양전자 방출 단층 촬영 (PET) Radiotracer 합성 프로토콜의 임상 생산을 위한 자동화

요약

양전자 방출 단층 촬영 (PET) 이미징 사이트 여러 초기 임상 연구 실험에 관련 된 강력 하 고 다재 다능 한 radiotracer 제조 능력을 필요 합니다. Radiotracer [¹⁸F]를 사용 하 여 Clofarabine 예를 들어, 우리 자동화 radiotracer 유연한, 카세트 기반 radiosynthesizer를 사용 하 여 합성 하 고 합성 임상 사용에 대 한 유효성을 검사 하는 방법을 보여 줍니다.

초록

새로운 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 추적기 개발 연구자와 임상 이미지는 점점 더 다양 한 생물학 목표 및 프로세스의 사용 이다. 그러나, 다른 추적기의 증가 radiopharmacies에서 그들의 생산에 대 한 문제를 만듭니다. 동안 역사적으로 그것은 사용자 정의 구성 radiosynthesizer와 각 개별 추적 프로그램의 반복된 생산에 대 한 핫 셀 실용적인, 그것은이 워크플로 변경 하는 데 필요한 되고있다. 각 추적기에 대 한 일회용 카세트/키트에 따라 최근 상업 radiosynthesizers 사용자 지정 추적 프로그램 관련 수정에 대 한 필요성을 제거 하 여 장비의 1 세트를 가진 여러 추적기의 생산을 단순화 합니다. 또한, 이러한 radiosynthesizers의 일부 개발 상용 키트를 구입 하는 것 뿐만 아니라 그들의 자신의 합성 프로토콜을 최적화 하는 연산자를 사용 합니다. 이 프로토콜에서 이러한 radiosynthesizers 중 하나에 새로운 애완 동물 추적 프로그램의 수동 합성을 자동화 하는 방법에 대 한 일반적인 절차를 설명 하 고 임상 등급 추적기의 생산에 대 한 검증. 예를 들어, ELIXYS radiosynthesizer, 애완 동물 추적 프로그램 개발 노력, 뿐만 아니라 일상적인 임상 프로브 제조 [¹⁸F]를 생산 하는 동일한 시스템에서 지원할 수 있는 유연한 카세트 기반 radiochemistry 도구 사용 Clofarabine ([ ¹⁸ F] CFA), vivo에서 deoxycytidine 키 니 아 제 (dCK) 효소의 활동을 측정 하는 애완 동물 추적기. 수동 합성 변환 다음 직관적인 화학 합성기 소프트웨어에서 지 원하는 "단위 작업"으로 번역 하는 기본적인 radiochemistry 프로세스에 합성 프로토콜 부셔 포함 됩니다. 이 작업 다음 빠르게 변환할 수 있습니다 자동된 합성 프로그램으로 드래그 앤 드롭 인터페이스를 사용 하 여 그들을 조립 하 여. 기본 테스트 후, 합성 및 정화 절차 원하는 수율 및 순도 달성 하기 위해 최적화를 해야 합니다. 일단 원하는 성능을 달성 종합의 유효성 검사 임상 사용을 위한 radiotracer의 생산에 대 한 적합성을 결정 하기 위해 수행 됩니다.

서문

생물 학적 목표의 증가 배열을 동적으로 생활에 구상 될 수 있다를 통해 분자 이미징 적임 벧 전 과목 애완 동물¹이미지 이전 주제에 주입 특정 radiotracers (분자 양전자 방출 방사성으로 표시)을 사용 하 여 특정 생물 학적, 약리 생화학, 프로세스의 비보에 분석을 제공 합니다. 다양 한 기초 과학 및 임상 연구^2,3,4, 그리고 발견, 개발, 및 환자 치료^5, 약물의 임상 사용에서 이러한 프로세스를 공부 하는 애완 동물의 증가 사용 ⁶, 다양 한 radiotracers^7,8에 대 한 수요를 이끌고 있습니다. radiochemist에 방사선 노출을 피하기 위해 그리고 이러한 단기 추적기의 재현 생산을 보장 하기 위해, 그들은 일반적으로 "핫 셀" 내부 운영 자동화 된 radiosynthesizer를 사용 하 여 제조 됩니다. 최근 radiosynthesizers 또한 간단 하 게 하 여 카세트^{9 radiotracers의 여러 종류를 준비 하는 유연성을 제공 하면서 임상 등급 제조 준수 작업을 단순화 하기 위해 일회용-카세트/키트 구조를 사용 하 여} . 그러나, 초기 임상 단계에는 일반적으로 자동된 radiosynthesis;을 수행할 수 없습니다 상용 카세트/키트 따라서, 애완 동물 의약품 제조 시설 cGMP 급 추적 프로그램 생산 기능 적당 한 시간 내 고 적당 한 비용에 구현 하는 시스템을 사용자 지정 하 고 투 한다. 따라서, radiosynthesizers 개발 되었다 카세트/키트 아키텍처 개발 및 추적기의 최적화 기능을 결합 하는.

ELIXYS 플렉스/화학 (ELIXYS)는 다양 한 시 약, 용 매, 및 반응 온도 호환성¹⁰유연한 카세트 기반 radiosynthesizer의 예입니다. 그것은 3 개의 반응 용기 있으며 동적으로 어떤 특정 합성 프로토콜¹¹에 따라 유체 통로 구성 하는 로봇 메커니즘을 사용 하 여. 합성기 소프트웨어 끌어서 놓기 트랩 동위 원소, 동위 원소 Elute, 추가 시 약, 반응, 단위 작업 으로 다른 추적기에 대 한 합성 프로그램 (시퀀스)의 생성을 허용 그리고 증발¹². 각 단위 작업 기간, 온도또는 압력 (압력)를 운전 하는 불활성 가스와 같은 연산자를 사용할 수 있는 프로그래밍 가능한 매개의 다양 한 있다. 각 단위 작업의 특성을 이해 함으로써 수동 합성 단위 작업 시퀀스로 쉽게 번역 될 수 있다 고 프로토콜¹³의 최적화 하는 동안 수정할 수 있습니다. ELIXYS 순수/폼 모듈과 함께, 통합된 시스템 자동된 정화 및 애완 동물 추적 프로그램의 정립도 수행할 수 있습니다. 이 radiosynthesizer를 사용 하 여, 우리가 이전에 보고 된 24 다른 ¹⁸F 라는 추적기와 prosthetic 그룹^11,,1415,16, 자동된 합성으로 뿐만 아니라 생체¹⁷, 시 약 및 시스템의 구성 안을 단순히 변경 하 여 자동된 효소 radiofluorination. 다른 사람 [¹⁸F] 자동된 합성 나타났습니다 neurofibrillary의 이미징에 대 한 RO6958948¹⁸, prosthetic 그룹 [¹⁸F]의 자동된 합성 tangles F-평-TFP와 펩 티 드^{19의 후속 라벨} , 및 [¹⁸F]의 자동된 종합 AM580 (PDE10A) 포스 10a의 이미징에 대 한²⁰. 또한, 여러 그룹 나타났습니다 추적기의 생산 등 4-[¹⁸F] 임상 사용을 위해 적당 한 Fluorobenzyl triphenylphosphonium ([¹⁸F] FBnTP) 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인²¹, [의 이미징에 대 한 ¹⁸ 전립선 특정 막 항 (PSMA)²², 그리고 [¹⁸F]의 이미징에 대 한 F] DCFPyL THK-5351 타우²³의 이미징에 대 한.

이 문서에서 사용 하는 우리의 경험과 한 [¹⁸F] 어떻게 수동 radiosynthetic 절차 번역 될 수 있습니다 straightforwardly 그리고 급속 하 게 일상적인 생산 cGMP 지침에 적합 한 자동된 합성으로 설명 하기 위해 CFA. 추적 프로그램 [¹⁸F] CFA dCK 활동의 이미징에 대 한 설계 되었습니다. [¹⁸F]의 수동 radiosynthesis CFA 슈 외 에 의해 원래 기술 되었다 두 반응 용기, 중간 실리 카 카트리지 정화, 최종 HPLC 정화를 사용 하 여 프로시저로 ²⁴ 단계 ( 보충 자료를 자세한 내용은 섹션 1 을 참조). 최근 체 외에서 및 전 임상 연구, dCK이 추적의 뛰어난 특이성 나타났습니다 그리고 처음에 인간 연구 유리한 biodistribution²⁵나타났습니다. 넓은 규모 임상 연구를 [¹⁸F]의 감도 확인에 대 한 즉각적인 관심 있다 CFA 애완 동물 dCK 활동에서 변화와 장기적인 관심이이 추적 프로그램²⁶의 잠재적인 임상 응용 프로그램을. T 세포 활성화를 방 아 쇠, DNA 손상 유도 하거나 dCK 종속 nucleoside 아날로그 prodrugs에 의존 하는 치료를 위한 유용한 biomarker 일지도 모른다. 특히, [¹⁸F] CFA Clofarabine 치료에 대 한 잠재적인 응답에 대 한 환자의의 계층을 사용 수 있습니다. [¹⁸F] CFA는 연구와 임상으로 전진 dCK 억제제의 개발도 용이 하 게 수 있습니다. 이 추적 프로그램은 수동으로 합성 되어 전통적으로, 이후 [¹⁸F] 안정적이 고 자동화 된 합성 필요 합니다 이러한 모든 연구 발전 CFA 임상 용으로 적합.

전 임상 연구¹⁶,이 프로토콜에 대 한 CFA 빌드 우리가 이전 [¹⁸F] 자동된 합성을 보고 이러한 노력에 추가 하 고이 트레이 서의 임상 생산에 필요한 추가 수정에 설명 합니다 완전 자동화 된 정화와 배합, 프로토콜 유효성 검사 및 품질 관리 테스트의 통합을 포함 하 여. 여기 설명 하는 일반적인 절차는 자동화 되 고 임상으로 적합 한 [¹⁸F] 합성 개발에 국한 되지 않습니다 CFA 개발 자동화 종합 기타의 임상 사용을 위해 적당 하 간단 방식으로 일반화 될 수 있다 하지만 radiotracers 불 소 18로 표시입니다.

프로토콜

1. 일반 절차는 자동화 및 임상 제조를 위한 Radiosynthesis 프로토콜의 유효성 검사에 대 한

1. 임상 제조 하기 위한 수동 합성 체계의 자격 분석
   1. 모든 원치 않는 잔류 화학 물질과 제품 오염의 위험 분석을 수행 합니다.
      1. 클래스 1 용 매 벤젠 등을 방지 하 고 적절 한 대안 용 매 (Class 2 또는 Class 3)와 그들을 대체.
      2. 화학 물질을 잠재적인 잔여 불순물으로 최종 배합에 감지 하기 어려운 것을 하지 마십시오.
      3. 고 순도 등급 (USP 또는 Ph.Eur. 학년 원하는)에서 상업적으로 사용할 수 있는 분석의 인증서와 함께 제공 됩니다 유일한 화학 물질을 선택 합니다.
   2. 어떤 바람직하지 않는 화학 물질이 나 용 매 위험 분석에 의해 감지 하 고 아무도 남아 섹션 1.1 반복 합성 구조를 구체화 합니다.
2. 자동화 합성 프로토콜
   1. 경우 같은 합성기를 사용 하 여 추적 프로그램에 대 한 자동화 된 프로토콜 이미 생성 되 고 있는 온라인 저장소에 업로드, 합성 프로그램의 사본을 다운로드 하십시오.
   2. 자동된 합성 프로그램 이미 존재 하지 않는 경우 만듭니다.
      1. 종이 펜을 사용 하 여, 높은 수준의 단계 나눌 수동 합성 (예:, 건조/활성화 [¹⁸F] 불 소, 방사선 화학 반응, 정화 단계, 등 수행을 촉진 하기 위하여 난방.). 더 필요한 개별, 기본 프로세스에 높은 수준의 단계를 나눈다. 예를 들어, [¹⁸F]의 합성 계획 CFA는 그림 1에 표시 된, 고급 단계 식별 그림 2A에 표시 됩니다 및 프로세스로 분석 그림 2B에 표시 됩니다.
      2. 종이 펜을 using 합성기 소프트웨어에서 제공 하는 개별 단위 작업으로 각 프로세스를 매핑하십시오. 예를 들어, 기본 프로세스 [¹⁸F]의 합성에서의 매핑의 분석 합성기 소프트웨어¹³ 에서 적당 한 단위 작업에 CFA 그림 2C에 표시 됩니다.
      3. Radiosynthesizer 프로그래밍 인터페이스를 사용 하 여 빈 프로그램 만들고 메뉴 버튼 (왼쪽 상단)을 클릭 하 고 시퀀스를 선택 하는 새로운 클릭 하 여 각각의 식별된 단위 작업 시퀀스에 추가 시퀀스 버튼. 1.2.2.2 단계에서 식별 된 각 단위 작업에 대 한 슬라이드 보기와 클릭 또는 단위 작업의 각 매개 변수에 원하는 값 작성 형식에 사용 가능한 작업에서 단위 작업을 끕니다. 그림 3 인터페이스의 예를 보여 줍니다 때 모든 작업 [¹⁸F] 합성을 CFA 구성 되었습니다, 그리고 사용자가 선택한 매개 변수 값을 편집 하려면 첫 번째 반응 단위 작업. [¹⁸F]에 대 한 최종 합성 프로그램 CFA 보충 자료, 테이블 s 1 과 s 2에서 설명.
   3. 합성 프로그램을 확인 합니다.
      1. 드라이 실행을 수행 합니다. 설정 하 고 실행 단계에서 프로그램 2.1-2.3를 사용 하 여 모든 시 약 및 용 매 이외의 방사성 핵 종 (예: [¹⁸F] 불 소) 예상 되는 동작을 확인 합니다.
      2. 필요한 경우 조정 단위 작업 매개 변수 값 (예: 시간 또는 완전히 전송 시, 원하는 수준, 등을 용 매를 증발 시간/온도를 운전 압력), 프로그램에서 다시 테스트. 매개 변수 값을 조정 하려면 먼저, 메인 메뉴 (왼쪽 상단)에서 시퀀스 를 선택 하 여 편집 모드를 반환 하 고 새로 만든된 프로그램을 선택 합니다. 다음, 슬라이드 보기 (화면 하단)에서 원하는 단위 작업 클릭, 탐색 하 여 원하는 매개 변수 고 선택 하거나 새 값을 입력 합니다.
   4. 낮은 활동 (< 370 MBq) 테스트 프로그램 평가를 실행을 수행 합니다.
      1. 수확량, 합성, 반복성, 시간과 다른 원하는 측정 결과 개선 하기 위해 매개 변수 값을 조정 하 여 자동된 합성을 최적화 합니다.
3. 품질 관리 (QC) 테스트 절차를 개발
   1. 사용 최종 제품의 비 방사성 참조 및 잠재적인 화학 불순의 샘플, 개발 분석 라디오 HPLC 및/또는 라디오-얇은의 결정에 대 한 종의 충분 한 분리 층 크로마토그래피 (TLC 라디오) 메서드 화학 순수성, 어 금 니, 방사선 화학 순수성, 활동과 방사선 화학 신원. 반복성 및 선형에 대 한 분석 방법의 유효성을 검사 하 고 탐지 및 정량화 한계를 결정 합니다.
   2. 마찬가지로, 개발 하 고 휘발성 불순물 (예를 들어, 합성 하는 동안 사용 되는 용 매에의 잔여 금액)을 분석 하는 가스 크로마토그래피 방법의 유효성을 검사 합니다.
   3. 개발 및 검색 및 기타 잠재적인 불순물 (예를 들어, cryptand 222 통해 표준 색상 자리 테스트)의 정량화를 허용 하는 분석 분석 실험의 유효성을 검사 합니다.
   4. 불 임, 산도, radionuclidic id, radionuclidic 순수성, 방사능 농도, 제품 볼륨, 및 내 레벨의 결정에 대 한 표준 절차를 사용 합니다.
4. 합성 유효성 검사 수행
   1. 합성 및 QC 테스트 절차에 대 한 표준 운영 절차 (Sop)를 설정 하 고 자료를 통합 및 장비 추적 시스템 준수-현재 좋은 제조 관행 (cGMP) 요구 사항.
   2. 합성 절차는 Sop에 따라 임상 제조에 대 한 의도 한 대로 동일한 방사능 수준에서 통해 3 독립적이 고 연속 생산 실행을 확인 합니다. 종합 성능 및 품질 관리 테스트의 결과 문서화 합니다.
   3. 모든 연속 유효성 검사 실행 pre-set QC 제한을 통과 해야 합니다. 유효성 검사 실패를 실행 하는 경우 적절 하 게 실패의 근본 원인을 해결 한 후 전체 유효성 검사 프로세스를 반복 합니다.

2. 예: 임상 사용에 대 한 [¹⁸F] CFA의 합성 자동화

1. radiosynthesizer을 준비
   1. 파워는 radiosynthesizer에.
   2. 불활성 가스 공급 충분 한 압력으로 설정 되어 있고 필요한 밸브는 열려는 radiosynthesizer 가스 공급 장치에 연결 되어 있도록 확인 하십시오.
   3. 반응 기 # 1과 #2 위치에서 새로운 일회용 카세트를 설치 하 고 자기 볶음 바 포함 된 반응 혈관 삽입. 각 카세트 전송 딥 튜브 곧장 가리키는 확인 하십시오.
   4. 시 약 유리병을 준비 하 고 그림 4의 다이어그램에 따라 카세트에 설치.
   5. 빈 [¹⁸O] 설치 카세트 # 1의 W1 위치에 H₂O 복구 유리병.
   6. 제 사기 methylammonium (에서는) 카트리지를 활성화 처음에 의해 전달, 그것을 통해 1 M KHCO₃ 솔루션의 12 mL 이어서 이온된 물 12 mL. 그것을 통해 에틸 아세테이트의 5 mL을 전달 하 여 실리 카 9 월-박 카트리지를 조건.
   7. 카트리지를 연결 하 고 그림 5A와 같이 모든 카세트 배관 연결을 확인 합니다. 없는 카세트 튜브 (를 포함 하 여 사용 하지 않는 튜브) 인테리어, 어디 그것은 로봇의 움직임을 방해할 수 있는 응답을 확인 합니다.
   8. 카세트 # 1 [¹⁸F] 불 소 입력된 라인에는 싸이 클 로트 론에서 [¹⁸F] 불 소 소스 라인을 연결 합니다.
   9. 폐기물 컨테이너 비어 확인 하십시오. 장소 폐기물 라인 정화/배합 하위 시스템에서 폐기물 컨테이너 (즉, 샘플 루프 1 폐기물, HPLC 하위 시스템 폐기물 라인, 라인과 주사기 펌프 폐 선).
   10. HPLC 입력된 라인에 연결 합니다. 장소 HPLC 모바일 단계 25 m m 염화 아세테이트 및 HPLC 모바일 위상 입력된 라인 "B" EtOH 컨테이너에서 컨테이너에 선 "A"를 입력합니다.
   11. Equilibrate 정화/배합 하위 시스템 및 HPLC 열.
       1. 메인 메뉴 (왼쪽 상단)에서 HPLC 를 선택 하 여 소프트웨어에서 정화/배합 모듈에 대 한 제어 페이지를 엽니다. 기본적으로 정화 탭에서 이미 선택 됩니다. (이 페이지는 그림 6에 표시 됩니다.)
       2. 정의 용 매 조성에 5.0 mL/min 유량 설정 하 고 정화 열에 설치 된 열 위치를 선택 합니다. 적어도 10 분 동안 isocratic 모드에서 HPLC 펌프를 켭니다.
       3. 린스 제품 라인 및 모바일 단계 1 분에 대 한 각 모든 분수 컬렉션 라인.
       4. 각 HPLC 샘플 루프 및 HPLC 샘플 루프 전송 10 mL 주사기를 사용 하 여 모바일 단계와 튜브를 헹 굴.
   12. 정화/배합 하위 시스템 주사기 펌프 입력된 라인에 연결 합니다. 사용은 Elute 라인과 Reconstitute 선 0.9% 식 염 수에 대 한 염화 나트륨 (90 mg/mL)을 집중.
   13. 정립 서브 프라임.
       1. 정화/배합 제어 페이지의 배합 탭으로 이동 합니다.
       2. 집중된 나트륨 염화 물 (90 mg/mL)를, 보도 주사기 펌프를 초기화 하려면 초기화 Elute 탭을 선택 합니다. 5 mL를 분배.
       3. 0.9% 식 염 수를, 다시 구성 탭 분배 5 mL을 선택 합니다.
   14. T-연결에서 정화/배합 하위 시스템의 전면에서 제품 그리고 최종 제품 라인을 연결 합니다. 살 균 필터 (0.22 μ m)는, 차례 차례로, 최종 멸 균 제품 유리병에 연결 되어 T-연결의 출력을 연결 합니다. 최종 제품 유리병의 headspace에 살 균 필터 환기 바늘을 삽입 합니다. 최종 시스템 설정의 사진 그림 5B에 표시 됩니다.
   15. 콜드 트랩에 드라이 아이스와 EtOH 또는 MeOH를 추가 합니다.
2. 합성 프로그램 실행
   1. 메인 메뉴 버튼 (맨 왼쪽)에서 시퀀스 를 선택 하 여 프로그램의 목록으로 이동 합니다. [¹⁸F] CFA 프로그램을 선택 하 고 실행 버튼을 눌러 프로그램을 시작 합니다.
   2. 신중 하 게 미리 실행된 검사 목록에 각 항목을 통해가 고 그들은 완료 되는 대로 그들을 확인. 사전 실행된 검사 목록 화면의 일부는 그림 7에 표시 됩니다.
   3. 계속 설치 완료 되 면 확인을 누르고 시작 자동된 합성을 발생할.
      1. 원하는 경우, 모니터링에 합성 시각적 피드백 (반응 기 카메라), 센서 판독값 (예: 온도, 압력, 진공, 방사선 읽기, 등) 및 카운트 다운 타이머를 통해 실시간으로. 그림 8에 대표적인 화면 표시 됩니다.
      2. 정화 장치 작업 중 제품 피크 방사선 검출기 크로마에 게재 하기 시작 했다 때 제품 을 선택 합니다. 이 단위 작업 중 대표적인 스크린샷 (포함 하는 UV 검출기 및 방사선 검출기의 크로마 출력) 그림 9에 표시 됩니다.
      3. 일단 방사선 검출기 크로마 피크는 기준선에 반환에, 폐기물 컨테이너를 HPLC 시스템의 흐름 경로 다른 곳으로 낭비 를 선택 합니다.
3. 배합 프로그램을 실행 하 고
   1. 프로그램 (시퀀스 화면) 목록에서 열는 [¹⁸F] CFA 배합 프로그램.
   2. 공식 단위 작업의 매개 변수를 조정 합니다.
      1. HPLC 펌프 유량과 분수 컬렉션 기간에 따라 수집 된 제품 분수 (V_분수)의 볼륨을 계산 합니다.
      2. Isotonicity를 달성 하 고 10 %EtOH 농도 희석 하는 데 필요한 추가 염 분의 양을 계산 하는 데 필요한 추가 나트륨 염화 (90 mg/mL)의 볼륨을 계산 합니다.
      3. 이러한 값으로 프로그램을 수정 합니다. 염화 나트륨 (90 mg/mL)의 볼륨 Elute 단계에 대 한 입력 하 고 염 분의 볼륨 다시 구성 단계에 대 한 입력 됩니다. (계산 보충 자료, 그림 s 2에 설명 되어 있습니다.)
      4. 프로그램을 저장 합니다.
   3. 프로그램을 실행 합니다. 시스템은 염화 나트륨 및 염 분 배합의 isotonicity를 확인 하 고 살 균 제품 유리병에 살 균 필터를 통해 그것을 제공 하는 수집된 정제 제품 분수를 희석 것 이다.
4. 수집 공식화 [¹⁸F] 품질 관리 및 출하에 대 한 CFA
   1. 핫 셀에서 공식화 [¹⁸F] CFA 제품을 제거 합니다.
   2. 무 균 작업 기법을 사용 하 여, 품질 관리 테스트를 수행 하려면 2 개의 샘플 (300 µ L) 철회.
   3. 첫 번째 예제를 사용 하 여 어떤 성장을 관찰 하지 않고 유체 thioglycolate 미디어와 14 d tryptic 간장 국물을 접종 하 여 최종 배합의 불 임에 대 한 테스트.
   4. 1.3 단계에서 개발 하는 절차에 따라 품질 관리를 수행 하기 위해 두 번째 예제를 사용 합니다. 미국 약전 따라 UCLA Ahmanson 생명 사이클 로트 론 시설 설립 절차는 아래 설명 되어 있습니다.
      1. 육안 검사에 의해 외관을 평가 합니다.
      2. 산도 표시기 용지를 평가 합니다.
      3. 운동 비 세균성 내 테스트 (내기)을 사용 하 여 세균성 내 콘텐츠를 평가 합니다.
      4. 방사선 화학 id 분석 라디오-HPLC를 방사성 샘플 및 비 방사능 기준 복합의 공동 차입을 확인 하 여 평가 합니다.
      5. 원하는 제품에 해당 하는 AUC와 감마 검출기 크로마 방사성 불순물의 곡선 (AUC) 아래 영역을 비교 하 여 방사선 화학 분석 라디오-HPLC 순도 평가 합니다.
      6. 모든 자외선 활성 불순물의 UV 검출기 크로마에 AUC를 결정 하 여 화학 분석 HPLC 순도 평가 합니다.
      7. 어 금 니 활동 및 캐리어 질량 분석 라디오-HPLC와 AUC UV 검출기 크로마에 원하는 제품에 해당 하 여 평가 합니다.
      8. 두 개의 서로 다른 timepoints에 그것의 활동을 측정 하 고 감퇴 곡선 피팅 하 여 프로브의 반감기를 평가 합니다.
      9. 가스 크로마토그래피에 의해 정립의 잔류 용 제 콘텐츠를 평가 합니다.
      10. 방사성 핵 종 에너지 감마 분 광 계를 사용 하 여 평가 합니다.
      11. TLC-기반 현장 테스트를 사용 하 여 cryptand 222 콘텐츠를 평가 합니다.
   5. 모든 테스트를 통과 하는 경우 임상 이미징 사이트에 선적을 위한 프로브 배합을 놓습니다.
5. 이후 실행 및 시스템 종료
   1. 린스 사용 제품 70% (v/v) 물에 EtOH 컬렉션 튜브 HPLC 정화 열 다. 이 비슷한 단계 2.1.12 순수/양식 컨트롤 페이지와 함께 할 수 있습니다.
   2. 종료 를 통해 radiosynthesizer 소프트웨어에 전원 버튼. 시스템의 전원을 끌 수 있습니다 때 팝업 창이 표시 됩니다.
   3. 적절 한 차단 밸브를 닫아 압축 공기 및 불활성 가스 장치를 해제 합니다.
   4. 핫 셀 (일반적으로 하룻밤) 부패에서 잔여 방사능에 대 한 시간을 허용 합니다.
6. 청소는 radiosynthesizer
   1. 제거 하 고 모든 카세트, 카트리지, 반응 기 튜브와 합성 하는 동안 사용 하는 시 약 병의 처분.
   2. 콜드 트랩의 내용이 비어 있습니다.
   3. 정화 하위 시스템 유체 경로 청소.
      1. 기존의 청소 프로그램을 열거나 청소 모드 (즉, 청소 확인란을 선택한)에서 하나의 정화 단위 작업을 포함 하는 새로운 프로그램을 만들. 보충 자료, 그림 S9 예제를 참조 하십시오.
      2. 매개 변수 구성 페이지에서 선택 열 정화와 70%를 포함 하는 병에 연결 된 HPLC 모바일 위상 입력된 라인에 사용 된 물에 EtOH. 2 mL/min의 유량을 프로그램, 5 분의 각 주입 루프 헹 구는 기간 및 30의 각 제품 및 분수 출력 rinsing 기간 선택 건조 라인 s. 및 30의 기간 프로그램 s.
      3. 모든 분수 라인 출력 대형 폐기물 컨테이너에 배치 합니다.
      4. 프로그램을 실행 합니다.
      5. 완료 후, 폐기물 컨테이너를 비어 있습니다.
   4. 정립 하위 시스템 유체 경로 청소.
      1. 기존의 프로그램을 열거나 청소 모드 (즉, 클린 체크 클린 탭에서 선택한)에 1 개의 정립 단위 작업을 포함 하는 새 프로그램을 만듭니다. 보충 자료, 그림 S10 에서 예를 참조 하십시오.
      2. 100 mL EtOH의로 (정화/배합 하위 시스템의 앞)에 깨끗 한 희석 저수지를 채우십시오.
      3. (> 50 mL EtOH 포함) EtOH 저수지에서 정화/배합 하위 시스템 Elute 입력된 라인을 놓습니다.
      4. 최종 제품 출력 라인 함께 폐기물 컨테이너에 린스 하 고 다시 구성 입력된 라인을 놓습니다.
      5. 프로그램을 실행 합니다.
      6. 완료 후, 폐기물 컨테이너를 비어 있습니다.

결과

[¹⁸F]의 생산을 자동화 하는 방법 개발 되었다 CFA 그리고 3 유효성 검사 일괄 합성 했다. 합성, 정화, 그리고 [¹⁸F]의 정립 CFA 90 ±에 달성 했다 5 분 (n = 3)와 비-부패-수정 방사선 화학 수확량은 8.0 ± 1.4% (n = 3). 3 실행의 활동 수확량 3.24 GBq, 2.83 GBq 3.12 GBq, 각각 34.3 GBq, 41.8 GBq 41.1 GBq에서 시작 했다. 얻은 [¹⁸F] CFA 공식 전달 모든 품질 관리 테스트 (표 1). 현재 임상 시험을 지원 하기 위해 자동화 된 프로토콜 임상 등급 [¹⁸F] CFA의 생산을 위해 사용 됩니다.

품질 관리 데이터	1을 실행 하는 유효성 검사	2를 실행 하는 유효성 검사	3을 실행 하는 유효성 검사
["패스"에 대 한 요구 사항]
외관	패스	패스	패스
[취소, 무색, 미 립 자 물질의 무료]
EOS에서 방사능 농도	213 MBq/mL	210 MBq/mL	MBq/180ml
[≤ 740 MBq/mL @ EOS]
pH	6	5.8	6
[5.0-8.0]
하프 라이프	115 분	108 분	112 분
[105-115 분]
방사선 화학 순수성	99%	99%	99%
[> 95%]
상대 보존 시간 (RRT) 방사선 화학 신원	1.01	1.01	1.01
[1.00 < RRT < 1.10]
어 금 니 활동	314 GBq/µmol	> 370 GBq/µmol	> 370 GBq/µmol
[≥ 3.7 GBq / µ]
최종 제품에 총 운반대 질량	3.1 µ g	< 1 µ g	< 1 µ g
[≤ 50 µ g/복용량]
최종 제품에 총 불순물 질량	ND	ND	ND
[≤ 1 µ g 복용량 /]
최대 허용 가능한 사출 볼륨 기반 총 캐리어 대량 ≤ 50 µ g/복용량과 총 불순물 대량 ≤ 1 µ g/복용량	전체 일괄 처리	전체 일괄 처리	전체 일괄 처리
GC에 의해 잔여 EtOH 콘텐츠	8.90%	9.50%	9.60%
[≤ 10%]
GC에 의해 잔여 EtOAc 콘텐츠	< 1 ppm	< 1 ppm	< 1 ppm
[≤ 5000 ppm]
GC에 의해 잔여 MeCN 콘텐츠	< 1 ppm	< 1 ppm	< 1 ppm
[≤ 410 ppm]
색상 자리 테스트 하 여 잔여 K222	패스	패스	패스
[< 50 µ g/mL]
필터 멤브레인 무결성 테스트	패스	패스	패스
[버블 포인트 ≥ 50 psi]
세균 독	패스	패스	패스
[≤ 175 EU/일괄]
감마 분광학에 의해 radionuclidic 순도	패스	패스	패스
[> 99.5%]
불 임	패스	패스	패스
[USP < 71 > 요건]

표 1: 품질 관리 (QC) 테스트 데이터 3 유효성 검사 일괄 처리에 대 한 요약. EOB 폭격;의 끝 = EOS의 합성; 끝 = ND = 검색.

그림 1: [¹⁸F] CFA radiosynthesis 계획. MMT = Monomethoxytrityl. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 단위 작업의 자동된 시퀀스에 수동 합성의 번역. (A)이이 패널 [¹⁸F] 수동 합성에서 고급 단계에 대 한 개요를 제공 CFA. (B)이이 패널의 각 상위 단계를 수행 하는 데 필요한 기본적인 절차를 보여줍니다. (C) 기본적인 절차를 수행 하는 데 사용 하는 Radiosynthesizer 전용 장치 작업 카드 표시 됩니다. 매개 변수 값의 그것의 자신의 세트가 각 단위 작업 (밑줄이로 표시)는 소프트웨어를 통해 구성 됩니다. 표기법 "R1"와 "r 2" 나타냅니다 반응 용기 # 1과 #2, 각각. 시 약 수에 해당 하는 시 약은 그림 4에서 식별 됩니다. 일련의 단위 작업 시퀀스 로 저장 하 고 자동된 합성을 수행 하는 소프트웨어에 의해 실행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 합성 프로그램을 만드는 radiosynthesizer (ELIXYS) 소프트웨어 인터페이스의 스크린샷. 단위 작업은 드래그 앤 드롭 인터페이스를 사용 하 여 슬라이드 에서 원하는 순서로 배치 됩니다. 이 화면에서 반응 단위 작업을 선택 하 고 편집 가능한 매개 변수 값의 화면의 주요 부분에 표시 됩니다. 이 예제에서는 fluorination 반응 활성 감동과 10 분 동안 반응 배 (봉인) 120 ° C에서 # 1에에서 실시 됩니다. 반응 시간이 경과한 후 선박 35 ° C에 냉각 될 것 이다. 다른 단위 작업에 대 한 프로그램 될 수 있는 매개 변수 값의 세부 정보는 보충 자료, 제 3에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 시 약 구성 화면의 스크린샷. [¹⁸F] CFA 합성 시퀀스에 대 한 모든 시 약은 일회용 카세트 #1, 구성 요소 선택 영역에 강조 표시 됩니다에 로드 됩니다. 여기에 설명 된 [¹⁸F] CFA 합성에 대 한 Eluent 는 K₂CO₃ 의 1.0 mg + MeCN, 전조 의 H₂O/0.5 mL의 0.4 ml에서 K222의 5.0 mg MeCN, 0.6 mL에 CFA 전조의 6mg 이며 HPLC 모바일 단계 85:15 v 에탄올: /v 25 m m 암모늄 아세테이트입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: Radiosynthesizer 설정 [¹⁸F]의 합성에 대 한 CFA. (A) 이것은 카세트 유체 경로, 카트리지, 연결 및 전송 연결 회로도 정화/배합 모듈에 radiosynthesis 모듈에서 최종 조 제품. (두 모듈 단일 컴퓨터와 소프트웨어 인터페이스 제어 됩니다.) (B) [¹⁸F] CFA 합성에 대 한 준비 후 핫 셀 내부 radiosynthesizer의 사진입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 정화/배합 모듈 제어 인터페이스의 스크린샷. 이 화면은 합성 설치 하는 동안 수동으로 HPLC 및 배합 하위 시스템을 제어 하는 연산자에 의해 액세스 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7: 미리 실행된 검사 화면. 운영자는 시스템에 설치 된 카세트의 일련 번호를 입력 하 고 시스템이 제대로 구성 되었으며 합성에 대 한 준비를 위해 각 항목을 확인 해야 합니다. 이러한 섹션 이외에 연산자 또한 메시지가 이름 및 합성의 설명 (제 1)을 실행 하 고 모든 시 약 사용 (제 2)에 대 한 번호와 모든 원자로 비디오 피드 제대로 작동을 확인 하도록 요청 (6 절). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 8: 스크린샷 [¹⁸F] CFA 합성 시퀀스를 실행 하는 동안 radiosynthesizer 소프트웨어의. 소프트웨어는 필름 스트립 지역에서 단위 작업의 순서를 표시합니다. 완료 된 작업은 회색 및 흰색으로 강조 표시, 회색, 강조 표시 되어 현재 작업 하 고 곧 작업 어두운 회색에 표시 됩니다. 화면의 중심 영역 현재 시스템 상태 (원자로 비디오 피드 및 센서 데이터)로 서 어떤 하위 명령을 실행 되, 포함 한 활성 단위 작업의 상태를 보여 줍니다. 이 특정 반응 단위 작업이 fluorination 반응. 온도 영역에서 원자로의 현재 온도 (프로그램) 대상 온도 옆에 표시 됩니다. 아래, 활동 영역에는 반응 단계와 관련 된 세 가지 센서에서 방사선 센서 값 표시 됩니다. 마지막으로, 왼쪽에 피드 비디오 원자로 유리병의 라이브 보기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 9: 스크린샷 [¹⁸F]의 합성 중 정화 단위 작업을 실행 하는 동안 radiosynthesizer 사용자 인터페이스의 CFA. 는 UV 검출기 및 방사선 검출기 정화/배합 모듈의 출력을 실시간으로 중앙 그래프에 표시 됩니다. 추가 피드백 검출기 및 HPLC 펌프에서 스크린의 오른쪽에 표시 됩니다. 연산자는 피크가 나타나기 시작 하는 때 일시적으로 제품 을 선택 하 고 다음 완전 한 피크를 본 후 다시 폐기물 전환 제품 피크를 수집 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 프로토콜 임상 등급 추적 배합의 생산을 달성 하기 수동 합성 프로토콜을 자동화 하는 경우 수행 해야 하는 기본 단계를 정의 합니다. 품질 관리 개발를 포함 하 여 전체 개발 주기 radiotracer [¹⁸F]에 의해 exemplified CFA (dCK 활동 영상)에 대 한. 특히 임상 사용에 대 한 추적 프로그램의 적합성을 보장 하기 위해 수정 자동된 합성을 지불 했다. 합성 수반 [¹⁸F] 불 소의 활성화, radiofluorination 선구자 분자, 중간 카트리지 정화, 보호 그룹 제거, 그리고 반 대리점 HPLC 정화 및 배합의 기본 프로세스 사출. 이러한 기본 프로세스 ¹⁸F 라는 애완 동물 추적기의 대부분의 합성에 대 한 충분 한 표준 레 퍼 토리를 구성.

종합 설계, 하는 동안 선택 시 약 및 그들의 품질 보증의 임상 사용을 위해 특히 중요입니다. 모의 합성 (용만)를 수행 하 여 올바른 프로그래밍 및 적절 한 연결을 보장 하는 것은 방사능으로 합성을 수행 하는 경우 예기치 못한 오류를 제거 하는 것이 필수적. 이후 합성 최적화 (용 매, 볼륨, 금액, 온도, 반응 시간 및 정화 조건) 개발에 특정 애완 동물 추적 프로그램에 따라 다릅니다. 이 실험 동안 특정 초점 해야 될 났는 데, 얻을 수 있는 최종 제품의 화학 및 방사선 화학 순수성에으로 이러한 임상 사용에 대 한 엄격한 요구 사항을 충족 해야 합니다. 안정적으로 낮은 하지만 충분 한 활동 수확량에 순수한 제품을 생산 하는 합성 산발적으로 실패할 위험이 높은 저조한 프로세스를 일반적으로 기본 이다. 일단 합성은 적절 하 게 최적화 마지막 과정 (규제 요구 사항) 임상 적합성을 보장 하기 위해 유효성 검사 테스트를 받이 필요가 있다. 유효한 합성 방법 다음 임상 사용을 위한 애완 동물 추적기를 생산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 종합 검증 방법 애완 동물 추적 때 표준 운영 절차를 철저 하 게 지켜져야 한다. 규정 준수를 보장 하기 위해, 소프트웨어는 합성을 시작 하려면 실행 을 클릭 한 후 주요 단계를 통해 사전 실행된 점검의 완료를 확인 하는 연산자를 프로그래밍 됩니다. 시스템 자동화 된 방식으로 합성을 수행 합니다, 하는 동안 정화 단계 수동 개입이 필요 합니다. 연산자 해야 합니다, 그리고 따라서 하 게 밀접 하 게 HPLC 정화 단계 동안 크로마 화면을 확인 하 고 수동으로 시작 및 중지 제품 분수 수집을 실시간으로 입력.

[¹⁸F] CFA 합성에 대 한 자동화 및 최적화 노력, 내 우리 암모늄 아세테이트 솔루션 및 EtOH 구성 된 주 사용 용 매 시스템을 사용 하 여 제품의 반 대리점 HPLC 정화 방법 간소화는 ; 우리의 이전 방법은 정화¹⁶후 용 매를 교환 하는 추가 단계가 필요 합니다. 이후 정립 과정, 따라서, 수준, 허용 하 고 있는 희석에 의해 달성 될 수 있다 그것의 isotonicity를 위해 수집 된 분수의 EtOH 콘텐츠 감소에 필요. 정립 단계 가변 볼륨 추가 NaCl 솔루션의 고 정화 제품 분수를 통해 정립 모듈 변수를 수 있도록 단일 제제 단위 작업의 구성 된 두 번째 프로그램을 사용 하 여 수행 했다 볼륨 HPLC 정화 후 얻은입니다. 수집된 제품 분수 볼륨 대신 일정 수를 설정 하는 경우 공식 단위 작업 독립적인 프로그램에 대 한 필요성을 피하고 주요 합성 프로그램에 포함 될 수 있습니다. 수동 개입을 피하기 위해 다른 접근 방법 정립 모듈의 모든 기능을 사용 하는 것 (예를 들어, 희석 물으로 순화 된 추적 프로그램, C18 고체 상 추출 카트리지를, 트랩, 그것을 씻어, EtOH의 고정 볼륨 elute 그리고 마지막으로, 염 분의 고정 된 양으로 희석).

자동화 및 임상 사용을 위한 합성 프로토콜 유효성 검사에 대 한 여기에 제시 된 기술 수 매우 일반적인 것입니다. Radiosynthesizer (ELIXYS)의 선택을 통해 다양 한 종합 자동화 고 검증 될 수 있습니다. 이 포함 하는 복잡 한 3 남 비 종합, 또는 고온 휘발성 용 매를 포함 하는 종합. 합성을 최적화 하는 것은 소프트웨어 프로그램의 매개 변수를 변경 하 여 얻을 수 있습니다. 신디사이저는 라디오 TLC 또는 라디오 HPLC 분석을 위한 샘플의 제거에 대 한 반응 선박 위치 등의 변경의 영향을 모니터링 하는 기능이 있습니다. 그러나, 시스템의 수정 없이 시스템 현재 허용 하지 않는 매우 낮은 시 볼륨 (~ 5-20 µ L), 중간 제품 증 류 법, 또는 [¹⁸F]의 처리의 처리에 대 한 AlF, ⁶⁸가, 또는 다른 radiometals. 자동화 수동 합성 같은 단계를 포함 하 고 그들은 피할 수 없습니다, 경우 자동화 및 다른 radiosynthesizer 플랫폼으로 검증 될 수 있습니다.

이 작품은 [¹⁸F]의 자동된 생산을 위한 프로토콜의 개발에 초점을 맞추고 있지만 임상 사용, 다른 많은 애완 동물 추적기의 합성에 대 한 CFA 수 자동화 임상 생산에 적합 한 방식으로 같은 논리를 따라와 방법입니다. 여기에 제시 된 방법에 따라 우리는 또한 적응 시켰다 9-자동된 합성 (4-[¹⁸F] 플 루 오로-3-[hydroxymethyl] 부 틸) 구 아닌 ([¹⁸F] FHBG) 임상 사용을 위해 그것을 확인. 사용자 설정 프로토콜 소피 프로브 네트워크, 합성 프로그램을 공유 하기 위한 웹 포털에서에서 다운로드 및 관련 설명서 다른 radiopharmacy 사이트²⁷중에 업로드할 수 있습니다. 이 지역 사회에서 노력의 중복을 피할 수 있으며 애완 동물 화상 진 찰을 포함 하는 멀티 센터 임상 연구를 용이 하 게 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ELIXYS FLEX/CHEM	Sofie (Culver City, CA, USA)	1010001	Radiosynthesizer
Radiosynthesizer cassette	Sofie (Culver City, CA, USA)	1861030400	Cassette for ELIXYS FLEX/CHEM
ELIXYS PURE/FORM	Sofie (Culver City, CA, USA)	1510001	Radiosynthesizer purification module
[O-18]H2O	IBA RadioPharma Solutions (Reston, VA, USA)	IBA.SP.065	>90% isotopic purity
[F-18]fluoride in [O-18]H2O	UCLA	N/A	Produced in a cyclotron (RDS-112; Siemens; Knoxville, TN, USA) by the (p,n) reaction of [O-18]H2O. Bombardment at 11 MeV using a 1 mL tantalum target with havar foil.
Deionized water	UCLA	N/A	Purified to 18 MΩ and passed through 0.1 µm filter
Acetonitrile (MeCN)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	271004	Anhydrous, 99.8%
Ethanol (EtOH)	Decon Laboratories, Inc. (King of Prussia, PA, USA)	2701	Anhydrous, 200 proof
Sodium hydroxide (NaOH) solution	Merck (Burlington, MA, USA)	1.09137.1000	1M solution
Hydrochloric acid (HCl) solution	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	SA48-500	1M solution
Ethyl acetate (EtAc)	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	E195SK-4	HPLC grade
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	S-640-500	USP grade
Ammonium acetate	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	A639-500	HPLC grade
Potassium carbonate (K2CO3)	Fisher Chemical (Hampton, NH, USA)	P-208-500	Certified ACS
CFA precursor	CalChem Synthesis (San Diego, CA, USA)	N/A	Custom synthesis
Cryptand 222 (K222; Kryptofix 2.2.2)	ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Germany)	800.1000	>99%
Sodium chloride (NaCl) solution (saline)	Hospira (Lake Forest, IL, USA)	0409-4888-02	0.9%, for injection, USP grade
Silica cartridge	Waters (Milford, MA, USA)	WAT051900	Sep-pak Classic
Quaternary methylammonium (QMA) cartridge	Waters (Milford, MA, USA)	WAT023525	Sep-pak Light Plus
Sterile syringe filter (0.22 µm)	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	SLGSV255F	Millex-GV
Glass V-vial (5 mL)	Wheaton (Millville, NJ)	W986259NG	Used for reaction vessels
Septa	Wheaton (Millville, NJ)	224100-072	Used for reagent vials
Crimp cap	Wheaton (Millville, NJ)	224177-01	Used for reagent vials
Amber serum vial (2 mL)	Voigt (Lawrence, KS, USA)	62413P-2	Used for reagent vials
Magnetic stir bar	Fisher Scientific (Hampton, NH, USA)	14-513-65	Used for reaction vessels