Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

Resumo

Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.

Resumo

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase. É constituída por duas glândulas com funções e origens embrionárias distintas — a neuro-hipófise e a adenohipófise. A desenvolvimento do mouse hipófise é minúsculo e delicado com uma forma oval alongada. Uma secção coronal é preferida para exibir tanto a adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse.

O objetivo do presente protocolo é conseguir a adequada da hipófise secções coronais com arquiteturas de tecido bem preservado de desenvolver ratos. Neste protocolo, descrevemos em detalhe como dissecar e processo hipófises corretamente de desenvolvimento de ratos. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Em seguida, três diferentes técnicas de dissecação são aplicadas para obter intactas as glândulas pituitárias, dependendo da idade dos ratos. Para ratos fetais entre embrionários dias (E) 17,5-18.5 e neonatos acima de 4 dias, as regiões de sella inteira, incluindo o osso esfenoide, glândulas e nervos trigêmeo são dissecadas. Para filhotes idade pós-natal dias (P) 5-14, as glândulas pituitária conectados com os nervos trigêmeo são dissecados como um todo. Para ratos mais de 3 semanas de idade, as glândulas pituitária são cuidadosamente dissecadas de graça os tecidos circundantes. Também exibimos como incorporar as glândulas pituitária em uma orientação correta usando os tecidos circunvizinhos como Marcos para obter satisfação secções coronais. Esses métodos são úteis na análise de características histológicas e do desenvolvimento das glândulas pituitária no desenvolvimento de ratos.

Introdução

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase^1,2. Anatomicamente, a glândula pituitária é uma estrutura ' dois-em-um ' da neuro-hipófise e a adenohipófise. Estas peças têm a função e diferentes origens embrionárias muito diferentemente. A neuro-hipófise é derivada do ectoderma neural e segrega ocitocina e hormônio antidiurético. A adenohipófise origina-se de bolsa de Rathke e é responsável para a liberação de hormônios, incluindo o hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio adrenocorticotrófico, e melanócito – estimulante hormônio^3,4,5.

A glândula pituitária baseia-se na superfície dorsal do osso esfenoide (sella turcica) do crânio do mouse e é ligada ao pavimento do cérebro por um frágil caule. Está rodeada lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico^6,7. A glândula tem uma forma oval alongada com seu longo eixo perpendicular a isso da cabeça. Em sua superfície dorsal, a neuro-hipófise e a adenohipófise podem facilmente ser demarcadas, com a primeira ocupando a região dorsal medial e o último estendendo lateralmente e ventralmente. Durante o desenvolvimento pós-natal, o tamanho da hipófise aumenta rapidamente no primeiro mês após o nascimento de^8,9. Não obstante, a hipófise de rato ainda é muito pequena em tamanho, com um peso médio de 1,9 mg e long-eixo de ~ 3 mm de diâmetro em adulto¹⁰, um diâmetro de eixo longo de 2-2,5 mm no pós-Natal dia 21 (P21) e apenas de 1-1,5 mm em P0.

Uma secção coronal é preferida para exibir ambos adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse. No entanto, algumas habilidades técnicas são necessárias para obter a satisfação secções coronais de glândulas pituitárias de desenvolver ratos devido ao seu tamanho extremamente pequeno e anatomia distinta. Neste artigo de vídeo, demonstramos como dissecar as glândulas pituitárias de rato e preparar secções coronais da hipófise em diferentes estágios de desenvolvimento.

Protocolo

camundongos C57BL/6 são criados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. Todos os métodos experimentais animais estejam em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de ética na Universidade de medicina militar de segundo e cuidado Animal.

1. dissecação de pós-natal desenvolvendo hipófise

1. realizar anestesia: Coloque gelo picado para induzir hipotermia neonatais ratos (P0 - P5). Para os ratos mais de 5 dias de idade, injete intraperitonealmente uretano 5% (30 µ l/g de peso corporal) para induzir anestesia. Avalie respostas para toe cauda pitadas. Prossiga somente depois que o mouse não está respondendo aos estímulos nocivos.
2. Segura o mouse na posição supina (deitado na parte de trás com face para cima) gravando suavemente as dianteiras e composto para uma superfície de trabalho que é capaz de ser fixado (ou seja, isopor) dentro de uma coifa química.
3. Executar a perfusão transcardial.
   1. Cortar a caixa torácica de rato com uma tesoura cirúrgica para expor o coração (e outros órgãos torácicos).
   2. Segura o coração a bater com fórceps rombudo e insira uma agulha 26G (0,45 mm) no ventrículo esquerdo. A agulha está ligada a uma seringa de 10 mL, preenchida com solução salina heparinizada tamponada de fosfato (PBS; suplementado com nitrito de sódio 5 mg/mL e 10 U/mL heparina, pH 7,4, aquecer a 37 ° C antes do uso). Imediatamente cortar o átrio direito com uma tesoura bem e começam a perfundir o corpo com o PBS quente até o fluido sair do átrio direito é claro.
      Nota: Aproximado de 5-10 mL de PBS é necessária para os ratos Neonatais e 10-20 mL de solução Isotónica de ratos adultos.
   3. Manter a agulha no lugar e mudar para outra seringa preenchida com paraformaldeído 4% (PFA; pH 7,4). Perfundir 10 mL e 20 mL de fixador para neonatal e P21 mouse, respectivamente.
      Atenção: O PFA é tóxico. Pode causar irritações respiratórias, pele e lesões oculares. Use luvas e trabalhar sob uma capa química.
4. Decapitar o mouse PFA-fixo e abriram o osso do crânio com uma tesoura.
   1. , Levante suavemente o rombencéfalo da base do crânio com uma pequena pinça. Ao primeiro sinal da Sela túrcica, paragem de levantamento, mas mantenha o rombencéfalo, cortar a haste hipofisária e fibras nervosas conectando à base do cérebro com uma tesoura bem. Esta etapa é fundamental para garantir que a hipófise não é levantada longe com o cérebro.
   2. , Então, continuar levantando o cérebro e remover o cérebro inteiro para expor a glândula pituitária totalmente. Cortar a região toda sella, incluindo a glândula pituitária, laterais nervos trigêmeo e as por baixo do osso esfenoide com tesoura (aproximadamente 3 x 5 mm ²).
5. Colocar o tecido dissecado em um prato de 35mm ou um bem de uma placa de 6 contendo 2 mL frio 4% PFA (pH 7,4). Fixar o tecido a 4 ° C por 40 min para P0 - P7 pituitaries, 1h para P14 pituitaries, 1,5 h para P21 - P28 pituitaries e 3h para adultos pituitaries.
6. Outras dissociação da hipófise
   1. lava o tecido fixo com 10 mL de PBS, 5 mudanças, 15 min cada. A glândula pituitária neonatal juntamente com seus tecidos circundantes e o abaixo do osso esfenoide podem ser processados diretamente à desidratação. No entanto, as glândulas pituitárias de ratos mais de 5 dias deve ser dissociadas mais sob um microscópio estéreo.
   2. Colocar o tecido fixo em um prato de 35 mm, contendo 1 mL de PBS. Para P5 - P14 pituitaries, retire as membranas conectivos entre os nervos e os ossos com pinça fina e tesoura e isolar cuidadosamente a glândula pituitária, juntamente com nervos laterais do trigêmeo como um todo, mas deixando a Sela túrcica. A glândula isolada e os nervos estão ligados por membranas conjuntivo com uma " H "-como a aparência ( figura 1B).
   Pituitaries de
   3. para P21 e adulto, remova os nervos e membranas conectivos ao redor a hipófise e livre a glândula os tecidos circundantes. O tecido da hipófise, enrole com papel de tecido de limpeza de lentes e colocá-lo dentro de um estojo de encastre.
      Nota: A hipófise minúscula de embrulho com papel de tecido de limpeza de lentes ajuda a evitar qualquer possível perda de espécimes e preservar a integridade do tecido o seguinte procedimento de incorporação de parafina. Pode não ser necessário embrulhar a hipófise se é processado em uma pequena garrafa no procedimento cryo-incorporação.

2. Incorporação e Set Sectioning de parafina

1. desidratar os espécimes em incorporação cassettes com soluções de etanol 50%, 65%, 75% e 95% por 15 min cada. Posteriormente desidrate com 3 alterações de etanol puro, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Claro com xileno, 3 mudanças, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Infiltrar-se com cera de parafina derretida, 3 alterações, 7 min cada para P0 - P4 glândulas, e 8 min duas vezes seguido por 6 min uma vez para P5 e glândulas mais velhas.
   Nota: Os parâmetros ideais para processamento do tecido podem ser empiricamente ajustados. Para obter as seções de alta qualidade, desidratação insuficiente ou superior deve ser evitada. O mesmo é verdadeiro para limpar o tecido usando xileno.
2. Orientação ao incorporar
   1. sobre um tecido de incorporar o sistema do console, retirar a amostra da gaveta e colocá-lo em um molde base half-filled com cera de parafina derretida. Orientação adequada da glândula pituitária de encastre é essencial para satisfazer secções coronais.
   2. Para P21 e adulto as glândulas pituitárias, posicione a glândula pituitária, com seu eixo curto perpendicular à superfície inferior de um molde base (o plano de corte). Use esfenoide ossos e nervos trigêmeo como pontos de referência anatômicos para P0 - P4 e P5 - P14 pituitaries, respectivamente. Orientar os espécimes com seus nervos trigêmeo ou lâmina transversal dos ossos esfenoide perpendiculares à superfície inferior de um molde base.
   3. Pressione cuidadosamente o tecido na posição desejada com a pinça bem aquecida até que a cera se torne semi-sólido em uma placa de resfriamento. Encha o molde com cera de parafina derretida. Permitir que o bloco de parafina esfriar até que a cera é totalmente solidificada.
      Nota: A hipófise no dia embrionário 18,5 (E18.5) pode ser tratada da mesma forma como a hipófise neonatal. Mas os pituitaries (Rathke ' malotes s) mais jovem que E16.5 deve ser encaixado com a cabeça inteira e orientada com o eixo sagital (da boca ao occipício) perpendicular à superfície inferior de um molde base.
3. Chill o bloco de parafina a-20 ° C por 10-20 min e depois cortá-la em finas fatias (4 µm de espessura é preferencial) com um micrótomo. Para obter secções coronais satisfatórias, ajuste a posição dos blocos de parafina durante o corte. Montar as fatias de tecido em lâminas de vidro revestido polylysine para evitar o desprendimento de fatias nos procedimentos a seguir.
   Nota: Alternativamente, as amostras podem ser desidratadas em 15%, 30% (P/V) de soluções de sacarose (em PBS) a 4 ° C até que eles descem para o fundo, incorporado em crio-incorporação composto usando o mesmo método de orientação e rapidamente congelado em gelo seco. Os blocos de tecido congelado corte em fatias de 8-10 µm usando um criostato. A morfologia da cryo-seções, no entanto, é muitas vezes inferior a secções de parafina.

3. H & E coloração e imunofluorescência rotulagem

1. quente os slides em um calor bloqueiam a 55 ° C e dewax com xilol, 2 trocas, 4 min. Desidrate as amostras com o dobro de etanol a 95% e 75% de etanol duas vezes, 3 min cada. Lave os slides com água destilada por 5 min num agitador.
2. Para H & E mancha, mancha as seções na solução de alúmen hematoxilina por 6 min, enxaguar em runnágua da torneira ing por 2 min, diferenciar-se com água de amônia de 0,2% para 45 s e re-enxaguar em água corrente por 2 min. Então desidrata-se as seções com etanol a 95% por 1 min e mancha com eosina por 2 min. sequencialmente desidratam, limpar e montagem.
3. Imunofluorescência rotulagem
   1. trata as seções com metanol contendo 3% H ₂ O ₂ e 0,01% NaN ₃ por 20 min em temperatura ambiente para inactivar peroxidases endógenas. Recuperar a antígenos por ebulição seções no buffer de recuperação (EDTA 1 mM e 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) em uma panela de pressão por 2 min. Incubar as secções com tampão de bloqueio (5% de soro de cabra em PBS) por 30 min a 37 ° C.
   2. Incubar seções com anticorpo anti-hormônio (GH) (1:2, 000) ou anticorpo proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) (1:2, 000), diluídas em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
   3. Seções com anticorpo secundário (cabra anti-coelho IgG-HRP, 1: 300 em tampão de bloqueio), incubar durante 35 minutos a 37 ° C.
   4. Amplificar os sinais usando Biotinyl Tyramide (01:50 em solução salina tamponada de Tris contendo 0,3% H ₂ O ₂) durante 15 minutos à temperatura ambiente e Visualizar com Streptavidin-Alexa594 ou 488 (1: 300 no bloqueio de buffer, 30 min, a 37 ° C).
   5. Counterstain os núcleos com DAPI (50 mg/L em PBS) durante 5 min à temperatura ambiente.
      Nota: Pode não ser necessário amplificar o sinal usando o sistema de amplificação de sinal de Tyramide (TSA). Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado fluorescência pode ser usado para visualizar o sinal.
4. Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência equipado com DAPI, Texas Red e conjuntos de filtros FITC, × 4/0,13 × 40/0.75 objectivos e câmera de 5.0 megapixel. Use o 360, 488 e 594 nm laser comprimentos de onda para imagiologia DAPI, Alexa 488 - e seções manchadas de 594 Alexa, respectivamente. Otimizar a potência do laser (0.8 foi usado geralmente) e tempo de exposição para os níveis desejados para cada canal. Capturar a imagem sob o controle do software de aquisição de imagem e sobrepor as imagens de fluorescência posteriormente usando o software de processamento de imagem.

Resultados

Este protocolo apresenta um método para dissecar as glândulas pituitárias de desenvolver ratos. Para o mouse neonatal, as regiões de sella inteira que contém a glândula pituitária, os nervos trigêmeo e parte de baixo osso esfenoide foram dissecados para fora da base do crânio. A glândula pituitária pequena e delicada permaneceu intacta durante o processo (figura 1A). Para os ratos mais de 5 dias, as glândulas pituitária anexadas aos nervos trigê...

Discussão

Para o desenvolvimento de murino pituitaries, tem sido difícil tecnicamente obter as seções coronais adequadas, devido a suas características de pequenas e frágil e características anatômicas únicas^6,8. Alguns grupos de pesquisa assim escolhi meados-sagital seções para analisar a morfologia do embrionário e neonatal na hipófise^11,12. Embora a meados-sagital da hipófise também é capaz de mos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straight	JinZhong	J21010	can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght	JinZhong	WA1010	can be purchased from other vendors
Blunt forceps	JinZhong	JD1020	can be purchased from other vendors
Fine forceps	Dumont	RS-5015	for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle	HongDa		for transcardial perfusion
Syringe (1 mL)	BD	300841	can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL)	BD		can be purchased from other vendors
35mm dish	Corning	430165	can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper	ShuangQuan		can be purchased from other vendors
Anatomical microscope	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	can be purchased from other vendors
Embedding cassette	Thermo Fisher	22-272423	can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system	KEDEE	KD-BM11	can be purchased from other vendors
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides	Thermo Fisher	22-037-246	can be purchased from other vendors
Cover glass	Thermo Fisher	12-543	can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope	OLYMPUS	BH2-RFCA	can be purchased from other vendors
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	for PBS
KCl	Sigma	P9541	for PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	for PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	for PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparin Sodium Injection	SPH	H31022051	for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Ethanol	SCR	10009218
Xylene	SCR	10023418
Paraffin	Thermo Fisher	8330
Hematoxylin	Sigma	H9627	for H&E staining
Eosin Y	Sigma	E4009	for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH)	National Hormone		for immunostaining
antibody	Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody	Sigma	G9269	for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP	Jackson	111-035-003	for immunostaining
TSA system	NEN Life Science Products	NEL700	for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	for immunostaining