초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

요약

프로토콜 정상적인 대기 산소 수준에서 산소를 발생 하는 초파리 melanogaster 애벌레를 식별 하는 간단한 분석 결과를 설명 합니다. 이 프로토콜에 hypoxic 애벌레를를 겹치는 고기 느린 성장 부진 등을 보여 주는 다른 돌연변이 구별 될 수 있습니다.

초록

동물에 산소 박탈 산소 분포와 방해 하는 내부 조직 손상 또는 낮은 대기 산소 수준에 노출에서 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 산소 감지 뉴런의 탈 선 행동 정상적인 산소 수준 존재 hypoxia-같은 동작을 유도 수 가능. D. melanogaster, 낮은 산소 수준에서 개발 억제 성장 및 느린 동작의 애벌레 단계 동안에 발생합니다. 그러나, 산소 적자의 이러한 설립된 발현 상당히 많은 변이 성장, 스트레스 반응 또는 운동 조절의 고기와 중복. 결과, 현재 아무 분석 결과 돌연변이 나 비정상적인 신경 행동에 의해 유도 된 때 ii) hypoxia-같은 동작에 의해 유도 된 i) 세포 저 산소 증을 식별 하기 위해 사용할 수 있다.

우리는 최근 두 가지 독특한 동작이 D. melanogaster 애벌레 hypoxia의 내부 탐지에 대 한 응답의 정상적인 산소 수준에서 발생 하는 확인 했습니다. 첫째, 모든 단계에서 같은 애벌레 음식 근원에서 멀리 떨어져 straying 종종 음식으로 내 피하. 둘째, 부드러운 층으로 터널링, 방황 3 탈피 단계 동안 일반적으로 발생 하는 완전히 폐지 애벌레 hypoxic 있다면. 여기서 설명 하는 분석 결과 감지 하 여 이러한 동작을 quantitate 설계 및 따라서 내부 손상 보다는 낮은 외부 산소에 의해 유도 된 산소를 감지 하는 방법을 제공 하. 천 층 및 효 모 반죽의 중앙 플러그 분석 결과 접시 애벌레 생활을 통해 동물을 지원 하기 위해 사용 됩니다. 위치와 애벌레의 상태 추적 매일으로 그들은 제 3 먼저 탈피에서 진행 합니다. 방황 단계 천 층으로 터널링의 NIH ImageJ를 사용 하 여 pupation 후 quantitated입니다. 분석 결과 것입니다 결정에 때 hypoxia 돌연변이 표현 형의 구성 요소 값의 되며, 따라서 문제의 유전자의 행동의 가능한 사이트에 대 한 통찰력을 제공.

서문

분자 유전 도구 D. melanogaster 에서 사용할 수 있는 정교한 배열 진화론 보존된 생물 학적 과정의 연구에 대 한 귀중 한 유기 체 게. 주요 분자 응답 산소 가용성을 진화에 걸쳐 보존을 입증 하 고 신호 경로 ^{1,2, 이들의 보편적인 구성 요소에 대 한 통찰력을 생성 하는 D. melanogaster 사전 연구 3,4,,56}.

D. melanogaster 애벌레에 감각 신경 기능 해 부 하기 위한 연구의 일환으로, 우리는 정상적인 산소 수준 ⁷에서 조직 저 산소 증에 의해 활성화 될 입증 하는 두 행동 응답 확인. 음식, 뚫으, 이들 중 하나는 매우 Wingrove와 O'Farrell ⁸보고 낮은 산소 수준에 응답 관련. 두 번째 동작, 후반 3 탈피 단계, 방황 하는 동안 부드러운 층에 터널을 실패 하지 되었습니다 이전 발견 했다로 hypoxia 관련. 우리는 ⁷, 터널링 하는 층을 억제 또한 낮은 산소 수준에 야생 타입 방황 애벌레를 노출 따라서 모두 hypoxia에서 발생 한 이러한 행동-중 유도 조직 손상 또는 낮은 산소 섭취 수준 수립 결정. 여기는 관측 애벌레 부 화 후 즉시 시작 되 분석 결과 우리는이 두 hypoxia 유발 행동을 quantitate를 개발에 대해 설명 합니다.

초기 애벌레 단계에 있는 hypoxic 응답 이전 검사 하지는 및 따라서 애벌레 생활 내내 분석을 수행 하는 것입니다 우리의 분석 결과의 중요 한 구성 요소. -느린 개발, 불 쌍 한 성장, 및 운동 부진-저 산소 증의 확실 한 발현의 대부분 겹칠 애벌레 고기 많은 돌연변이 의해 생산. 하지만 우리 hypoxia로만 세 번째 탈피 애벌레 터널 ⁷완전 한 실패 보여 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 심지어 애벌레 우리의 hypoxic 애벌레 보다 더 성장 및 운동 손상, 여전히 수행 몇 가지 터널링 hypoxic 애벌레는 결코 ⁷터널링 반면 결정. 이 분석 결과의 또 다른 중요 한 요소가입니다 따라서 때 산소는 다 면 발현 성 고기 몇 가지 다른 스트레스 나 변화 고장 아닌 특정 집합의 소스를 설정 하는 방법을 제공 합니다. 분석 결과의 데모, 여기 우리가 특성화의 감소 tracheal 식이 애벌레의 응답에 사용 설명 uninflatable, 애벌레 항공 ⁹에서 작동 하는 유전자.

우리는이 분석 결과 가난한 성장 및 느린 동작을 포함 하는 애벌레 고기 특성화에 종사 하는 연구자에 게 가치가 있을 것입니다 정시. 결과, 유통, 사용, 또는, 응답을 좌우 하는 새로운 유전자를 몸 전체에 산소 수 식별 합니다. 추가, 프로토콜을 차단 하는 돌연변이에이 분석 결과 통합 산소를 생산 하는 돌연변이 확인 하는 직접적인 경로 제공할 것 이다. 이 분석 결과 또한 여기에 설명 된 hypoxia 유발 타고 난 행동 elicits 회로 분석에 귀중 한 것입니다. 이러한 종류의 신경 네트워크 분석은 많은 현재 연구의 초점 고 D. melanogaster 유 충의 간단한 신경 시스템은 자동화 된 동작 개 해 부에 대 한 중요 한 시스템. 감각 뉴런 애벌레 산소 인식에 관련 된 이미 확인 되었습니다, hypoxia 유발 응답 ^10,11에 대 한 완전 한 회로 정의 향한 첫 번째 단계를 제공 하. 우리의 분석 결과 사용 하 여 선택적 신경 최저 GAL4 UAS 시스템¹² 을 통해 함께 묘사 또한 신경 네트워크의 구성 요소에 대 한 명확한 경로입니다.

프로토콜

1입니다. 애벌레의 준비

1. 분석 결과, 시작 하기 전에 두 개 이상의 일 십자가의 원하는 실험 설정 하 고 Wieschaus 및 Nusslein Volhard ¹³ 하지만 50ml 폴 리 프로필 렌을 사용 하 여 설명 대로 계란-누워 요리 조합 (최소 20 여성 및 남성 10 각) 제어 비 커 및 6.0 cm 일회용 접시 포도 agar를 포함 하 고 누 룩 얼룩져 그냥 사용 하기 전에 붙여 넣습니다. 계속 계란-누워 요리에 필요할 때까지 실 온에서 어둠 속에서 난다.
2. 포도 한 천 제조 법-결합 냉동 100 mL 100% 포도 주스 농축, 350 mL deioinized 물, 5 mL 빙하 아세트산 및 13 g D. melanogaster 천 1 L 유리 비 커에. 1-2 분 버스트, 버스트, 한 천이 모두 녹는 때까지 사이의 교 반에 전자 레인지. 솔루션을 몇 분 기다린 다음 95% 에탄올에 Nipagen (메 틸-p-hydroxybenzoate)의 10% (w/v)의 10 mL를 추가 합니다. 믹스, 다음 일회용 6.0 cm 배양 접시에 접시 당 7 mL 피 펫 젤과 4에서 3-4 h. 저장소에 대 한 실 온에서 건조 수 있도록 비닐 봉지에 0 C.
3. 효 모 제조 법-7 g 건조 효 모, 10 mL 이온된 물 붙여넣기 유니폼 일관성 때까지 주걱으로 섞는다.
4. 타임된 계란 모음 생성 실험 하 고 애벌레를 제어. 를 사용 하 여 새로운, 효 모 얼룩져, 포도 접시는 아침 시간 동안 어둠 속에서 4 시간 실내 온도에 계란 수집 합니다. 이러한 4 h 컬렉션 접시를 제거 하 고 신선한 접시를 바꿉니다. 25에서 하룻밤 4 h 컬렉션 접시를 품 어 때 애벌레의 대부분은가 부 화 다음 날 오후까지 ⁰C. 이러한 첫 번째 탈피 애벌레를 수집 하 고 그들을 사용 하 여 설정 실험.

2. 분석 결과 판 설정

1. 분석 결과 접시의 준비입니다. 분석 결과의 단일 실행에 대 한 5 분석 결과 각각의 접시 10 실험 애벌레와 10 제어 애벌레의 5 접시를 준비 합니다. 1.5 cm 코르크 송곳을 사용 하 여 음식에 대 한 구멍을 만드는 각 접시에서 agar의 중앙 코어를 제거. 효 모 반죽 (0.8-0.9 g)를 구멍에 넣고 구멍을 채우고 마운드 있도록 주걱으로 부드럽게 두 드려.
2. 한 접시 준비-16 g D. melanogaster agar 2 L 유리 비 커에 물 700 mL 이온된 결합 하 고 전자 렌지 전자 레인지에서 5 분 제거 솔루션으로 소화 agar를가지고 유리 막대와 저 어. 10% (w/v) Nipagen 95% 에탄올, 믹스, 17.5 mL을 추가 다음 30 s 파열에 마이크로파 난방 뒤 모든 agar 완전히 녹아 때까지 저 어. 1 분 또는 2에 대 한 멋진 다음 플라스틱 15 mL aliquots 10 cm 플라스틱 접시에. 한 천 젤, 뚜껑 접시 커버 몇 시간 동안 실 온에서 건조 또는 하룻밤 사이 그들을 허용 합니다. 플레이트 18 ° c.에 봉인 된 비닐 봉투에 저장
   참고 1: 때문에 초과 dessiccation 격판덮개의 표면에 Nipagen 결정의 형성을 방지 하려면 접시를 사용 하 여 준비의 몇 일 이내. 필요한 경우, 그들에 95% 알코올 약간 microliters 떨어지고 결정을 다시 해산 수 있습니다.
   참고 2: agar의 배치는 다른 고 속성이 있을 수 있습니다. 건조 젤 판 접촉에 확고 한 천의 깨끗 하 고 그대로 원 코르크 송곳을 사용 하 여 음식 구멍 (위 참조)을 만들 때 제거 될 수 있다 충분히 탄력 해야 합니다.
3. 분석 결과 접시에 애벌레를 설정합니다. 기계적 압력을 사용 하 여 곡선의 플라스틱 microspatula의 팁을 제공 하는 "접착제" 애벌레를 따기 위해 효 모 붙여넣기 팁을 찍어. 첫번째 탈피 애벌레를 개별적으로 선택 하 고 음식 마운드에 가까운 한 접시에 그들을 배치. 모두 실험 10 애벌레와 제어 genotypes의 적어도 5 개의 복제 접시를 준비 합니다. 완료 되 면, 모자 및 라벨 각 접시와 접시 (뚜껑 쪽) 실 온에서 어두운 공간에서 설정할 수 있습니다. (우리 실험실에서이 22 ° C).

3. 모니터링 분석 결과 플레이트

1. 해 현미경 매일 번호판을 검사 하 고 애벌레는 음식 위에 또는 한 천 표면에 수를 기록 합니다. 어떤 눈에 보이는 죽은 또는 죽어가는 애벌레 note 때, 그리고 세 번째 탈피에 애벌레 이동 본은 한 층으로 터널링 하는 경우 note. 참고 날짜는 pupae 형태를 시작 하 고 어떤 번데기 이상이 참고. 모든 애벌레가 죽거나 pupated 때까지 매일 관찰을 계속 합니다.
2. Pupae 신중 하 게에서 제거 접시 휘어 바늘과 포도 접시에 괴 롭 히 고. 원하는 경우, 계속 성인으로 얼마나 많은 eclose를 결정 하는 번데기를 모니터링.

4. 이미징에 대 한 번호판 시험 준비

1. 조심 스럽게 제거 하 고 각 격판덮개의 중앙 우물에서 모든 효 모 식품 폐기.
2. 부드럽게 수돗물으로 각 접시 홍수 하 고 부드러운 예술가 페인트 브러시를 사용 하 여 한 천 표면에 추적 된 파편을 조심 스럽게 문질러. 교체 물 여러 번 하 고 각 플레이트는 완전히 깨끗 한 때까지 부드러운 솔 질 계속 합니다. 플레이트 이온된 수와 최종 린스, 그들 모자 주고 건조 하룻밤 실 온에 둡니다.
   참고: 한 천으로 터널링 하는 것은 음식 마운드 주위 가장 강렬 (그림 2 참조). 그 결과, 음식 구멍의 변죽은 일반적으로 초기 1.5 cm 직경 넘어 확장 됩니다. 또한,이 지역에서 일된 한의 취약성 작은 조각의 터널링된 천 청소 하는 동안 구멍의 둘레에서 손실 될 수 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 도울 수 젤 agar 농도 증가 하지만 이미지 J 정량 단계 (아래 참조) 중 수정 가능.

5입니다. 터널링의 정량

1. 판 이미지. 밝은 흰색 선으로는 agar에 터널을 보기 위하여 검은색에 찍은 각 판의 이미지를 준비 합니다.
   참고: 우리 DNA 젤이이 단계에 대 한 이미지를 일반적으로 사용 되는 시스템을 사용 하 여 참조 테이블의 재료 및 시 약. 대안 영상 디지털 카메라 또는 휴대 전화 카메라와 같은 tiff 파일을 생성할 수 있는 시스템 적당 한 이미지를 생산 하기 위해 조정 될 수 있습니다.
2. 애벌레 터널링 quantitate을 퍼블릭 도메인 프로그램 NIH 이미지 J를 사용 합니다. Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html에서 프로그램을 다운로드. 프로그램에 대 한 자세한 내용은 http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html에가 서.
   참고: 다른 이미징 시스템 quantitate 터널링에 사용 될 수 있습니다. NIH 이미지 제이에 아래의 지침 적용
3. 터널링 플레이트의 tiff 파일 이미지를 연 후 정량 전체 agar 표면 나타냅니다 하지만 접시의 플라스틱 가장자리 밖으로 작물에 대 한 영역을 정의 하는 타원형 도구를 사용 합니다.
4. 검은 선으로 보여주는 터널와 접시의 반전 이미지를 생산 하는 자동 임계값을 적용 합니다. 색상 선택기 및 흰색 페인트 브러시 도구를 사용 하 여 한 천 보다는 터널에 손상을 나타내는 어떤 블랙 영역 밖으로.
5. 분석 풀 다운 메뉴에서 선택 세트 규모 | 규모를 제거 하려면 클릭 다음 (또한 아래 분석) 측정을 설정 창에서 지역 및 임계값 한도확인 하 고.
6. Cntrl 키 + M 키 픽셀에서 검은 영역 (터널)을 표시를 누릅니다.
7. 복사 및 붙여넣기 (예: Excel) 정량 분석을 허용 하는 스프레드시트 프로그램으로 각 접시에 대 한 픽셀 값이입니다.
8. 중앙 구멍은 일반적으로이 지역에서 강렬한 터널링으로 확장 됩니다. Quantitate 누락 된 터널링, "임계값 제한"을 취소 하 고 자동 선택 도구 사용 하 여 중앙 구멍을 정의. Cntrl 키 +이 영역의 픽셀 값을 가져오기 위해 M 키를 누릅니다. 1.5 c m 구멍의 픽셀 값이이 값에서 뺍니다 고 단계 5.6에서에서 얻은 터널링 값 차이 추가 합니다.
9. 일부 번호판에 대 한 중앙 구멍 untunneled agar 구멍에 인접 한 영역을 포함 하는 터널링 된 한 천 조각을 누락 수 있습니다. 이러한 판 사용에 대 한 중앙 구멍을 quantitating 때 색상 선택기 및 페인트 브러시 터널링 된 영역을 정의 하 여 정량에서 터널링 비 지역 제외 누락 지역에 걸쳐 검정색 막대를 추가 하려면 도구.
   참고 1: 실험적인 애벌레 어떤 터널링을 수행 하는 경우이 정량 평균 터널링 격판덮개의 세트 및 제어의 통계 비교에 대 한 값과 실험 값의 계산을 허용 한다.

결과

이 분석 결과의 값의 데모로 서 우리는 그것을 사용 애벌레는 유전자의 장애인 기능에 잠재적인 hypoxia 조사 uninflatable (uif)는 기관에. uif 애벌레 tracheal 셀의 꼭대기 표면에 강하게 표현 되는 큰 막 횡단 단백질을 인코딩합니다. Uif 의 돌연변이 tracheal 오작동 ⁹인 조직 hypoxia 나타낼 수 있는 탈 선 행동을 전시 하 이전 지적 했다. 우리는 특별히 Gal4 UAS 시스템을 사용 하 여 애벌레 기도에 uif 식 억제. 두 Gal4 라인 사용 되었다: i) 숨 (btl)-Gal4 그들의 배아 개발 및 ii의 시작 부분에서 기관에 강하게 표현) (ue)를 잘라-Gal4 식의 작은 후부 지역에서 시작 embryogenesis의 끝에 주요 지 트렁크 한다 애벌레 생활 ⁷에 걸쳐이 지역에 강한 식 계속 됩니다. UAS-uif RNAi 라인 비엔나 초파리 연구 센터 (VDRC ID #1050)에서 얻은 했다.

위의 프로토콜에 설명 된 대로 5 애벌레 설정 4 십자가의 각 다음과 같이 새로 부 화 첫 탈피의 번호판을 복제 합니다.

실험 1
1) 제어 1-(ue)를 잘라-Gal4 구획-S (+) x
2) 실험 1-(ue)를 잘라-Gal4 x UAS-uif RNAi

실험 2
3) 제어 2- btl-Gal4 구획-S (+) x
4) 실험 2- btl-Gal4 x UAS-uif RNAi

컷(ue)의 동작-Gal4 > 실험 1의 UAS-uif RNAi 애벌레는 컨트롤 컷(ue)의 비교 되었다-Gal4 > + 내, 터널링 및 pupation, (그림 1 생존 동물 및 그림 2). 대조적으로, 초기에 개발 (실험 2)에서 전체 tracheal 시스템 전체 다운 규제 uif 식 생산 현저 하 게 다른 응답. Btl-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 표시 모두 행동 발현의 조직 hypoxia-식품 내 고 나중에 애벌레(그림 1 및 그림 2 터널링 하는 층의 총 부재 감소 ). 실험적인 애벌레 또한 눈, 얇은 및 컨트롤 (그림 3) 보다 더 부진 했다 고 분석 결과의 과정 동안 높은 사망률을 보였다. 위에서 설명 했 듯이, 감소 성장 부진, organismal 죽음 애벌레 저 산소 증의 증상으로 알려져 있습니다. 또한, 실험 애벌레 pupation 시도를 실패 하 고 남아의 대부분으로 3 탈피 애벌레 긴 후 제어 애벌레 pupated 했다. 일부 애벌레는 결국 용 (그림 1A) 없이 죽기 전에 15 일 이상 살아 남았습니다. 실험적인 애벌레의 몇 가지 pupate 했지만 모든 경우에 비정상적인 pupae 가능한 성인을 생성 하지 않았다 형성 되었다.

그림 1입니다. 음식 내와 애벌레 개발의 정량입니다.
(A) 4 genotypes 여기에 공부에 대 한 음식 고 분 외부 라이브 애벌레의 백분율입니다. 5 분석 결과 번호판 각 유전자 형에 대 한 사용에 대 한 평균을 표시 됩니다. Btl의 ~ 70% 부 화 후 3 일-Gal4 > 음식 또는 다른 3 genotypes agar 표면에 아무 애벌레 발견 된 반면 UAS uif RNAi 애벌레는 음식 밖에 있었다. Btl-Gal4 > UAS uif RNAi 애벌레 죽을 천천히 살아 그들의 ~ 15 %4-20 일 사이 부 화 후 15 일. X 축 따라 검은색 화살표 여기 고 (B)에 3 개의 다른 genotypes의 모든 애벌레 pupated 했다 하루를 나타냅니다.
(B) 죽은 애벌레 4 genotypes 위해 외부 표시의 백분율입니다. 각 유전자 형에 대 한 분석 결과 5 판에 대 한 평균을 표시 됩니다. 죽은 btl-Gal4 > UAS uif RNAi 애벌레 대부분 죽어 시간이 지남에 축적 음식 밖에. 모든 다른 genotypes pupation 생존
(C) 비율 생존 pupation 4 genotypes에 대 한 공부. 각 유전자 형에 대 한 분석 결과 5 판에 대 한 평균을 표시 됩니다. Btl의 정상적인 pupae 없음-Gal4 > UAS uif RNAi 유전자 형이 생산 되었다. 그림을 통해 오차 막대 SEMs를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 애벌레 터널링의 정량입니다.
(A) 모든 4 개의 genotypes에 대 한 분석 결과 번호판의 예 정량 터널링에 대 한 준비 후 공부. Btl에 대 한 터널링의 완전 한 부재를 참고-Gal4 > UAS uif RNAi 애벌레. 분석 결과 플레이트는 10 cm 배양 접시.
(B) 터널링 정량 4 genotypes에 대 한 이미지 J에서 파생 된. 각 유전자 형에 대 한 분석 결과 5 판에 대 한 픽셀 값을 평균입니다. Btl에 대 한 관찰 되었다 아니 터널링-Gal4 > UAS uif RNAi 애벌레. 오차 막대 SEMs =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. Btl의 비교-Gal4 > UAS uif RNAi 및 btl-Gal4 > + 애벌레
Btl에 대 한 비슷한 나이 (부 화 후 6 일)의 애벌레-Gal4 > UAS uif RNAi (A) 및 btl-Gal4 > + genotypes (B). 빨간색 화살표 등 트렁크 한다 가리킵니다. 두 애벌레 같은 배율에서 몇 군데입니다. 눈금 막대 = 0.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

우리 여기에 D. melanogaster 애벌레 조직 hypoxia을 감지 하도록 설계 된 간단한 분석 결과 제시 했습니다. 진단 초기 애벌레 생활 및 애벌레 생활에서 늦게 터널링 하는 층의 부재에 음식 고 분으로 감소 내 기반으로 합니다. 애벌레 크롤 링 음식 소스에서 조 마이그레이션을 발생할 수 있으며 따라서 분석 결과의 하나의 중요 한 측면은 적은 수 애벌레의 큰 초과 음식 존재 분석 됩니다. 균 메 틸-p hydroxyl benzoate (Nipagen)의 한 천 배지를 포함 분석 결과 중 곰 팡이 성장을 방지 하기 위해 필수적 이기도 합니다.

보면 한 천 배지 분석 결과 있는 가변성의 원천이 될 수 있습니다. 일반적으로, 애벌레, 애벌레의 다른 컬렉션 또는 부모의 다른 배치에서 동일한 유전자의 분석 결과에 그들의 행동에 비교적 제한 된 변화를 보여줍니다. 반면, 한 천 배지 또는 다른 일에 만들어진 agar의 다른 배치와 터널링에 차이 얻을 수 있습니다. 한 규정 따라서 제어 하 고 실험적인 애벌레 모두 테스트 해야 동일한 배치 준비에서 한 천 배지를 사용 하 여. 다른 제조 업체에서 한 천 또는 동일한 제조에서 심지어 출하 고 그들의 힘에 다를 수 있습니다 하 고 그래서 여기 최적의 젤을 달성 하는 데 사용 하는 2.2%에서 위쪽으로 agar 농도 조정 해야 할 수 있습니다. 우리는 야생 타입 애벌레 3% 한 천 젤을 통해 쉽게 뚫 수 있습니다 나타났습니다.

이 분석 결과의 가치를 입증, 우리는 그것를 사용의 억제 기능을 가진 애벌레에 잠재적인 조직 hypoxia 조사 uninflatable . 기관에 우리의 발견이이 유전자의 tracheal 식의 손실 산소를 생산할 수 있는 가설에 대 한 강력한 지원을 제공: btl-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 음식과 층 동안 터널링의 완전 한 부재에 뚫으 보여 세 번째 탈피입니다. 우리의 이전 연구에서 다른 genotypes의, 우리는 hypoxia 유발 손실 음식 내 층 터널링의 손실 및 btl로 완전 하지 않습니다 관찰-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 공부 여기 유사 하 게 행동. 이 분석 결과의 실패 한 터널링 구성 요소는 그러므로 산소의 강한 표시를 제공 한다.

비록 btl-Gal4 > uif RNAi 애벌레 행동 특성을 보였다는 잘라(ue) 저 산소 증의 진단-Gal4 > UAS-uif RNAi이이 이상이 전시 하지 않았다. Btl 고 잘라(ue) Gal4 드라이버 다른 단계에서 그리고 애벌레 기관 내 다른 패턴에 표시 됩니다. Btl-Gal4 드라이버 embryogenesis에 그것의 개발에서 시작 하 고 애벌레 생활을 통해 계속 tracheal 시스템을 통해 표현 된다. 반면,는 잘라(ue)에서 Gal4 식-Gal4 드라이버만 한다의 morphogenesis 후 미 발달 생활의 끝에 시작 하 고 지 느 러 미 줄기의 주요 경도 혈관의 극단적인 후부 섹션으로 제한 됩니다 tracheal 시스템입니다. uif 최저 Gal4 줄으로 줄일 수 없습니다 따라서 uif 식 일찍 충분히 또는 광범위 하 게 동작을 실행 하는 데 필요한 산소의 일부 임계값을 생성 하기에 충분이 분석 결과 측정.

이전 연구 3 탈피 애벌레 (10%) 산소의 저급에 노출 감소 성장을 보여을 발견 하 고 pupariation ¹⁴의 발병을 지연. Btl-Gal4 > 세 번째 탈피에 UAS-uif RNAi 애벌레 여기 공부 진행 하지만 그들의 성장과 pupation 요금에 효과 더 발음 했다: 그들은 컨트롤과 아래 아주 작은 지방 조직 보다 상당히 작은 표 (그림 3) 피와 유일한 작은 분수 (~ 10%)는 pupariation을 시도 했다. 이 차이 제안 btl-Gal4 > uif 최저는 기관에 그들의 전체 애벌레 생활 내내 존재 했다 또는 그것을 더 생산 하기 때문에 UAS-uif RNAi 애벌레 hypoxia의 훌륭한 정도 경험 세 번째 탈피에 심각한 산소 박탈 합니다. 어떻게 uif 함수는 기관에서의 손실 되지 않도록 산소 운반은 불분명이 시점에서. Btl의 기관-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 표 피 (그림 3), 그들은 공기를 포함 하 고 액체 항목 기능 손상 지점 손상 되지 했다 표시를 통해 쉽게 볼 수 있었다. 그것은 공식적으로 가능한 그러므로 uif 기능의 손실에 의해 만들어진 tracheal 손상 hypoxia 하지만 오히려 몇 가지 다른 결함 억제 터널링을 유도 하지 않는. Genotypes 이전 공부, 우리가 늦은 제 3 탈피 애벌레 ¹⁵에 터널 실패는 LDH mRNA⁷의 높은 수준, 분해 하 고 산소의 정식 표시기와 관련 된 결정. Btl에 대 한 산소의 따라서, 최종 확인-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 (와 나중에 검사 하는 애벌레에서이 분석 결과의 사용) RT-PCR LDH mRNA 수준 또는 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 표시기의 사용을 평가 하기 위해 포함 세포내 산소 수준 (예를 들어 참조 ¹⁶).

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification