성인 제 브라 피시 하트 연구를 위한 흉부 내 주사

요약

이 방법은 성인 zebrafish의 흉부에 용액의 0.5-3 μ l의 주입에 의존 한다. 이 절차는 장기를 손상 시 키 지 않고 제 브라 피쉬 심장의 근접으로 단백질과 화학 물질을 효율적으로 전달 합니다. 접근법은 심장의 다양 한 조직에 대 한 외 인 성 인자의 효과를 테스트 하는 데 적합 합니다.

초록

성인 zebrafish 심장은 심장 재생 연구에서 강력한 모델을 제공 합니다. 이 시스템의 강도는 형질 전환 접근법을 기반으로 하지만, 외 인 성 인자의 급속 한 전달은 기능적 연구에서 상보적 인 기술을 제공 한다. 여기에서, 우리는 심근 손상을 초래 하지 않고 심 낭 구멍으로 용액의 몇 마이크로 리터의 투여에 의존 하는 방법을 제시 한다. 흉부 (그것) 주사는 효과적으로 심장 표면에 직접 단백질과 화학 물질을 전달할 수 있습니다. 주입 된 물질은 기본 심장 조직으로 미식가를 통해 확산. 복 강 내 (IP) 주사와 비교 하 여 흉부 내 주사의 주요 이점은 표적 장기에 대 한 시험 된 인자의 초점 관리입니다. 심 낭에 직접 분자의 전달은 성인 제 브라 피쉬의 심장 전처리 및 재생에 대 한 연구에 적합 한 전략 이다.

서문

척추 동물 중에서, 제 브라 피쉬는 그들의 마음을 재생성 하는 놀라운 능력을가지고 있습니다^1,2. 이 능력은 몇몇 상해 모형, 즉 심 실 꼭대기 절제술, 저온 손상 (CI) 및 유전 심근 세포 절제^3,5,⁷에서 보고 되었습니다. 침 습성 부상 후, 뇌 실의 손상 된 벽은 섬유 성 조직에 의해 일시적으로 치유 되 고,이는 점진적으로 새로운^{심근 8},^10,11으로 대체 된다. 초기 상처 치유 반응은 면역 세포의 활성화 및 채용을 포함 한다^12,13,^14,15. 부수적, 부 상당한 심근 근처에 심근 세포로 활성화 되 고, 제거, 증식 및 점진적으로 부상 영역을 대체 30-90^{일 16},^{18, 19}. 심장 재생의 분자 및 세포 기전을 해독 하는 실질적인 진보는 세포 계통 추적 분석, 유도성 유전자과 발현과 같은 유전 도구의 가용성 덕분에 달성 되었습니다. 형광 조직 리포터 라인 및 CRISPR/Cas9 유전자 돌연변이 유발^20,21.

우리는 최근 성인 제 브라 피시^22,23에 의해 심장 프리 컨디셔닝 모델을 확립 했습니다. 프리 컨디셔닝은 심장 보호 유전자의 발현을 증가 시키고 온전한 상태로 세포 순환에 재 진입 하 여 마음을 재생 시킨다. 이러한 과정은 면역 세포 및 매트릭스 리 모델링^22,24의 모집과 관련 된다. 사전 컨디셔닝의 메커니즘은 제대로 이해 되지 않으며,이 연구 영역을 조성 하기 위해 새로운 기술의 확립이 필요 합니다. 특히, 분 비 된 시그널링 단백질 또는 다른 화학적 화합물의 최적화 된 투여는이 주제를 더 조사 하기 위해 필수적 이다.

수생 동물 인 zebrafish는 아가미와 피부를 통해 물에 녹아 있는 다양 한 물질을 자연적으로 흡수 할 수 있습니다. 이는 약리학 적 억제제, 스테로이드 호르몬, 타 목 시 펜, BrdU 및 항생제와 같은 다양 한 화학 물질을 가진 용액에 생선을 침 지 하 여 비 침 습 적 약물 전달을 가능 하 게 합니다. 실제로 , 우리의^25,26,²⁷를 포함 하 여 각종 실험실에서 수많은 연구 결과는, 재생 생물학⁶의 분야에서 특히 귀중 한이 방법을 이용 했습니다, 이 접근법은 그러나 제한 된 조직 투과성을 갖는 펩타이드, DNA, RNA, morpholinos 또는 분자의 전달에 적합 하지 않다. 이러한 경우에, 보다 효율적인 전달은 체 내에 미세 주입 함으로써, 예를 들어, 복 강 내 또는 intrapericardial 캐비티 (²⁹)에 모세 혈관을 레트로-궤도 정 맥 내로 삽입 하 여, ³¹. 여기서, 우리는 성인 제 브라 피시에서 심장 재생 및 사전 컨디셔닝 연구를 하기에 적합 한 방법으로 소량의 용액을 흉부 내 주사 하는 절차를 설명 합니다.

프로토콜

다음 의정서에 기술 된 동물 관리 및 모든 동물 절차는 스위스 프리 부르의 토 널 수의학 사무소에 의해 승인 되었다.

1. 도구 및 주사를 위한 솔루션

1. 도 1a에 따른 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여 마이크로 인젝션에 적합 한 붕 규 산 유리 모 세관을 잡아 당깁니다. 모델링 점토 또는 접착 테이프의 레일 9 cm 페 트리 접시에 뽑아 모세 혈관을 저장 합니다.
2. 일반적인가 위를 사용 하 여 스펀지 조각 (7cm × 3cm × 1cm)을 잘라서 중간에 물고기 같은 실루엣을 개척.
3. 테스트 된 단백질 또는 다른 화합물을 사용 하 여 소량의 주입 용액을 준비 하십시오. 1 배의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 있는 물질을 10% 페 놀 레드로 희석 하 여 분석 법에 따라 농도를 조절 합니다.
   참고: 여기서, 시험 된 단백질의 농도는 100 ng/m l 이었다.
4. 완충 된 트리 네 마 취 제의 원 액을 제조 하기 위해, 980 mL의 증류수 4 g을 녹 이세요. 1 M의 트리-HCl을 사용 하 여 ph를 7.0-7.4로 조정 하 고 물로 1000 mL로 채웁니다. 용액을 4 ° c에서 어두운 곳에 보관 하십시오.
5. 마 취 제의 작동 농도를 얻으려면, 1-2 mL의 트리 네 스톡 용액을 비 커에 생선 물 50 mL에 추가 하십시오.
   참고: 트리 네 마이 저의 작동 농도는 사용 하기 전에 신선 하 게 준비 해야 합니다.

2. 주사 스테이션의 제조

1. 위쪽에서 빛을 사용 하 여 실체 현미경을 켜고 배율을 16x로 조정 합니다.
2. 물고기 물과 스폰지를 담가, 현미경 단계에 9cm 페 트리 접시에 배치 하 고 초점을 조정.
3. 실체 현미경의 밑에, 도 1a에 도시 된 바와 같이가 위를 사용 하 여 기초 로부터 ~ 7mm에 미세 모 세관의 말단을 절단 한다. 이상적인 팁 지름은 ~ 20 µm 것입니다.
   참고: 모 세관의 끝을 비스듬한 방법으로 절단 하는 것은 조직에 삽입 하는 데 최적입니다.
4. 마이크로 모 세관을 마이크로 인젝터 장치의 니 들 홀더에 삽입 합니다.
5. 마이크로 로더 팁을 사용 하 여 주입 압력을 설정 하기 위해 제어 솔루션 (예: 1x HBSS)을 로드 하 여 0.3 µ 및 0.5 µ의 적절 한 유량 범위를 확보 하십시오. 바늘을 비웁니다.
6. 주사 용액의 선택 된 부피를 로드 합니다 (예를 들어, 모양 체의 신경 영양 인자 [CNTF]를 모 세관의 끝으로 희석 한다). 모 세관에 기포가 없어야 합니다.
   참고: 주사 용액의 최대 부피는 어류의 크기에 따라 달라진 다. 2.5-3cm의 표준 길이의 경우, exessive 흉부 팽 윤 및 출혈을 방지 하는 최대 주입 량은 5 µ L (그림 1f)로 결정 되었습니다. 더 큰 볼륨은 더 큰 물고기에 게 주입 될 수 있습니다.

3. 흉부 내 주사를 위한 어류의 제조

1. 그물을 가진 성인 제 브라 피시 (Danio 재기록)를 잡아 마 취 용액으로 전송 합니다.
2. 1-2 분 후에 물고기가 수영을 멈추고 운영의 움직임이 감소 하면 플라스틱 스푼으로 물고기를 터치 하 여 접촉에 반응 하지 않는지 확인 하십시오.
3. 신속 하 고 신중 하 게 복 부 측면 위로, 젖은 스폰지의 홈에 숟가락으로 물고기를 전송 합니다. 물고기의 머리는 연산자의 지배적 인 손에서 멀리 해야 합니다.

4. 심 낭에 마이크로 주입

1. 실체 현미경의 밑에, 물고기의 피부 밑에 박동 하는 심 혼의 운동을 주의깊게 관찰 하십시오. 심 복 부 연골 판에 의해 정의 된 삼각형의 중간 및 박동 심장 위의 주사 지점을 시각적으로 결정 합니다 (그림 1d). 모 세관의 끝을 몸체 축에 대해 30-45도 각도로 삽입 합니다 (그림 1e). 미세 모세 혈관의 팁으로 피부를 부드럽게 침투 합니다 (그림 1c). 최적의 진입 지점은 머리 보다 복 부에 더 가깝습니다.
   참고: 신체와 심장에 모 세관을 너무 깊게 삽입 하지 마십시오 .이로 인해 장기에 부상을 입을 수 있습니다. 심장 천자의 경우, 바늘은 일반적으로 혈액으로 채워집니다. 이런 일이 발생 하면 모 세관을 제거 하 고 실험에서 물고기를 배제 하십시오.
2. 바늘이 심 낭 안쪽에 일단, 마이크로 인젝터 장치의 페달을 눌러 주입을 완료 하십시오.
   참고: 흉부 구멍에 공기를 주입 하지 않도록 주의 하십시오.
3. 주사 후 흉부에서 모 세관을 조심 스럽게 철회 하 고 즉시 물고기를 시스템 물이 있는 탱크로 옮겨 회복 시킵니다.
4. 마 취에서 총 회복 될 때까지 물고기를 모니터링 합니다.
5. 원하는 시간 지점에서 마음을 수집 하 고 추가 분석을 위해 준비 합니다.
   참고: 물고기가 30 초 내에 작전의 움직임을 재개 하지 않는 경우 플라스틱 피 펫으로 아가미에 물을 압착 하 여 물고기를 다시 움직입니다.

결과

흉 곽 (그것) 주사 후 외 인 성 용액의 효과를 분석 할 수 있습니다. 이 목적을 위해, 물고기는 안락사 시키고, 이전에 출판 된 프로토콜^32,33에 따라 마음을 수집, 고정 및 조직 학적으로 처리 해야 한다.

이 방법을 검증 하기 위해 먼저 컬러 및 형광 염료를 주입 하 여 두 가지 테스트 실험을 수행 했습니다. 첫째, 우리는 물고기를 안락사 시키고, 흉부에 3 µ의 잉크를 주입 했습니다. 마음은 5 분 후에 수집 되었고, 인산 완충 식 염 액 (PBS)에서 세척 하 고, 2% 포 르 말린으로 고정 하 고, PBS로 세척 하 고 현미경으로 촬영 하였다. 둘째, 생체 내에서 1 µ µ, 6-디 아미노 노 제 2 페 린 돌 (DAPI)을 3 개 주입 하 고 2 시간 후에 심장을 고정 시켰다. 두 가지 분석 법 모두에서, 전체 산 분석이 심 실, 아 트리 움 및 불 버스 동정을 포함 한 전체 심장의 라벨링을 밝혀 내었다 (도 2a, B). 이러한 결과는 심장 표면에 주입 된 용액의 효율적인 확산을 보여줍니다.

성인 어류에 외 인 성 물질을 전달 하기 위한 일반적인 프로토콜은 복 강 내 (IP) 주사 이다. 심장 연구를 위한 IP 주사와의 적합성을 비교 하기 위해 우리는 두 방법을 사용 하 여 유사한 양의 DAPI를 주입 하 고 5 분 120 분 후에 마음을 고정 시켰습니다 (그림 3a). 심장 근육에 액 틴 라벨을 부착 하는 phalloidin 알 렉 사 플 라 이나 (AF) 568으로 마음을 단면화 하 고 염색 했습니다. 두 시간 지점에서 IP 주입 후 심장에서 DAPI 양성 세포가 관찰 되지 않았다 (도 3b). 대조적으로,이 주입은 심근에서 DAPI로 표시 된 핵의 존재를 가져왔다 (그림 3b). 이러한 결과는 주입이 IP 주입에 비하여 심장에 대 한 화합물의 전달을 향상 시켰다는 것을 입증 한다.

심장 재생 연구를 위한이 방법의 적합성을 테스트 하기 위해, 우리는 3및 7 일 후 저온 손상 (dapi)에서 1 µ g/ML dapi 및 1 µ g/ml phalloidin AF649의 3 µ l의 주사를 수행 했습니다. 1 시간 후 주입, 마음을 수집, 고정, 단면화 하 고 손상 된 심근를 시각화 하기 위해 phalloidin AF568으로 스테인드 했다. 우리는 심근와 부 상당한 조직이 다 수의 DAPI 양성 세포를 포함 하 여, 온전한 심장과 섬유 성 조직으로이 염료의 효과적인 침투를 나타내는 것을 발견 했습니다 (도 4b). 더욱이, 주입 된 phalloidin AF649는 또한 부 상당한 지역의 peri-부상 지역 및 몇몇 모집 한 섬유 아 세포의 심근 세포로에 의해 통합 되었습니다. 이 실험은 약물이 미식가를 교차 하 고 근본적인 심근 침투 할 수 있음을 보여줍니다.

염료를 사용 하 여 그것의 효율성을 테스트 한 후, 우리는 심장에 주입 된 단백질의 효과 분석. 우리는 CNTF 라고 불리는 사이토카인을 합성 하 여 thoracotomy²⁴후에 상향 조정 됩니다. 우리는 다양 한 프로세스, 즉 심근 세포 증식, 세포 외 기질 증 착, 면역 세포 모집 및 심장 보호 유전자 발현에 대 한 외 인 성 CNTF의 효과를 조사 했습니다. 우리는이 모든 생물학적 측면이 제어 면역 글로불린과 비교 하 여 CNTF 주입에 의해 활성화 되었다는 것을 발견 했습니다 (그림 5)²⁴. 이러한 결과는 흉부 내 주사의 방법이 다양 한 분석에서 뚜렷한 심장 조직에 미치는 영향을 연구 하기 위해 단백질의 표적 전달을 위한 적절 한 전략을 제공 한다는 것을 입증 합니다.

그림 1: 성인 제 브라 피시에 주입 하는 것입니다. (A) 필 라 멘 트 (6mm), 직경 1.0) 및 바늘 풀러 프로그램의 값이 있는 당겨 지는 미세 주입 모 세관의 사진. (B) 10% 페 놀 레드를 포함 하는 용액의 2.5 µ l로 채워진 필 라 멘 트 (6mm(1.0 mm)가 있는 뽑아 진 미세 주입 모 세관의 사진. 바늘의 당겨 끝은 최대로 7mm 길이입니다. (C) IT 주입 절차의 개략 표현. (D) IT 주입 절차의 사진. 이 수치는 비 세 외²⁴에서 수정 되었습니다. 패널 C와 D의 숫자는 절차의 동일한 단계에 해당 합니다. (1) 물고기는가 습 된 스폰지에 복 부 쪽을 올려 둡니다. 펑크 사이트 (삼각형의 빨간색 점)는 아가미 근처의 가슴 중앙에 있습니다. (2) 심 낭에 바늘의 침투. 빨간색 점은 펑크 사이트를 나타냅니다. (3) 주사는 심 막 구멍의 적색 용액의 확산을 관찰 하 여 모니터링 한다. (E)이를 주입 하는 방식. 주사 모세 혈관과 몸체 축 사이의 각도는 심장 천자를 피하기 위해 30 ° ~ 45 ° 사이 여야 합니다. (F) 표시 된 부피를 주입 한 후 1 시간에 물고기 흉부 사진. 흰색 화살표는 내부 출혈을 나타낼 수 있는 redish 조직을 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 주입 된 용액은 심장 표면에 거의 균일 하 게 퍼집니다. (A) 입체 이미지 2.5 µ l hbss 또는 2.5 µ l 잉크를 사용 하 여 사후 모 르 템 주사를 실시 한 물고기의 전체 심장. 잉크는 심 실 (V), 아 트리 움 (A) 및 구 근 동맥 (Ba)의 표면을 염색 하였다. 스케일 바 = 300 µm (B)이를 위해 hbss를 주입 하 고 1 µ G/ml dapi의 3 µ l을 사용 하 여 물고기의 전체 마음의 밝은 필드와 형광 실체 현미경 이미지. DAPI 형광 주사 직후 심장 부분에 검출 된다. 축척 막대 = 300 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .

그림 3: DAPI를 심장에 전달 하기 위한 두 가지 주입 방법 비교 (A) 실험 설계의 계획. 복 강 내 (IP) 및 골 내 식 (IT) 주사는 동일한 양의 1 µ g/mL DAPI (3 µ L)로 수행 하였다. 마음은 주사 후 5 및 120 분에 수집 되었다. (B) 근육 섬유에 풍부 하 게 부착 된 형광 phalloidin (적색)으로 얼룩진 심장 단면의 공초점 현미경 사진. 주입 된 DAPI는 녹색으로 표시 된 적절 한 채널에서 시각화 되었습니다. IP 주입 후, DAPI는 언제 든 지 심장에서 감지 되지 않습니다. 주입 후, DAPI 양성 세포는 두 시간 지점 후에 심 실에 존재 한다. 축척 막대 = 500 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .

그림 4: 그것은 심장 재생을 연구 하는 주입. (A) 실험 설계의 계획. 냉동 손상 후 3 일에서 7 일간 DAPI와 phalloidin AF649의 혼합이 주입 되었습니다 (µ µ 1). 하트는 주입 후 1 시간 후에, 고정, 단면화 및 phalloidin AF568 (적색)로 얼룩진 채 수집 되었다. (B) 3 및 7 dpci에서 세로 심장 부분의 공초점 현미경 이미지. 주입 된 DAPI (녹색) 및 phalloidin AF649 (파란색) 레이블 셀 손상 된 영역 (흰색 파선으로 구분) 및 손상 되지 않은 심근 (빨간색 염색). 흰색 화살표는 온전 하 게 콤팩트 하 고 섬유의 myocardia과 미식가를 통해 DAPI (녹색) 분포를 가리킵니다. 축척 막대 = 500 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .

그림 5: 외 인 성 주입 CNTF는 심장에 있는 몇몇 생물학 과정을 자극 합니다. (A) 실험 설계의 계획. 먼저, 제 브라 피시 CNTF 또는 대조 면역 글로불린의 250 ng를 함유 하는 용액의 2.5 µ L을 심근 세포로에서 핵 DsRed2 발현 하는 형질 전환 어류의 심 낭 내로 주입 하였다. 하트는 7 및 1 일 후 주사 (dpi)에 수집 하 고 면역 형광 및 현장 혼성 화에 의해 각각 분석 하였다. (D&B) 제어 및 CNTF 주입 마음의 심 실 섹션의 공초점 현미경 이미지. (B) 세포 주기 마커에 대 한 면역 염색, minichromosome 일부 유지 보수 복합 성분 5 (MCM5; 녹색)은 외 인 성 CNTF에 반응 하 여 더 많은 증식 심근 세포로을 보여준다. 스케일 바 = 500 µm 콜라겐에대 한 면역 염색은 CNTF 주입 후 심근에서 콜라겐 xii의 증 착을 증가 보여준다. 제어 심장에서, 콜라겐 XII는 미식가³⁴에 국한 된다. 스케일 바 = 500 µm 면역 세포마커 L-plastin에 대 한 면역 염색은 CNTF 주입 된 어류에서 면역 세포의 강화 된 모집을 검출 한다. 축척 막대 = 500 µm. (E) 심 실 횡단면의 밝은 시야 현미경 이미지 시 스타 틴에 대항하는 안티 센스 mRNA 프로브를 사용한 혼성 화, 심장 보호 인자,이 유전자의 전사 상향 조절을 심 혼에 표시 CNTF 주입 생선의. 축척 막대 = 500 µm. 이 수치는 비 세 외²⁴에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

여기서, 우리는 성인 제 브라 피시에서 심장에 미치는 영향을 연구 하기 위해 외 인 성 화합물과 단백질을 심 막 캐비티에 전달 하는 방법을 설명 합니다. 절차는 흉부 내 주사를 기반으로 하며,이는 장기 부근에서 소량의 용액을 전달 하는 결과를 초래 합니다. 이 기술은 심장 프리 컨디셔닝 및 재생을 연구 하기 위해 개발 및 기술 되었다.

이 절차의 중요 한 단계는 유리 모 세관을 흉 강 내로 침투 하는 것입니다. 이 단계는 세 가지 매개 변수에 따라 달라 집니다: 모 세관 팁의 강성과 선명도, 관통 각도, 펑크 부위. 피부를 통한 침투를 최적화 하기 위해 모 세관의 당겨 지는 부분은 너무 유연 하 고 피부와 접촉 하 여 구부러질 수 있으므로 너무 길지 않아야 합니다. 이를 방지 하기 위해, 강성은 창포 절제술가 위를 사용 하 여 팁 크기를 줄여 조정할 수 있습니다. 침투 각도는 30 °와 45 ° 사이에서 다양할 수 있지만, 팁의 강성에 맞게 조정할 수 있습니다. 실제로 얇은 팁은 더 좁은 각도로 피부에 더 잘 침투 합니다.

바늘 관통을 최적화 하기 위해 삽입 부위는 심 박동 바로 위에 있어야 합니다. 심장 천자의 위험은 일반적으로 5 ~ 8%의 낮은 범위입니다. 심 혼에 바늘 후부의 삽입은 향상 한 출혈에 의해 보인 심 혼 천자의 리스크를 증가 합니다. 이러한 경우에, 동물 실험에서 제거 되어야 한다.

IT 주입 중에 또 다른 문제의 원인이 모 세관 수준에서 발생 합니다. 실제로 모 세관은 횡 력이가 해 졌을 때 깨질 수 있습니다. 이를 방지 하기 위해 바늘은 주사 축을 따라 직선으로 이동 해야 합니다. 때때로, 모 세관은 액체가 흐르는 것을 막는 조직 잔류물에 의해 막힐 수 있습니다. 주사 하는 동안 팁을 부드럽게 철수 하 여 바늘 차단을 해제할 수 있습니다. 이 흐름을 개선 하지 않는 경우, 우리는 완전히 흉부에서 바늘을 철회 하 고 바늘을 교체 하는 것이 좋습니다.

병 변은 심 낭에서 너무 깊이 삽입 된 바늘에 의해 발생할 수 있습니다. 심 막 낭에 있는 병 변을 피하기 위하여는, 바늘은 흉부에 너무 많이 (1-2mm) 삽입 되 면 안됩니다. 주입 볼륨이 8 µ L 보다 크면 일부 누수가 관찰 되었습니다.

제 브라 피시에서 심 막 유체의 정확한 구성은 알 수 없습니다. 그러나, 심 막 구멍의 부피는 ~ 10 µ L³¹에서 추정 된다. 성인 zebrafish 심 실의 부피가 약 1-2mm 인 것을 감안할 때,우리는 그에 따라 심 낭 구멍은 주사 전에 고려 되어야 하는 작은 부피를가지고 있다고 가정 합니다. 우리의 예비 연구에서, 우리는 주입 된 볼륨의 최적의 범위는 0.5와 3 µ l 사이에 있다 결정 2.5-2.8 센티미터 (거리 주 둥이에서 꼬리 peduncle). 이 볼륨은 물고기의 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 최대의 주입 5 µ L이 크기의 물고기에 어떤 병 변을 유도 하지 않았다. 그러나, 8 µ L에서 볼륨은 그림 1f에 도시 된 바와 같이 부풀어 오른 내부 출혈을 일으킬 정도로 충분 했다. 이 데이터를 토대로, 우리는 3 µ L 보다 큰 용액의 양이 장기에 신체적, 생리 적 스트레스를 유발할 수 있다고 추정 합니다. 이 제한은 주입 된 용액의 양을 증가 시키는 대신 분자의 높은 농도를 선택할 필요성을 유추 한다.

또 다른 중요 한 요인은 주입 된 용액의 삼 투 성질은 생리 적 범위 내에 있어야 한다. 실제로, 삼투성 스트레스의 위험을 방지 하기 위해, 우리는 주입 매체로 HBSS를 추천 합니다.

제 브라 피시에서 약물을 전달 하는 데 사용 되는 일반적인 방법은 수 처리 및 복 강 내 주입^30,35을 통해 서입니다. 이러한 기술 모두 많은 응용 프로그램에 적합 한, 그것은 주사 실험 및 경제적 이점을 제공 합니다, 원치 않는 전신 부작용의 위험을 감소 하 고 비용이 많이 드는 분자의 사용을 감소, 각각. 이 방법은 세포 계보 추적 분석에 사용 되는 ERT2 형질 전환 시스템을 활성화 시키기 위해 타 목 시 펜의 전달에 적합할 수 있으며, 재생 연구에서 기능적 연구를 위해 RNAs를 수정 하 여 가이드 한다.

제 브라 피시의 IT 인젝션 방법은 이전에^31,36에 설명 되어 있다. 그 보고에서, 흉부 내 주사는 인슐린 바늘, 전방 측에서 천공을 수행 하였다. 대조적으로, 우리의 프로토콜은 후방 방향에서 삽입 된 뽑아 유리 모 세관을 가진 대체 전략을 제시 합니다. 특히, 우리의 접근은 심장 천자의 감소 된 위험으로 주사를 최적화 하기 위해 물고기 심 낭의 해부학을 고려 합니다. 또한, 절차 동안, 물고기는 금속 집게에 의해 개최 되지 않습니다, 하지만 촉촉한 부드러운 스폰지,이는 물고기의 외부 부상을 방지 하기 위해 더 적합 한 방법입니다. 따라서, 제시 된 방법은 성인 제 브라 피시에서 심장 항상성, 전처리 및 재생에 대 한 연구에 더 적합할 수 있습니다.

그것은 이미 포유류 모델 유기 체에서 확립 된 주사. 실제로,이 방법은 또한 인간^37,38에서 돼지 및 임상 연구와 실험에 적용 되었다. 쥐에서, 초음파에 의해 유도 된 경 흉부 intramyocardial 주사는 그들의 심장³⁹에 도전 하는 데 사용 되었습니다. 이 문서 내에서 우리는 zebrafish에 대 한 그것의 사용을 완화 하기 위해 자세한 프로토콜을 제안. 이것은 심장 항상성, 사전 컨디셔닝 및 재생 연구에서 유전 접근법을 보완 하기 위해 필드에 특히 유용 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution	Gibco by Life technology	14065-056
Iridectomy scissor	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5602
Macroscope (binocular)	M400		with Apozoom
Micro-injector femtojet	Eppendorf	5247 0034 77
Microloaders femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette glass needles type C	WPI	TW100F-6	thin-wall capillary
Micropipette puller model P-87	Flaming/Brown	20081016	filament box 2.5 mm x 4.5 mm
Sponge	any	any	dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521
Dyes and Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-Chicken Cy5	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Concentration: 1/500
anti-Guinea pig Cy5	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Concentration: 1/500
anti-Rabbit Cy5	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Concentration: 1/500
Chicken l-plastin	gift from P. Martin, Bristol		Concentration: 1/1,000
DAPI	Sigma	10236276001	Concentration: 1/2,000 (1µg/ml); 1/100 IT injected
Guinea pig anti-ColXII	gift from Florence Ruggerio, Lyon		Concentration: 1/500
Phalloidin-Atto-565 (F-actin)	Sigma	94072	Concentration: 1/500
Phalloidin-Atto-647 (F-actin)	Sigma	95906	Concentration: 1/50 IT injected
Rabbit anti-MCM5	gift from Soojin Ryu, Heidelberg		Concentration: 1/500
Stamping Ink 4K	Pelikan	1 4k 351 197	Concentration: 1/1
ISH probe primers
Cystatin			gene number: ENSDARG00000074425 fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC