하는 그것의 매우 작은 크기와 뚜렷한 해부학 쥐에서 뇌 하 수 체 땀 샘의 코로나 섹션 만족을 얻을 해야 합니다. 이 비디오 자료 마우스 뇌 하 수 체 동맥 해 부 다른 개발 단계에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법을 보여 줍니다.

프로토콜

C57BL/6 마우스 특정 병원 체 자유로운 조건에서 사육 된다. 동물 관리 및 두 번째 군사 의학 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 지침 준수는 모든 동물 실험 방법.

1. 해 부의 출생 후 개발 뇌

1. 수행 마 취: 저체온증을 유발 하 얼음에 신생아 쥐 (P0-P5) 장소. 쥐 나이의 5 일 보다 오래 된, 대 한 마 취를 유도 하기 위해 5% 우 레 탄 (몸 무게의 30 µ L/g)을 intraperitoneally 주사. 꼬리/발가락 pinches 응답을 평가 합니다. 마우스는 유해 자극에 반응 하는 후에 진행.
2. 부드럽게 녹화는 forepaws에 의해 (얼굴 위쪽으로 뒤에 누워) 부정사 위치에 마우스를 확보 하 고 되 고 수 있는 작업 표면에 hindpaws (즉, 스티로폼) 화학 증기 두건 안쪽 고정.
3. Transcardial 관류 수행.
   1. 마우스 흉 곽을 마음 (및 기타 흉부 장기) 노출 수술가 위로 잘라.
   2. 무딘 집게와 뛰는 심장을 장악 하 고 좌 심 실에 26 G (0.45 m m) 바늘을 삽입. 버퍼링 heparinized 인산 염 분 가득한 10 mL 주사기 바늘 연결 (PBS; 5 mg/mL 나트륨 아 질산염 및 10 U/mL 헤 파 린 보충, pH 7.4, 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C). 즉시 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 자르고 오른쪽 아 트리 움 종료 액체는 분명 때까지 따뜻한 PBS 가진 시체를 perfuse 시작.
      참고: 대략 5-10 mL PBS 신생아 쥐에 대 한 필요와 성인 쥐에 대 한 10-20 mL PBS.
   3. 바늘 그 자리에 유지 하 고 다른 주사기 4 %paraformaldehyde (PFA; pH 7.4)으로 가득 변경 합니다. 10 mL과 대 한 정착 액의 20 mL perfuse 신생아와 P21 마우스, 각각.
      주의: PFA 독성이 있다. 그것은 피부 및 호흡기 자극, 눈 손상 일으킬 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 화학 후드 작업.
4. PFA-고정 마우스 목을 벨 및 두개골 뼈가 위로 자르면.
   1. 는 부드럽게 리프트는 두개골의 기지에서 hindbrain 작은 집게. Sella turcica의 첫 징후, 정지 해제 하지만 보류 hindbrain, 뇌 줄기 및 좋은 위 두뇌의 기지에 연결 하는 신경 섬유 절단. 이 단계는 뇌 하 수 체는 뇌와 멀리 리프트 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 하다.
   2. 다음 두뇌 운동 계속 하 고 뇌를 완전히 노출 하는 뇌를 제거 합니다. 뇌 하 수 체, 측면 trigeminal 신경를 포함 하 여 전체 sella 지역 잘라 고 설상 뼈가 (약 3 x 5 m m ²) 위 아래.
5. 35 m m 음식 또는 찬 4 %2 mL를 포함 하는 6-잘 접시의 한 잘 해 부 조직 넣어 PFA (pH 7.4). P0-p 7 pituitaries, P14 pituitaries, P21-P28 pituitaries, 및 성인 pituitaries 3 h 1.5 h에 대 한 1 시간 40 분 동안 4 ° C에서 조직 수정.
6. 뇌 하 수 체의 추가 분리
   1. 씻어 10 mL PBS, 5 변화, 15 분 함께 고정된 조직. 그 주변 조직 함께 신생아 뇌와 설상 뼈 아래 탈수에 직접 처리할 수 있습니다. 그러나 5 일 보다 오래 된 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해리 될는, 스테레오 현미경 더.
   2. 1 mL PBS를 포함 하는 35 mm 접시에 고정된 조직을 넣어. P5-P14 pituitaries에 대 한 신경 및 미세 집게와가 위, 뼈 사이 연결 막 제거 하 고 신중 하 게 전체 하지만 sella turcica 떠나 함께 측면 trigeminal 신경 뇌 하 수 체를 분리 합니다. 절연된 선 및 신경으로 연결 막으로 연결 되는 " H "-같은 모양 ( 그림 1B).
   3. 위한 P21 및 성인 pituitaries, 신경 및 뇌 하 수 체는 주위 연결 막 제거 하 고 주변 조직에서 선 무료. 렌즈 청소 티슈 페이퍼와 뇌 조직을 포장 하 고 포함 카세트에 넣어.
      참고: 작은 뇌 하 수 체 렌즈 청소 티슈 페이퍼 감싸기 표본의 어떤 잠재적인 손실을 방지 하 고 다음 파라핀 포함 절차에서 조직의 무결성을 유지 도움이 됩니다. 곳을 알아내는 포함 절차에서 작은 병에서 처리 하는 경우는 뇌 하 수 체를 포장 하는 데 필요한 되지 않을 수 있습니다.

2. 소스 및 단면화 파라핀

1. 탈수 15 분에 대 한 50%, 65%, 75%, 및 95% 에탄올 솔루션 카세트 포함에 표본. 그 후 탈수 순수 에탄올, P0-으로 각 3 분의 3 변화 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전에 대 한. 크 실 렌와 명확한 3 변경, P0-으로 각 3 분 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전 합니다. P0-P4 땀 샘에 녹은 파라핀 왁 스, 3 변화, 7 분 침투 그리고 8 분 두 번 6 분 한 번 P5 및 오래 된 샘.
   참고: 조직 처리에 대 한 최적의 조정할 수 있다 경험. 높은 품질 섹션을 얻으려면, 부족 또는 이상 탈수를 피해 야 한다. 크 실 렌을 사용 하 여 조직 삭제에 대 한 마찬가지입니다.
2. 방향을 포함 하는 때
   1. 콘솔 시스템을 포함 하는 조직에 카세트에서 표본 제거 고 그것 기본 몰드 반 녹은 파라핀 왁 스로 가득 합니다. 포함 뇌 하 수 체의 올바른 방향 코로나 섹션을 만족 시키기 위해 필수적 이다.
   2. 위한 P21 및 성인 뇌 하 수 체 동맥, 뇌 하 수 체의 짧은 축 기준 형 (단면)의 하단 표면에 수직으로 위치. 설상 뼈와 삼차 신경 해부학 랜드마크로 서 P0-p 4와 P5-P14 pituitaries에 대 한 각각 사용 합니다. 동양 그들의 trigeminal 신경 또는 횡단 lamina 기본 몰드의 하단 표면에 수직인 설상 뼈의 표본.
   3. 부드럽게 잡고 조직 원하는 위치에 따뜻하게 잘 집게로 왁 스 냉각 접시에 반 고체 될 때까지. 녹은 파라핀 왁 스 몰드를 가기. 왁 스가 완전히 경화 될 때까지 냉각 파라핀 블록 허용.
      참고: 같은 방법으로 신생아 뇌 하 수 체는 뇌 하 수 체 배아 일 18.5에서 (E18.5)을 치료 수 있습니다. pituitaries 하지만 (Rathke ' s 파우치) E16.5 전체 머리 포함 해야 하 고 기본 몰드의 하단 표면에 수직 (미가 입)에서 화살 축 중심 보다 젊은.
3. 10-20 분 동안-20 ° C에 파라핀 블록을 진정 하 고 다음 컷에 얇은 조각 (4 µ m 두께 선호)는 톰으로. 만족을 코로나 섹션, 정밀한 단면 중 파라핀 블록의 위치를 조정 합니다. 다음 절차에서 분할의 분리를 방지 하기 위해 polylysine 코팅 유리 슬라이드에 조직의 조각을 마운트.
   참고: 또는, 표본 수 탈수 있을 15%에서 30% (W/V) 자당 솔루션 (PBS) 그들은 동일한 방향 메서드를 사용 하는 곳을 알아내는 포함 화합물에 포함 하 고 신속 하 게 드라이 아이스에 냉동 바닥에 침 몰 될 때까지 4 ° C에서. 다음 8-10 µ m는 cryostat를 사용 하 여 조각으로 냉동된 조직 블록을 잘라. 그러나 곳을 알아내는-섹션의 형태, 파라핀 섹션을 열 등 한 자주는.

3. H & E 얼룩이 지 고 면역 형광 라벨

1. 따뜻한 열에 슬라이드 55 ° C에서 차단 및 크 실 렌, 2 변화, 4 분 각 dewax. 95% 에탄올 두 번와 75% 에탄올 두 번, 3 분 샘플을 탈수. 세척 통에 5 분 증류수와 슬라이드.
2. H에 대 한 & 전자 얼룩, 얼룩 졸업생 되며 솔루션 6 분에 대 한 섹션, runn에 씻어ing 수돗물 2 분 45 s, 및 2 분 동안 물에 씻어 다시 0.2% 암모니아 물으로 구분 합니다. 1 분 2 분에 오신으로 얼룩 순차적으로 탈수, 취소, 그리고 탑재 다음 섹션 95% 에탄올을 탈수.
3. 1. 면역 형광 라벨 3% H ₂ O ₂와 0.01% 할머니 ₃ 생 peroxidases을 비활성화를 실 온에서 20 분을 포함 하는 메탄올을 가진 섹션을 취급 합니다. 검색 끓는 2 분 품에 대 한 압력 밥 솥에서 검색 버퍼 (1 mM EDTA와 1 mM Tris HCl, pH 7.4)에 섹션 37에서 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5% 염소 혈 청) 섹션 항 ° c.
   2. 토끼 반대로 성장 호르몬 (GH) 항 체 (1:2, 000) 또는 토끼 (GFAP) 안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질 항 체 (1:2, 000) 섹션 4에서 하룻밤 블로킹 버퍼에 희석을 품 어 ° c.
   3. 37 35 분 이차 항 체 (염소-토끼 IgG-HRP, 블로킹 버퍼에 1:300) 섹션을 품 어 ° c.
   4. 실 온에서 15 분 동안 Biotinyl Tyramide (0.3% H ₂ O ₂를 포함 하는 Tris 버퍼 식 염 수에 1:50)를 사용 하 여 신호를 증폭 및 시각화 Streptavidin Alexa594 또는 488 (차단 버퍼, 30 분, 37 ° C에 1:300).
   5. Counterstain 실 온에서 5 분 동안 DAPI (PBS에 50 mg/L)와 핵.
      참고: 그것은 수 없습니다 Tyramide 신호 증폭 (TSA) 시스템을 사용 하 여 신호를 증폭 하는 데 필요한. 또는, 형광 활용 된 이차 항 체는 신호를 시각화 하기 위해 사용할 수 있습니다.
4. 형광 현미경을 사용 하 여 취득 이미지 갖춘 DAPI, 텍사스, 빨강과 FITC 필터 세트 × 4/0.13 × 40/0.75 목표 5.0 메가 픽셀 카메라. 사용 하 여 360, 488, 594 nm 레이저 파장 이미징 DAPI, 알 렉 사 488-, 및 알 렉 사 594 스테인드 섹션, 각각. 레이저 파워 최적화 (0.8은 일반적으로 사용 되었다) 및 각 채널에 대해 원하는 수준으로 노출 시간. 이미지 수집 소프트웨어 제어 아래 이미지 및 이후 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 오버레이.

결과

이 프로토콜 개발 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해 부 하는 메서드를 제공 합니다. 신생아 마우스, 뇌 하 수 체, 삼차 신경 및 아래를 포함 하는 전체 sella 지역 설상 뼈 두개골의 기지에서 밖으로 해 부 했다. 작고 섬세 한 뇌 하 수 체 (그림 1A) 과정에서 그대로 남아. 5 일 보다 오래 된 마우스 측면 trigeminal 신경에 연결 된 뇌 하 수 체 분 비 했다 다음 격리. ?...

토론

Murine pituitaries 개발, 그것은 그들의 작고 연약한 기능 및 독특한 해 부 특성^6,8적절 한 코로나 섹션을 기술적으로 어려운 되었습니다. 일부 연구 그룹 따라서 배아와 신생아 뇌^11,12의 형태를 분석 하 중반 화살 섹션을 선택 했다. 하지만 뇌 하 수 체의 중반 화살 섹션 앞쪽, 중간, 수 이며 또한 단일 조각에서 후?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straight	JinZhong	J21010	can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght	JinZhong	WA1010	can be purchased from other vendors
Blunt forceps	JinZhong	JD1020	can be purchased from other vendors
Fine forceps	Dumont	RS-5015	for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle	HongDa		for transcardial perfusion
Syringe (1 mL)	BD	300841	can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL)	BD		can be purchased from other vendors
35mm dish	Corning	430165	can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper	ShuangQuan		can be purchased from other vendors
Anatomical microscope	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	can be purchased from other vendors
Embedding cassette	Thermo Fisher	22-272423	can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system	KEDEE	KD-BM11	can be purchased from other vendors
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides	Thermo Fisher	22-037-246	can be purchased from other vendors
Cover glass	Thermo Fisher	12-543	can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope	OLYMPUS	BH2-RFCA	can be purchased from other vendors
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	for PBS
KCl	Sigma	P9541	for PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	for PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	for PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparin Sodium Injection	SPH	H31022051	for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Ethanol	SCR	10009218
Xylene	SCR	10023418
Paraffin	Thermo Fisher	8330
Hematoxylin	Sigma	H9627	for H&E staining
Eosin Y	Sigma	E4009	for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH)	National Hormone		for immunostaining
antibody	Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody	Sigma	G9269	for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP	Jackson	111-035-003	for immunostaining
TSA system	NEN Life Science Products	NEL700	for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	for immunostaining