대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영

요약

미생물 생물막은 서로 복잡한 구조를 형성하고 매우 규모에 의존하는 공간 패턴으로 발전합니다. 여기에서는 3D 광학 일관성 단층 촬영(OCT) 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위한 실험 시스템(하드 및 소프트웨어)을 소개합니다. 이 도구 세트는 공간과 시간에 생물막 형태 형성의 비침습적 및 다중 스케일 특성화를 허용합니다.

초록

바이오필름은 가장 성공적인 미생물 라이프스타일이며 다양한 환경 및 엔지니어링 환경에서 우세합니다. 공동체 조립 중에 생물막의 구조적 다각화인 생물막 형태 형성을 이해하는 것은 공간적 및 시간적 비늘 전반에 걸친 놀라운 도전과제입니다. 여기에서, 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 근거를 둔 자동화한 생물막 화상 진찰 시스템을 제시합니다. OCT는 생물막 연구에서 새롭게 떠오르는 이미징 기술입니다. 그러나 현재 획득 및 처리할 수 있는 데이터의 양은 생물막 형태학에서 대규모 패턴의 통계적 추론을 방해합니다. 자동화된 OCT 이미징 시스템은 생물막 성장의 큰 공간 및 확장된 시간적 스케일을 커버할 수 있게 합니다. 시판되는 OCT 시스템과 로봇 포지셔닝 플랫폼 및 소프트웨어 솔루션 제품군을 결합하여 OCT 스캐닝 프로브의 위치 지정과 3D 생물막 이미징 데이터 세트의 수집 및 처리를 제어합니다. 이 설정은 생물막 개발의 현장 및 비침습적 자동화 모니터링을 허용하며, 매크로 사진 및 마이크로센서 프로파일링과 OCT 이미징을 결합하기 위해 추가로 개발될 수 있습니다.

서문

생물막은 매우 성공적인 미생물 라이프 스타일 적응이며, 이러한 상간 관련 미생물의 매트릭스 동봉 된 지역사회는 자연 및 산업 설정에서 미생물 의 삶을 지배 1,^2. 거기서, 생물막은 길쭉한 스트리머 3,리플4 또는 버섯형 캡5와 같은 복잡한 구조를 형성하며 생물막 성장, 구조적 안정성 및^{스트레스에}대한 저항성 6. 생물막 구조화에 관한 많은 것들이 미니어처 플로우 챔버에서 자란 모노종 문화에 대한 작업에서 배웠지만, 대부분의 생물막은 종종 생명의 모든 영역의 구성원을 포함하는 매우 복잡한 공동체이다^6. 이러한 복잡한 생물막을 미생물 풍경 7로 이해하고 복잡한 지역 사회에서 생물막 구조와 기능이 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 것이 생물막 연구의 최전선에 있습니다.

환경 단서에 반응하여 복잡한 생물막의 형태 형성에 대한 기계적 이해는 관련 에 걸쳐 생물막 물리적 구조의 공간적 및 시간적으로 해결 된 관찰과 함께 신중하게 설계된 실험을 필요로합니다. 저울⁸. 그러나, 실험 시스템에서 생물막 성장의 비파괴적 관찰은 섬세한 생물막 구조를 손상시키는 시료(예를 들어, 현미경)를 이동시킬 필요성과 같은 물류 제약에 의해 심각하게 제한되고 있다.

여기에 제시된 프로토콜은 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 기초한 완전 자동화 된 시스템을 소개하며, 이는 메조 스케일 (mm 범위)에서 생물막 형태 형성의 현장, 비 침습적 모니터링을 허용합니다. OCT는 수처리 및 바이오폴링 연구, 의학⁹ 및 스트림 생태학^10에응용된 생물막 연구에서 새로운 이미징 기술입니다. OCT에서, 낮은 일관성 광원은 샘플 및 참조 암으로 분할된다; 생물막(샘플 암)에 의해 반사되고 산란된 빛의 간섭과 기준 암의 빛을 분석한다. 깊이 해결된 구조 정보가 포함된 일련의 축 강도 프로파일(A-스캔)을 획득하여 B 스캔(단면)으로 병합합니다. 일련의 인접한 B-스캔은 최종 3D 볼륨 스캔^10을구성합니다. OCT는 약 10 μm의 범위에서 측면 광학 분해능을 제공하므로 생물막^10,12의중피 구조적 분화를 연구하는 데 적합합니다. OCT에 대한 자세한 설명은 드렉슬러와 후지모토^13,퍼처 및 동료^14를참조하십시오. 단일 OCT xy-scan의 시야가 수백 평방 마이크로미터에 도달하지만 단일 스캔에서 OCT를 통해 대규모 패턴을 정량화할 수 없습니다. 하천과 같은 자연 서식지의 생물막과 관련하여, 현재 는 서식지의 물리적 및 유압 템플릿과 일치하는 스케일에서 생물막 형태 형성을 평가하는 능력을 제한합니다.

이러한 공간 한계를 뛰어넘고 OCT 스캔을 자동으로 획득하기 위해 스펙트럼 도메인 OCT 이미징 프로브를 3축 포지셔닝 시스템에 장착했습니다. 설치는 중첩 모자이크 패턴 (타일 스캔)에서 여러 OCT 스캔을 수집하여 최대 100cm 2까지 표면적의 단장 촬영 이미징을 효과적으로 달성 할 수 있습니다. 또한, 이 시스템의 높은 포지셔닝 정밀도를 통해 장기 실험 중에 특정 부위의 생물막 기능의 성장과 개발을 안정적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 모듈식이며 설치의 개별 구성 요소(즉, 위치 지정 장치 및 OCT)는 독립형 솔루션으로 사용하거나 유연하게 결합할 수 있습니다. 그림 1은 설치의 하드 및 소프트웨어 구성 요소에 대한 개요를 제공합니다.

이 시스템은 시판되는 GRBL 제어 CNC 포지셔닝 장치(재료 표)로 시험하였다. 이 특정 포지셔닝 플랫폼의 작동 거리는 600×840×140mm이며, 제조업체가 표시한 정확도 +/- 0.05 mm, 프로그래밍 가능한 해상도0.005mm. GRBL은 CNC용 오픈 소스(GPLv3 License), 고성능 모션 컨트롤입니다. 장치. 따라서 모든 GRBL 기반(버전 > 1.1) 포지셔닝 장치는 여기에 제시된 지침 및 소프트웨어 패키지와 호환되어야 합니다. 또한, 소프트웨어는 몇 가지 수정과 STEP-DIR 입력 유형과 다른 스텝 모터 컨트롤러에 적응 할 수있다.

시스템의 성능을 평가하는 데 사용되는 OCT장치(재료 표)는 중심 파장이 930nm(대역폭 = 160nm)의 낮은 일관성 광원을 특징으로 하며, 조정 가능한 기준 암 길이 및 강도가 있습니다. 여기에 제시된 예에서, OCT 프로브를 흐르는 물에 담그는 침지 어댑터(표오브 머티리얼)도사용되었다. 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 여기에서 개발된 소프트웨어 패키지는 특정 OCT 시스템과 함께 제공되는 SDK에 따라 크게 달라지지만, 다른 스캔 렌즈와 중앙 파장이 있는 동일한 제조업체의 OCT 시스템은 쉽게 호환됩니다.

GRBL 장치는 단일 보드 컴퓨터에 설치된 웹 서버에 의해제어됩니다(그림 1). 이렇게 하면 로컬 네트워크 또는 인터넷 액세스가 있는 모든 컴퓨터에서 장치를 원격으로 제어할 수 있습니다. OCT 장치는 별도의 컴퓨터에 의해 제어되므로 자동화된 실험 설정을 제외하고 OCT 시스템의 작동이 가능합니다. 마지막으로, 소프트웨어 패키지에는 OCT 프로브 포지셔닝 및 OCT 스캔 수집을 동기화하는 라이브러리가 포함됩니다(즉, 모자이크 패턴 또는 정의된 위치 집합에서 3D 이미징 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위해). OCT 프로브의 위치를 3D로 효과적으로 정의하면 (지역) 스캔 세트에 맞게 초점 평면을 조정할 수 있습니다. 특히 고르지 않은 표면에서 각 OCT 스캔에 대해 서로 다른 초점 평면(즉, z 방향으로 다른 위치)을 지정할 수 있습니다.

원시 OCT 스캔을 처리하기 위해 소프트웨어 패키지집합이 개발되었습니다(표 1). 포지셔닝 디바이스의 탐색, OCT 스캔 수집 및 데이터 세트 처리는 파이썬 코딩 된 Jupyter 노트북으로 수행되어 소프트웨어의 개발 및 최적화에 있어 뛰어난 유연성을 제공합니다. 이러한 노트북의 두 가지 작업 및 추가 된 예제 (이미지 수집 및 처리에 대 한) 사용할 수 https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 그들은 사용자 지정에 대 한 시작 점으로 의도 메서드의. Jupyter 노트북은 추가 된 파이썬 코드가있는 셀을 포함하는 웹 브라우저 기반 응용 프로그램입니다. 각 단계는 노트북의 셀에 포함되어 있으며, 별도로 실행할 수 있습니다. 스캔 렌즈(구면 수차)(15)를 통해 광 경로의길이가 상이하기 때문에, 원시 OCT 스캔이 왜곡된 것처럼 보인다(도2A). 우리는 획득 한 OCT 스캔에서이 왜곡을 자동으로 수정하는 알고리즘을 개발했습니다 (ImageProcessing.ipynb, 보충 파일1). 또한, 생물막 형태는 이전에 멤브레인 시스템^16에서사용되었던 것처럼 2D 고도 맵으로 시각화될 수 있으며, 타일링 배열에서 가져온 스캔에서 얻은 고도 맵이 어떻게 스티치될 수 있는지 설명합니다.

마지막으로, 설명된 실험실 설치의 기능은 광영양 스트림 생물막이 유속의 구배에 노출되는 수로 실험을 사용하여 설명됩니다.

프로토콜

1. 위치 지정 장치 설정

1. https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl 지시에 따라 위치 장치를 마이크로 컨트롤러 보드에 연결합니다.
2. USB 케이블을 통해 인터넷에 연결되는 단일 보드 컴퓨터에 마이크로 컨트롤러를 연결하고 https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git 설명된 대로 GRBL 서버를 설치합니다. 이제 위치 지정 장치는 http://IP:5020/ 호스팅되는 웹 페이지에서 탐색할 수 있어야 합니다. 또는, 포지셔닝 디바이스는 파이썬 스크립트로 탐색할 수있으며, 작업된 예제 ImagesAcquisition.ipynb(보충 파일 2)의 첫 번째 부분에서 설명한 바와 같이.

2. 10월 설정

1. 호환되는 비둘기 꼬리 홀더를 사용하여 OCT 프로브를 포지셔닝 장치에 장착합니다. 필요한 경우 대물 렌즈에 침지 어댑터를 설치합니다.
2. 컴퓨터 및 OCT 베이스 유닛을 실험 옆에 있는 벤치에 배치합니다(예: 미세 유체 장치, 유량 챔버, 수로, 여과 시스템). 광학 코드(최대 길이 약 1.8m)가 자유롭게 움직여 모든 의도한 위치에 도달할 수 있고 실험 설정을 방해하지 않도록 하십시오.
3. 제조업체에서 설명한 대로 사용 가능한 소프트웨어와 함께 OCT 시스템을 설치합니다.
4. https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 설명된 대로 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 소프트웨어 패키지를 설치합니다.

3. 이미지 획득

1. OCT 시스템과 포지셔닝 장치의 전원. 장치가 자유롭게 이동할 수 있는지 확인합니다.
2. 텍스트 편집기에서 파일 config.json을 엽니다. config.json 파일을 편집하여 기본 이미지 수집매개변수(표 2)를 조정하여 굴절률(20°C의 물1.33, 공기의 경우 1.00)과 획득한 데이터 및 메타데이터의 대상 폴더를 조정합니다.
3. config.json에서뷰 필드(FOV)의 크기와 B 스캔당 A-스캔 수를 정의합니다.
   참고: 이 두 매개변수는 최종 데이터 집합의 복셀 크기와 출력 파일의 크기를 결정하며 프로브의 광학 해상도와 일치해야 합니다(x-y 복셀 크기는 광학 해상도의 절반보다 작아야 합니다). A- 및 B 스캔의 수는 사용 가능한 디스크 공간 및 처리 기능에 대해 어떤 장단점을 다루는 공간 범위에 영향을 줍니다.
4. config.json에서출력 OCT 스캔의 신호 경계를 정의합니다. 이들은 견본의 모형에 달려 있습니다. 따라서 예비 검사 세트의 강도 히스토그램을 기반으로 이러한 매개 변수를 결정하는 것이 좋습니다. config.json의변경 내용을 저장합니다.
5. OCT 프로브를 관심 사이트로 이동합니다. 최적의 이미지 품질을 위해 샘플에 초점을 맞추고 기준 암 및 광원 강도를 조정합니다. 여러 위치에 대해 이 절차를 반복하고 좌표를 기록합니다.
   참고: 이렇게 하면 이러한 참조 점 주위에 후속 자동 OCT 스캔 수집이 허용됩니다. 자동 이미지 수집 중에는 참조 암 길이와 강도를 변경할 수 없습니다.
6. Juypter 노트북에서 ImageAcquisition.ipynb 파일(보조파일2)을 엽니다. 각 셀에는 특정 작업을 수행하는 코드가 포함되어 있으며 셀 을 눌러 별도로 실행할 수 있습니다 | 실행, 또는 Ctrl + 입력 또는 이동 + 입력.
   1. 필요한 라이브러리와 기본 구성 매개 변수로 경로를 설정합니다. 또는 임시 매개 변수의 새 집합을 정의합니다.
   2. 위치 지정 장치에 연결하고 OCT를 초기화합니다.
   3. 포지셔닝 장치를 보정합니다(즉, "호밍"을 수행).
   4. 단일 스캔 또는 모자이크 패턴의 관심 위치를 포함하는 데이터 집합을 획득하여 숫자와 겹침(예:., 30%)을 지정합니다. 이웃 타일의.
      참고: 컴퓨터 리소스 사용을 최적화하는 검색 전에 메모리가 할당됩니다. 데이터는 저장 공간을 저장하기 위해 8비트 *.raw 형식으로 저장되며, 타임스탬프와 명명 규칙(즉, %Y%m%m%M%M%M%M%S_<<&t;위치>)을 사용하여 config.json에정의된 대상 폴더에 저장됩니다. OCT 설정 및 좌표를 포함한 메타데이터는 동일한 명명 규칙이 있는 *.srm 파일의 동일한 폴더에 저장됩니다. FOV 및 해상도와 같은 설정에 따라 파일 크기는 OCT 스캔당 최대 1.5GB에 도달할 수 있습니다.
7. 데이터 수집을 방지하려면 충분한 사용 가사용 디스크 공간이 있는지 확인하거나 OCT 데이터 집합을 외장 하드 드라이브로 지속적으로 이동해야 합니다.

4. 이미지 보정 및 디스플레이

1. OCT 이미지 처리(왜곡 보정, 배경 빼기, 고도 맵 계산, 고도 맵 스티치)의 작업 예에 대해 Jupyter 노트북 ImageProcessing.ipynb(보조 파일1)을 엽니다.
2. 필요한 경우 스퓨리어스 신호를 배제하고 데이터 집합의 방향을 재조정하기 위해 OCT 를 자르십시오(생물막은 지층 위에 나타나야 합니다).
3. 구면 수차에 적합합니다. 이것은 평평한 것으로 알려진 고반사 기준 표면을 활용하는 보정 알고리즘에 의해 달성됩니다 (예를 들어, 수로의 바닥, 지층). 첫째, 알고리즘은 OCT 스캔의 xy 평면에 걸쳐 정기적으로 간격을 두는 20×20개의 수직 선 그리드를 정의합니다. 그런 다음, 각 점 주위의 원형 영역을 선택하고 수직 프로파일을따라 신호 강도를 평균화합니다(도 2B). 수직 프로파일은 수정된 가우시안 필터로 처리됩니다.
   
   여기서 x는 입력 신호이고 표준 편차를 σ로, C는 다음과 같이 결정됩니다.
   
   참조 서피스는 이러한 각 프로파일에서 로컬 최대값으로 지역화됩니다. 잘못 식별된 점은 3차원으로 이웃의 위치에 따라 필터링됩니다(그림2C). 마지막으로, 스캔 렌즈에 의해 도입된 왜곡을 반영하는 2차 다항식 표면이 이러한 점에 걸쳐 장착된다(도2C). 그런 다음 장착된 표면을 사용하여 각 픽셀을 z 방향으로 이동하여 평평한 이미지를 얻습니다. 이 알고리즘의 매개 변수는 OCT 스캔의 특성에 맞게 조정되어야 합니다.
4. 배경 소음에 대 한 수정. 이미지의 빈 영역(일반적으로 생물막 위)을 식별하고 보정 알고리즘을 사용하여 이미지의 강도 값에서 평균 배경 강도를 빼서최종 수정된 OCT 이미지를 생성합니다(그림 2D).
5. 3D OCT 데이터 집합에서 입면 맵을 계산합니다. 이 단계에서는 특정 실험(예를 들어, 지층)에 대한 관심 있는 기준 표면과 적절한 임계 강도를 정의합니다. 그런 다음 입면 맵 계산 알고리즘을 사용하여 이진 마스크의 각 좌표(x,y)에 대한 생물막의두께를 계산하고 이를 새 2D 행렬에 할당합니다(그림 3A). 그런 다음 두께 값이 x 및 y 방향으로 원본 이미지 크기의 2D 행렬에 할당됩니다. 지표면의 표고가 그레이스케일 값으로 보고되는 이미지가렌더링됩니다(그림 3B).
6. 여러 OCT 스캔이 모자이크 패턴으로 수행되는 경우 행과 열 의 수를 정의하고 각 입면 맵을 스티치합니다. 그림 5는 설명된 설정으로 달성 가능한 광범위한 공간 스케일 및 해상도를 포함하는 스티치된 고도 맵의 예를 제시합니다.

결과

우리는 광영양 스트림 생물막의 spatio 측두체 형태 형성을 연구하기 위하여 디자인된 수로 실험을 사용하여 자동화된 OCT 화상 진찰 시스템의 기능을 보여줍니다. 수로의 점차적으로 좁아지는 기하학적 구조는 수로의 중심을 따라 유속의 그라데이션을 유도하였다(참조¹⁷참조).  생물막의 시간적 발달 과 구조적 분화는 생물막 형태 발생에 대한 유체 역학 적 조건의 영향을 더 잘 이...

토론

OCT 이미징은 수 제곱 밀리미터의 FOV로 마이크로미터 범위의 구조를 해결하는 데 적합합니다. 따라서 생물막 연구를 위한 강력한 도구10,^18. 그러나 OCT는 현재 최대 스캔 면적이 100- 256 mm2로 제한되어 있으며, 생물막 구조 패턴은 종종 이 공간 스케일^19를초과하는 반면, 특히 형태학적 차별화가 대규모 환경 그라데이션에 의해 구동되는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
OCT Probe	Thorlabs	GAN210C1	OCT imaging device
OCT scan lens	Thorlabs	OCT-LK3-BB
Immersion adapter	Thorlabs	OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK	STEPCRAFT	NA	positioning device
microcontroller	Arduino Uno R3	NA
Single-board computer	Raspberry PI	NA
camera	Canon EOS 7D Mark II	NA
camera lens	Canon MACRO EFS 35 mm	NA