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요약

이 프로토콜은 신장 독성 제로 cisplatin를 사용하여 성인 얼룩말 피시에 급성 신장 상해 (AKI)를 유도하는 절차를 설명합니다. 신장 조직에서 염증및 세포사멸을 분석하기 위한 기술과 2가지 기술의 재현성을 평가하는 단계, 각각 세포측정및 TUNEL을 상세히 설명했다.

초록

시스플라틴은 일반적으로 화학 요법으로 사용됩니다. 암 치료 개인에 긍정적인 효과, cisplatin 쉽게 그것의 낮은 분자 량으로 인해 신장에 축적 될 수 있습니다. 이러한 축적은 관 세포의 죽음을 일으키고 신장 기능, 조직 손상 및 면역 세포 침투의 빠른 감소를 특징으로하는 급성 신장 손상 (AKI)의 발달을 유도 할 수 있습니다. 특정 용량으로 투여되는 경우 시스플라틴은 동물 모델에서 AKI 유도체로서 유용한 도구가 될 수 있다. 제브라피쉬는 신장 구조가 포유류와의 기능적 유사성을 보존하기 때문에 신장 기능, 신장 재생 및 부상을 연구하는 흥미로운 모델로 나타났습니다. 시스플라틴으로 주입된 성인 얼룩말물고기는 24시간 후 주사(hpi) 후 생존, 신장 세포 사망 및 염증 마커 증가 등을 나타낸다. 이 모델에서, 면역 세포 침투 및 세포 사멸은 유동 세포 측정 및 TUNEL 분석에 의해 평가될 수 있다. 이 프로토콜은 복막 시슬라틴 주사에 의해 성인 얼룩말피에서 AKI를 유도하는 절차를 설명하고 이후에 유동 세포측정 처리 및 세포 사멸 TUNEL 분석법을 위한 신장 조직을 수집하는 방법을 보여줍니다. 이러한 기술은 신독성 제제로서의 시스플라틴의 효과를 이해하는 데 유용하며 성인 제브라피시의 AKI 모델 의 확장에 기여할 것입니다. 이 모델은 또한 신장 재생을 연구하는 데 사용할 수 있습니다, 치료하거나 신장 손상을 방지하고 AKI에서 염증을 연구하는 화합물을 검색. 더욱이, 이 프로토콜에 사용된 방법은 신장 관련 comorbidities에 있는 치료 표적인 조직 손상 및 염증의 특성화를 향상할 것입니다.

서문

신장은 혈액 여과, 과잉 잔류물의 제거 및 이온 농도1의조절과 같은 항상성을 유지하는 몇 가지 중요한 생리적 기능에 대한 책임이 있습니다. 신장 조직의 손상은 급성 신장 손상 (AKI)이라고 불리는 이질적 상태로 이어질 수 있으며, 이는 임상적으로 관 상피 세포의 파괴 및 사망으로 인한 신장 기능의 급격한 감소로 설명되며, 내피 세포 손상 및 백혈구 침투 2,3. AKI는 입원4의8-16%에서 발생할 것으로 예상되는 상태이며, 중환자실(ICU)에서 20~50%의 높은사망률을 갖는다. 이 질병은 입원 증가 및 재정 자원5의상당한 사용과 관련이 있습니다. 이염인은 탈수, 충격, 감염, 패혈증, 심혈관 질환 및 신증후군 약물6을포함한다. 신장 독성은 약물에 의해 유도된 신장 상해로 정의되며, AKI, 튜튜병 및 구종병증7로효과를 일으킨다. 신장 독성은 ICU에서 처방된 약 20%의 약물이신독성으로간주되기 때문에 ICU 환자의 3분의2에영향을 미치며,여기에는 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 반코미신 및 아미노글리코사이드와 같은 항생제, 메토트렉세이트 및 시스플라틴7과같은 화학요법제를 포함한다. Cisplatin는 머리와 목, 고환, 난소 및 방광10과같은 고형 종양의 치료에 사용되는 가장 강력하고 일반적인 화학 요법 약물 중 하나입니다. 신장에서, 시스플라틴은 유기 양이온 수송기 2(OCT-2)를 통해 근위 형 복잡한 튜브(PCT)에서 내면화되고 고농도에서 DNA 발동세포 사멸 경로7,10,11,12에결합한다. 신장에 있는 이 약의 축적은 죽음과 염증을 가진 신증후군에 기여합니다13. 이 해로운 부작용은 시스플라틴 치료를 받고 있는 암 환자의 1/3의 삶과 예후에 엄청나게 영향을 미치므로 암세포에 대한 살인 효과를 잃지 않고 신독성을 낮출 수 있는 새로운 치료법의 연구가 필수적이다10.

이러한 신혈 독성 효과 로 인해, 시스플라틴은 일반적으로 앞으로 설명된 바와 같이 실험동물 모델에서 AKI의 인덕터로 사용된다. 설치류에서는, cisplatin에 의해 유도된 첫번째 AKI 모형은 1971년14년에 보고되었지만, 현재, 많은 다른 프로토콜은 cisplatin15의복용량 의존및 누적 효력을 사용하여 나타났습니다. 따라서, 투여량 및 출원 건수에 따라 신장 손상의 중증도의 상이한 등급은16,17,18,19,20,21을유도할 수 있다. 가장 빈번한 방법은 다음 날에 안락사 다음으로 시스플라틴의 한 복용량의 인회간 (i.p.) 주사로 구성됩니다. 이 고전적인 프로토콜에서, cisplatin의 단일 높은 신증후군 복용량 (쥐에 10-13 mg/kg 및 쥐에 3-8 mg/kg) 심한 조직 변화를 유도, 브러쉬 테두리및 관 루멘 내부 세포 파편의 손실 등, cisplatin 주입 후 며칠. 조직학적 변화의 중증도는 투여량의존성이며, 재생의 징후는 시스플라틴 주입후7일,17일후에 관찰된다.

설치류 모델은 잘 확립되어 있지만, 우리는 다른 척추 동물의 특성을 활용하기로 결정, 제브라피시(다이오 리리오)에우리의 연구를 집중. 이 물고기는 작은 크기, 외부 수정, 높은 재생산 율, 빠른 발달, 배아 및 유충의 투명성, 낮은 유지 보수 비용, 포유류와 유사한 해부학 (일부 예외), 높은 조직 재생 능력, 사회적 행동, 인간과의 유전 유사성의 70 %, 인간과의 유전 유사성의 84 %로 인해 인간 질병을 모델링하는 데 광범위하게 사용되어왔습니다. Streisinger 외.23,24,25 척추 동물 발달의 유전 분석을 위해이 모델 유기체를 활용의 실용성을 확인 하는 제브라피시와 연구를 시작. 신장 연구에서, 제브라피쉬는 발달 연구에서뿐만 아니라 신장질환(26)과연결된 새로운 유전자를 찾는 유전적 도구로도 등장하고 있다. 더욱이, 흉터 형성 없이 재생능력과 신뇌증이라고 불리는 신프론을 생성하는 능력은 제브라피쉬를 재생 연구의 핵심 동물 모델로만든다(27,28). 더욱이, 급성 및 만성 신장 손상을 포함한 다른 신장 질환에 대한 실험 모델의 가용성은, 이 실험 유기체의 다재다능함을입증한다(26,29). 포유류에서와 마찬가지로, 제브라피시의 신장 전구는 중간 중구에서 파생됩니다. 이러한 신장 선조는 나중에 성년29,30까지성숙한 기관으로 유지될 메소네프로 발전할 경향이 있는 phros를 생성합니다.

성인 얼룩말 피시 신장은 신체의 등쪽 벽에 위치하고 있으며, 수영 방광과 중추(29)사이에 있습니다. 복부 보기에서, 제브라피쉬는머리(H),트렁크(Tr), 꼬리(Ta)29로세분화할 수 있다. 포유류와 동일, 제브라피쉬는 신장의 기능 단위로 네프론을 가지고 있으며, 이는 관체세그먼트(도 1A):신장 코퍼스클(RC), 근위 경련(PCT), 근위 직선 관(PST), 말단 조기(DE), 후기 말단(DL) 및 수집(CD)덕트(CD) 29로나뉜다. Zebrafish는 인간 네프론(도1B)과유전적 보존 및 구조적 유사성을 공유하지만 중급 튜블러와 같은 일부 적합성이 부족하며, 헨리(LH)29,31의고리라고도 한다. 제브라피쉬와 같은 민물고기는 일반적으로 매우 낮은 방아질을 가진 매체에 둘러싸여 있기 때문에, 그(것)들은 hyperosmotic 경향이 있고 아가미, 초기 단계에서 피부 및 신장에 의존하는 경향이 있습니다32. 경향이 있는 대동맥에 의한 등쪽 대동맥에서 혈액의 여과는 약 48h 후 수정(hpf)33,34에서시작된다. 제브라피쉬의 신장은 대사 폐기물 배설기관일 뿐만 아니라 4일 후 수정(dpf)에서 성인기까지 조혈기관으로 작용하며포유류(35)의골수와 동등하다. 개발 중, 조혈 줄기 세포(HsC)는 신장, 자가 개조, 골수성, 에리스로이드 및 림프구 세포 계보를 생성하고, 전사 인자 유지, 신호 분자 및포유류36,37을가진 고도로 보존된 유전 프로그램을 생성한다. 연구 결과에 따르면 인간 면역 계통의 대부분의 에리스로이드, 혈전, 골수성 및 림프구세포는 제브라피쉬37,38에존재한다. 이 동물의 독특한 특성과 인간의 신장과 보존 된 특징은 신장 기능, 부상 및 재생의 연구에서 이 모델 유기체를 유리하게 만들었습니다.

제브라피쉬의 신장이 잘 연구되고 있으며 AKI의 일부 모델은 이미 애벌레와 성인제브라피쉬(28)에서사용할 수 있지만, 이 프로토콜이 설립될 당시에는 성인 제브라피시에서 화학적으로 유발된 비항생제 AKI 모델의 증거가 없었다. 이 외에도, 우리의 실험실은 재생 및 신장 손상을 연구하기 위해 프로바이오틱 박테리아와 미생물 유래 화합물을 테스트하는 데 중점을 두고 있으며, 따라서 성인 물고기에서 새로운 시스플라틴 유도 AKI 모델을 만드는 데 노력을 집중했습니다. 본 원고에 제시된 비디오 기사는 동물(120 μg/g) g당 120개의 우그 시스플라틴을 i.p. 주입하여 AKI 유도의 새로운 모델에 대한 절차를보여줍니다(도 2A). 이 복용량은 처음에 약 갔다 뮤린 모델에서 시스플라틴에 의해 유도 된 AKI의 연구에 기초했다 10 mg/kg (에 해당 10 μg/g)14,15,16,17,그러나, 이 복용량은 신장 독성과 관련된 신장 손상을 유도하기에 충분하지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 따라서, 우리는이 연구에서 사용되는 것들에 대한 용량을 증가(도 2B). 우리의 연구는 관 구조의 손실에 의해 표시된 바와 같이 신장 조직 손상 24 hpi의 유도와 함께 주입 후 생존율에 있는 cisplatin의 복용량 의존적인 효력을, 증가한 선동적인 침투 및 세포 사멸의 높은 비율에 의해 표시되었습니다. 여기서, 우리는 cisplatin 유도 AKI의 발달을 분석하기위한 두 가지 기술을 설명합니다 : 유동 세포측정, 세포 침투 를 분석하고, TUNEL, 세포 사멸을 측정합니다. 유동 세포측정은 세포의 물리적(크기 및 세분성) 및 화학적(형광화합물) 특성을 측정하는 기술이다. 세포계 내부는 세포 현탁액이 한 줄로 세포를 구성하는 칼집 유체를 통해 실행되어 한 번에 레이저 빔 1 세포를 통과할 수 있게합니다(그림 3A). 광선 앞의 검출기는 세포 크기와 상관관계가 있는 전방 분산(FSC)을 측정하고, 측의 검출기는 세포의 세분성과 상관관계가 있는 사이드 스캐터(SSC)를 측정합니다. 다른 검출기는 입자, 형광단백질 또는 항체 표지세포39,40로부터형광을측정할 것이다. 제브라피시에 대한 상업적 항체가 부족하기 때문에 동물 기자와 형광 바이오마커를 사용하면 이러한 분석을 개선하고 다양한 세포 집단을 식별할 수 있습니다41,42,43. 이 프로토콜에 사용된 또 다른 도구는 터미널 탈옥핵디딜 트랜스퍼라제(TdT) dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 분석이었다. TUNEL 분석법은 TdT의 능력에 의존하여 단편화된 DNA를 식별하고 나중에 현미경검사기(44)에 의해 시각화및 정량화될 수 있는 형광 마커로 태그된 탈옥뉴클레오티드로 라벨을 부착하는 후기 단계 세포분석 법이다. AKI의 가장 눈에 띄는 특징 중 하나는 관 신장 세포3에서세포사멸의 유도임을 고려하면,이 기술은 유동 세포측정 및 / 또는 현미경 검사법에 의해 분석 될 수 있기 때문에 매우 유리하다.

이 문서에서 제시된 접근은 AKI 상태의 관찰을 허용하고 시스플라틴 관련 AKI에 있는 새로운 치료 표적의 연구에 유용할 수 있는 AKI 무질서를 공부하는 새로운 급성 모형을 제안합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 기술된 절차는 이전에 상파울루 대학의 생물 의학 과학 연구소의 동물 사용 윤리위원회에 의해 제브라피시 모형에 이용되기 위하여 승인되었습니다.

1. 시스플라틴 인트라페론 주입에 의한 AKI 유도

  1. 재고 용액을 850 μg/mL로 0.9% NaCl로 희석하여 시스플라틴 작업 솔루션을 준비하십시오. 빛으로부터 보호, 실온에서 유지합니다.
    주의: 제작은 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비 (PPE)로 시스플라틴을 조작할 것을 권장합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 스톡 솔루션을 보관하십시오.
  2. 시스템수(45)에서150 mg/L MS-222(트리카인) 마취제를 준비한다. 약 1-2 분 동안 침수하여 성인 얼룩말 피시 (5-9 개월)를 마취합니다.
    참고 : 효과적으로 마취 된 물고기는 터치에 응답하지 않아야합니다. 효과적인 마취를 테스트하려면 카달 지느러미를 부드럽게 눌러 반응을 관찰합니다.
    주의: 트리카인은 피부와 눈에 자극제이며 PPE를 사용하여 조작합니다.
  3. 플라스틱 숟가락을 사용하여 물고기를 종이 타월과 같은 흡수성 표면으로 옮겨 몸 주위의 과도한 물을 제거합니다. 그런 다음 플라스틱 숟가락으로 물고기를 페트리 접시에 옮기고 물고기를 무게로 옮기습니다. 그것은 복용량 계산에 필요한 것 이다 물고기의 무게의 주의.
    참고 : 물고기에서 여분의 물을 흡수하면 동물의 체중이 과대 평가되지 않으며 물고기에 대한 편견이기 때문에 지나치게 건조하지 않습니다.
  4. 120 μg/g의 중량의 최종 투여량을 달성하기 위해, 시스플라틴 작업 용액(850 μg)의 μg당 최종 용량(120 μg)의 μg를 나누고 이 숫자를 1000μg(μL)로 변환하여 120μg의 부피를 얻습니다(141L). 그런 다음 물고기(g)의 중량에 대해 이 숫자(141.2 μL)를 곱하여 최종 부피를 주입하게 한다.
  5. 플라스틱 숟가락으로 젖은 스폰지에 물고기를 옮기고 약간 잘라서 복부 쪽을 위로 올려 다드시게합니다. 스폰지는 시스템 물에 마취와 젖은해야합니다.
  6. 31 G 1.0 mL 인슐린 주사기를 cisplatin 작업 용액의계산된 부피로 채웁니다.
  7. 바늘을 골반 지느러미 근처의 동물의 복막 부위에 삽입하여 얕은 각도로내장(도 2A)을뚫지 않도록 합니다. 그런 다음 천천히 용액을 주입합니다.
  8. 주사 후 마취에서 회복하기 위해 탱크에 물고기를 배치합니다. 정상적인 회복의 징후(예 : 수영 운동, 안구 운동)에 대한 물고기를보십시오.
    참고: 동물은 다음 3-5분 안에 회복해야 합니다. 필요한 경우 플라스틱 숟가락, 파스퇴르 플라스틱 파이펫으로 움직이거나 거품이있는 호스에 가까이 두어 물고기를 자극하십시오.
  9. 제어 물고기의 경우 0.9 % NaCl의 용액을 주입하여 동일한 절차를 수행하십시오. 체급의 비율에 따라 동일한 계산을 사용하십시오: 주입되는 부피는 물고기의 무게(g)를 곱한 141 μL이 됩니다.
  10. 다음날(그림 2B)에서하루에 두 번 이상 물고기의 생존을 모니터링합니다.

2. 면역 세포의 유동 세포종에 대한 신장 격리 및 조직 처리

  1. 이 절차에 대 한, 면역 세포 형광 표시 형질 형 질 동물을 사용(예를 들어,Tg(mpo:GFP)).
  2. 120 μg/g 시스플라틴24마피 후 저열 쇼크(급속한 냉각)로 동물을 안락사시합니다.
    참고: 저열 쇼크는 MS-222 과다 복용보다 안락사 방법으로 더 효과적인 것으로 입증되었습니다. 저열 쇼크는 MS-222의 사용보다 스트레스가 적고 빠르며 일관적이며 직원에게 안전하며이전에는 46,47을설명했습니다.
  3. 외부 횡단 탱크에서 얼음의 5:1 비율로 얼음물을 시스템 물에 넣고 내부 탱크를 얼음 위에 스크린으로 놓고 물이 2-4 °C에 도달 할 때까지 기다립니다.
    참고: 물고기는 열 화상과 통증을 유발할 수 있기 때문에 얼음과 직접 접촉해서는 안됩니다.
  4. 동물을 얼음물로 옮기고, 방향이 손실되고 안구 이동이 없을 때까지 최소 10분 이상 기다립니다.
  5. 플라스틱 숟가락으로 생선을 종이 타월에 놓고 여분의 물을 건조시다.
  6. 물고기를 3% 아가로즈 해부 판으로 옮기고 상부 조명이 있는 스테레오스코프 아래에 가져가십시오. 가위로, 눈 바로 뒤에 빠른 컷을 만드는 물고기를 참수, 머리를 제거.
  7. 미세 한 가위로 클로카에 열린 측면에서 잘라 미세 한 집게와 내부 장기를 제거 합니다.
  8. 곤충 핀을 사용하여 신체 벽의 측면을 꼬집어 시체를 열고 백본에 부착 된 신장을 노출하십시오.
  9. 미세 한 집게와 신장을 분리 하 고 1 x PBS/2% FBS의 차가운 용액으로 6 웰 플레이트에 장기를 배치 합니다. 얼음을 유지합니다.
  10. 파스퇴르 플라스틱 파이펫으로 조직을 집어 들고 50mL 튜브를 통해 40 μm 세포 여과기를 통과하여 주사기 플런저로 부드럽게 선별합니다.
  11. 1x PBS/2% FBS1mL로 두 번 세척하고 50mL 튜브로 세포를 수집합니다.
  12. 4°C에서 5분 동안 400 × g의 원심분리기 세포.
  13. 조심스럽게 1 mL 마이크로 파이프로 모든 상체를 선택하고 폐기. 감기 1x PBS 500 μL을 추가하여 세포를 다시 중단하고 5mL 흐름 세포측정관에 넣습니다. 얼음을 유지합니다.
  14. 트리판 블루에서 1:10 희석을 만드는 노이바우어 챔버의 세포를 카운트(예를 들어,샘플의 10 μL을 가지고 트립판 블루의 90 μL와 혼합). 노이바우어 챔버에 혼합물의 10 μL을 추가하고 현미경으로 세포를 계산합니다.
    참고: 최적의 결과는 1-5 x 106 셀/mL 및 >80% 생존능력으로 예상됩니다.
    주의: 트라이판 블루는 발암제이며 PPE를 사용하여 처리합니다.
  15. 세포계에 의해 읽을 수있는 세포를 가져 가라. 그런 다음 관심 있는 인구를 선택하는 결과를 분석합니다.

3. TUNEL 분석용 성인 제브라피시 신장 조직 처리

  1. 이 절차에 대 한, 야생 형 동물(예를 들어,AB, Tübingen, 등) 또는 TUNEL 키트 보다 다른 형광 색을 가진 형질 동물을 사용 하 여, 비슷한 형광TUNE의 분석을 방해할 수 있습니다.
  2. 120 μg/g 시스플라틴24마피 후 저열 쇼크(급속한 냉각)로 동물을 안락사시합니다. 2.3-2.4를 참조하십시오.
  3. 2.5-2.6에 설명된 대로 물고기를 해부한다. 신장은 고정 절차 도중 백본에 붙어 있어야 합니다 (아래에 설명된).
  4. 곤충 핀을 사용하여 신체 벽의 측면을 꼬집어 시체를 열고 코르크 표면에 고정하여 신장을 노출시합니다.
    참고: 이 절차는 신장이 나중에 분석을 위한 적당한 위치에 남아 있는지 확인합니다.
  5. 그런 다음 신장이 6 웰 플레이트에 내려 와 코르크 표면을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 갓 만든 용액 위에 놓습니다. 하룻밤 동안 4 °C로 유지하십시오.
    주의: PFA는 피부와 점액 표면에 대한 발암성 및 자극성입니다. 눈 보호 장비를 포함하여 PPE를 사용하여 화학 후드 아래에서 PFA 솔루션을 준비하십시오.
  6. 다음 날, 2.8에서와 같이 신장을 해부합니다. 신장을 1x PBS로 60mm 페트리 접시에 놓고 1x PBS로 두 번 헹구는 다.
  7. 조직에 대한 지지 매트릭스를 생성하기 위해 2 % 아가로즈를 준비합니다.
  8. 페트리 접시에서 남은 1x PBS를 모두 버리고 2% 아가로즈를 천천히 부어 전체 장기를 덮습니다. 그런 다음 신장이 접지되는 것을 방지하기 위해 스테레오 현미경으로 미세 한 집게를 사용하여 신장을 배치합니다. 실온에서 아가로즈가 고화시키도록 하십시오.
    참고: 이 절차는 장기의 잎 모양이 지지 매트릭스 내부에 없는 경우 접는 경향을 일으키기 때문에 조직학적 처리를 통해 장기의 방향과 모양을 유지합니다.
  9. 아가로즈 고화 후 메스를 사용하여 조직 주위의 아가로즈를 자르고 작은 큐브를 형성하고 조직 주위의 아가로즈를 제거하십시오.
  10. 아가로즈 큐브를 조직학적 처리에 적합한 카세트에 넣습니다.
    참고: 다음 단계는 수동으로 또는 자동 티슈 프로세서에서 수행할 수 있습니다.
  11. 먼저, 실온에서 각각 45분 씩 다음 단계로 카세트에서 티슈를 처리하고, 1개의 목욕50%, 에탄올 70%, 에탄올 95%의 2회 연속 목욕탕, 100% 에탄올3회 연속 목욕. 그 후, 자일렌의 2회 연속 목욕탕과 파라핀 3회 연속 목욕탕에서 조직을 처리한다. 후자는 60 °C에서 각각 1 시간 동안 지속됩니다.
    주의: 화학 후드 아래에서 변경, 에탄올과 자일렌에서 증기는 자극과 독성입니다.
  12. 파라핀 블록을 준비하려면 파라핀 렌틸콩을 60°C로 녹입니다.
  13. 내부에 티슈가 있는 플라스틱 카세트를 열고 따뜻한 접시에 보관하십시오. 파라핀을 위한 워밍업 금속 금형.
  14. 핀셋으로 조직을 금속 금형 위에 배치하여 신장 길이가 금형 베이스와 평행하도록 합니다. 파라핀을 추가하고 필요한 경우 조직을 재할당합니다.
  15. 카세트의 베이스로 금형을 덮고 그리드가 덮일 때까지 파라핀을 추가합니다. 실온에서 고화한 다음 -20°C에 배치하여 더 빠른 응고 공정을 허용합니다.
  16. 20-30분 후 금속 금형에서 파라핀 블록을 방출합니다.
  17. 마이크로토메를 사용하여 파라핀에 내장된 조직을 5 μm 두께로 섹션화합니다. 조직을 수집하기 위해 사분해 또는 양으로 충전 된 유리 슬라이드를 사용합니다.

4. 튠 분석

참고: 다음 프로토콜은 In Situ 세포 사망 탐지 키트(재료 표)를 사용합니다.

  1. 5 분 동안 자일렌의 두 개의 연속 목욕에 배치 탈왁스 조직 슬라이드. 그런 다음 등급이 매겨진 일련의 에탄올을 통해 조직을 수화합니다: 각각 100%-95%-70%-50%, 5분마다.
  2. 차가운 수돗물에 슬라이드를 놓아 에탄올을 헹구십시오. 슬라이드를 증류수에 보관하십시오.
  3. 어두운 인큐베이터 챔버를 준비합니다. 잠복 단계 동안 수분을 유지하기 위해 바닥에 젖은 종이 타월을 추가합니다.
    참고: 인큐베이터 챔버가 부족하면 바닥에 촉촉한 종이가 있는 페트리 접시와 슬라이드를 배치하기 위해 두 개의 이쑤시개를 사용할 수 있습니다.
  4. 신선한 Proteinase K 작업 용액준비 : 10 mM Tris / HCl, pH 7.4-8에서 10 μg / mL.
    참고: Proteinase K는 제조업자가 권장하는 투과성 제제로 사용됩니다.
  5. 어두운 인큐베이터 챔버에 슬라이드를 놓고 커버 샘플까지 Proteinase K 작업 용액을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
  6. 샘플이 인큐베이팅되는 동안 TUNEL 반응 혼합물을준비하십시오: 450 μL 라벨 용액에 50 μL의 효소 용액을 추가합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
    참고: 준비해야 할 볼륨은 동일한 1:10 비율로 조정할 수 있습니다. 부피는 각 섹션에 대한 혼합물의 50 μL로 계산됩니다. 이는 샘플의 크기에 따라 변경될 수 있습니다.
  7. 어두운 챔버를 들고 1x PBS로 슬라이드를 두 번 씻으십시오.
  8. 다음으로, 흡수성 종이를 사용하여 시료 주변의 부위를 건조시키고 각 조직 슬라이드에 TUNEL 반응 혼합물의 50 μL을 추가하고, 전체 샘플이 덮여 있도록 용액을 확산시다. 2 시간 동안 37 °C에서 인큐베이션하십시오. 빛으로부터 보호하십시오.
  9. 인큐베이션 후 1x PBS로 슬라이드를 세 번 헹구고 종이 타월을 사용하여 시료 주변의 부위를 건조시로 건조시.
  10. DAPI 1:1000의 50 μL을 샘플에 추가하고 핵 카운터 스테인링을 위해 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하십시오. 빛으로부터 보호하십시오.
  11. 1x PBS로 다시 세 번 헹구고 시료 주변의 부위를 건조시하십시오.
  12. 페이드 방지 친성 배지로 슬라이드를 마운트하고, 커버슬립을 배치하고, 매니큐어로 밀봉합니다. 4°C에서 빛으로부터 보호된 수평으로 슬라이드를 저장합니다.
    참고: 마운팅 매체의 페이드 방지 특성은 시료의 형광을 보존하지만 사용 가능한 모든 친성 성 배지를 사용할 수 있습니다. 매니큐어를 가진 마지막 밀봉 단계는 탈수를 피하기 위해 중요합니다.
  13. 형광 현미경의 밑에 견본을 시각화합니다. 형광 색소의이 유형의 경우, 520-560 nm (녹색) 범위에서 발산 파장을 사용하고 570-620 nm (빨간색)의 범위에서 검출하십시오.

결과

제브라피쉬의 신장은 등쪽 벽에 위치한 평평한 색소기관이며, 그 기본 기능성 단위인 네프론은포유류(도 1)로보존된다. 재생용량이 높은 신장을 단 한 개만 갖는 특수성은 이 모델 유기체를 모델 신장 손상에 대한 훌륭한 선택입니다. 본 작품에 제시된 프로토콜은 성인 제브라피시(그림2)에서시스플라틴의 인트라피들(i.p.) 주입에 의해 AKI를 유도하도록 설계되었으며, 나중에 이전에 상세한 두 가지 기술로 분석되도록 설계되었습니다: 유동 세포측정법(도3A)및 TUNEL(그림3B). 전체 프로세스의 순서도는 그림 4에묘사됩니다. cisplatin의 복용량은마우스모델15,16,17에기술된 것을 기반으로 처음에 적용되었으며, 사용되는 표준은 동물의 kg당 10-13 mg의 시스플라틴(mg/kg)이다. 그러나, 제브라피쉬는 마우스(도시되지 않은 데이터)보다 시스플라틴에 더 강한 것으로 나타났으며, 최종 투여량이 증가하였다. 동물의 생존율을 평가했을 때, 실험은 시스플라틴(도5A)의투여 의존효과를 보였다. 이 때문에, 우리는이 프로토콜에 설명 된 대로 정확하게 지침을 따르고 어떤 물질을 수집하기 전에 재현성의 척도로 동물의 생존율을 지속적으로 모니터링하는 것이 좋습니다. i.p. 주사 후 120 μg/g 시스플라틴(도5A,레드라인)은처음 24시간 동안 동물의 약 30%의 생존율이 감소하여 5일째에 살아있는 동물의 약 20%에 도달할 때까지 생존율이 점차 감소하여 안정화(그림5A). Cisplatin 독성은 남성과 여성이 유사한 생존 곡선(도 5B)을가지고 있기 때문에 동물의 성별에 의해 영향을받지 않았다.

시스플라틴 유도 AKI의 운동역학의 분석은 신장 24 마키에서 증가 염증과 세포 죽음을 보였다. 염증을 평가하는 가장 빠르고 정량적인 방법 중 하나는 혈류 세포법이지만 이 기술에 대해 시판적으로 사용할 수 있는 제브라피쉬 항원에 대한 항체의 부족을 감안할 때 면역 마커를 사용하여 형질전환선을 사용해야 합니다. 요즘, 면역 세포를 표지하는 많은 제브라피쉬 라인에 접근할 수 있다(표 1). 이들 라인은 분석48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60을위한 충분한 레퍼토리를 부여하여, 노래적으로 사용하거나 조합할 수 있다. 이는 기계적 분리에 의한 세포의 분리 후, 세포계의 직접 판독이 가능하기 때문에 항체 배양 단계가 필요하지 않기 때문에 이 기술을 엄청나게 단순화한다.

앞서 언급했듯이, 제브라피쉬의 신장은 동종성 기능을 가진 혈액 여과 기관일 뿐만 아니라 성인의 조혈의 해부학적 부위이며,포유류의 골수(33,34,35)에해당한다. 이러한 방식으로 유동 세포측정에 의해 분석하면 인간혈액(61)및62(도 6A)에필적하는 세포 집단을 분화할 수 있으며, 이를 통해 처음에는 크기와 세분성별로 세포 집단을 식별하고 이물질을 배제할 수 있다. 이 경우, 우리는 호중구에 존재하는 효소 골수구산소증과 함께 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 Tg (mpo:GFP)52라는 형질 대사를 사용했다. 이를 알고, 우리의 게이트 전략은 과립구의 인구의 초기 분리에 기초했다(그림 6B). 그 다음, 이중 세포는 분석을 크게 변경하고 부정확한 결론으로 이어질 수 있기 때문에 제외되었습니다. 더블트는 2개의 독립적인 입자로 구성된 단일 이벤트이며 전방 산란 높이(FSC-H) 대 전방 산란 영역(FSC-A) 밀도플롯(도 6C)을선택하여 배제될 수있다. 이 단계 후, 형광 마커를 발현한세포(도 6D)를식별하고 선택하였다. 마지막으로, 인구 통계는 분석에서 추출되어 세포의 백분율로플롯되었다(그림 6E).

시스플라틴 신엽독성의 가장 두드러진 특징 중 하나는 관 세포사멸(10)이며,이를 쉽게 시각화하기 위해 우리는 세포멸 검출을 위해 TUNEL 분석기를 사용하였다. 이 방법은 병렬 형광이 분석을 방해하기 때문에 형광 마커가 부족한 야생 형 세포 및 조직을 사용하는 것이 좋습니다, 제브라피쉬의 경우 AB와 같은 야생 형 라인을 사용하는 것이 좋습니다, Tübingen, TAB, 또는 TUNEL 형광 광을 방해하지 않는 형광 단백질과 형질 선을 변환 라인. TUNEL 기술은 유동 세포측정법 또는 현미경 검사를 통해 분석을 허용합니다. 현미경 검사는 조직 구조를 보존하는 장점이 있어 어떤 세포가 죽어가고 있는지 확인할 수 있습니다. 형광 현미경의 밑에, 세포 세포의 밝은 핵은 배경에서 쉽게 분화될 수 있습니다. 시스플라틴(도7B)으로주입된 동물은 24마력에서 대조군(도7A)보다더 많은 죽은 세포를 갖는다. 최종 정량화는 FIJI 소프트웨어의 세포 카운터 옵션으로 만들어졌으며 대조군보다 시스플라틴 처리 된 신장에서 통계적으로 더 많은 죽은 세포를 보였다(도 7C)

이 원고에 설명된 프로토콜은 성인 제브라피시에 AKI의 유도자로 시스플라틴을 사용하는 방법을 보여 주었으며, 이는 용량 응답자, 빠르고 신뢰할 수 있습니다. 생존율에서 얻은 데이터와 염증(유동 세포측정에 의해 검출됨) 및 세포사멸(TUNEL 분석에 의해 검출됨)을 포함한 시스플라틴신독성의 징후의 측정에 기초하여, 우리는 AKI 관련 질병의 향후 치료법뿐만 아니라 시스플라틴 신증후군 연구를 위한 이 모델을 제안한다.

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그림 1: 제브라피시와 인간의 신장의 구조 및 비교. A. (1) 물고기의 등쪽 벽에 위치한 어두운 갈색으로 표현된 신장을 가진 성인 얼룩말피의 측면 보기, 수영 방광 (sb)과 중추 사이. (2) 수집 덕트(blue)에 연결된 신장의 복부 보기(yellow)를 나타낸다. 신장의 다른 지역은 표시됩니다 : 머리 (H), 트렁크 (Tr), 꼬리 (Ta). (3) 제브라피시 네프론과 그 세그먼트를 나타내는 회로도는 인간 네프론과 유전 보존 지역과 일치하도록 표지되고 착색된다. B. (1) 인간의 신장의 적시보기. (2) 분류및 색이 있는 인간의 네프론을 묘사한 회로도. RC: 신장 코퍼스클; PCT: 근위 경련관; PST: 근면 직선 튜블러; TL: 얇은 사지; LH: 헨리의 고리; TAL: 두꺼운 오름차순 사지; DE: 일찍 말; DL: 늦은 말; DCT: 단상 복잡한 튜블러; CD: 덕트를 수집합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 시스플라틴 유도 AKI에 대한 실험 설계. A. 주사 시술 시 바늘의 위치를 가리키는 성인 얼룩말 피시의 측면 및 복부 보기. 바늘은 배에서 20-30° 각도로 침투하며 내장에 구멍을 뚫지 않도록 복부 벽에 천천히 평행하게 삽입됩니다. B. 시스플라틴 유도 AKI의 실험 설계: (1) 시스플라틴 120 μg/g의 주사제는 0일째에 동물당. (2) 3단계를 시도하기 전에, 주사 후 물고기의 생존 모니터링은 1일부터 10일까지 권장됩니다. (3) 신장 해부는 추가 처리 기술을 위해 시스플라틴 주입 후 하루 후에 해부합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 유동 세포측정 및 TUNEL 기술의 메커니즘. A. 유동 세포계의 개요: 세포의 현탁액은 칼집 유체에 의해 한 줄에 유체역학적으로 초점을 맞추고, 세포가 레이저 빔 앞에서 하나씩 통과하게 합니다. 전방 및 측의 검출기는 전방 분산(FSC), 측면 분산(SSC), 및 세포의 형광을 측정합니다. B. TUNEL 분석의 원리. 말단 탈옥핵오디딜 트랜스퍼라제(TdT)는 단편화된 DNA의 3'-OH 단부에 형광 표시 dUTP의 첨가를 중재한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 표현 된 기술의 순서도. A. 혈류 세포측정(orange) 또는 TUNEL(blue)을 통해 신장 조직을 분석할 때 따라야 할 단계를 보여주는 순서도는 시스플라틴 주입(grey)에 의해 AKI를 유도할 때 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 시스플라틴 주입 물고기의 생존 모니터링. A. 시스플라틴 주사의 다른 투여량의 생존율 (25 - 50 - 112.5 - 120 μg/g). 로그 랭크(Mantel-Cox) 테스트, ** p < 0.01. B. 120 μg/g 시스플라틴으로 주입된 암컷 대 남성의 생존율. 로그 랭크(맨텔 콕스) 테스트, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 형질형 제브라피시 라인의 게이트 전략. A. 제브라피시 성신장 세포의 밀도 플롯, 인구는 크기(FSC-A) 및 세분성(SSC-A)으로 구분된다. 다른 인구는 색깔의 타원형/원으로 선택됩니다. 핑크: 에리스로이드; 블랙: 림프구; 노란색: 전구체; 빨간색: 과립구. B. 신장내 과립구 집단을 선택하기 위한 측면 산란 영역(SSC-A) 및 전방 산란 영역(FSC-A)의 밀도 플롯. C. 과립구 문 내부의 단일 모집단 선택을 위한 전방 분산 영역(FSC-H) 및 전방 산란 영역(FSC-A)의 밀도 플롯. D. 신장에서 mpo:GFP 양성 세포(호중구)의 선택을 위한 전방 분산 영역(FSC-A) 및 FITC-A:MPO의 밀도 플롯. 긍정적인 인구는 형광 강도의 약 103에 고려됩니다. E. 대조군 대 Cisplatin 동물에서 mpo:GFP 양성 세포(호중구)의 백분율그래프, 24hpi. 페어링되지 않은 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 시스플라틴 주입 물고기의 TUNEL 분석. A. 120 μg/g 시스플라틴 주입 후 24 시간 고정 성인 신장의 마이크로 사진. 컨트롤은 0.9% NaCl로 주입됩니다. TUNEL 양성 세포 (세포 세포)는 빨간색 (백색 화살표)에 염색된다. DAPI(파란색)는 핵 카운터스테인으로 사용된다. 스케일 바: 50 μm. 20배 배율. B. 20배 필드에 의한 신장내죽은 세포의 수의 정량화를 보여주는 그래프. 페어링되지 않은 t-test, * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

트랜스제닉 라인셀 유형 레이블참조
Tg (spi1:EGFP)pA301골수성 세포와드 외 2003 48
Tg (zpu1:GFP)골수성 세포Hsu 외. 200449
Tg (mhc2dab:GFP)sd6단세포위타머 외 201150
Tg (lysC:DsRED2)호중구홀 외 2007 51
Tg (mpo:GFP)호중구마티아스 외. 200652
Tg (mpeg1:mCherry)대식세포엘렛 외 201153
Tg (mpeg1:덴드라2)대식세포하비 외 201354
Tg (lck:GFP)T 셀랑게나우 외 200455
TgBAC (이카로스:EGFP)T 셀바조글리 외 200956
Tg (rag1:GFP)T 셀제센 외 199957
Tg (rag2:GFP)T 셀제시 안 외 200158
Tg (CD79:GFP)B 세포2017년 59 일 리우 외
Tg(CD45:DsRed)백혈구버트 랜드 외 2008 60

표 1: 면역 세포를 위한 Zebrafish 형질 전환선. 표는 제브라피쉬 리포터 라인의 이름을 각각의 유형의 면역세포와 그(것)들이 건설한 참조 기사와 함께 재개합니다. 이러한 제브라피시 라인의 조합은 혈류 세포측정에 의한 세포 선택의 새로운 가능성을 제공할 수 있다.

토론

신장 병의 보급은 사람들의수백만63에영향을 미치는 글로벌 공중 위생 문제가 되고, 전 세계적으로 증가하는 것을 계속하고 있습니다. 신장 부상 개인을 치료 하는 방법을 찾는 것은 가장 중요 한 뿐만 아니라 그들의 병 과 진행에 대 한 더 많은 이해. 몇몇 연구는 신장 손상을 이해하기 위하여 동물 모형을 사용하고 있습니다. 제브라피시신장(그림 1)은자체 재생 능력 과 유전적유사성(29,64)으로인해 발달 생물학 및 상해 연구에서 수년간 연구되고 있다. 여기서, 우리는 신증후군제제로서 시스플라틴의 특성을 사용하여 성인 제브라피시에 새로운 AKI 모델을 제시하며, 24마피로 신속하고 급성 반응을 달성하기 위한 단계를 자세히 설명한다(도2). 더욱이, 여기서 우리는 시스플라틴 주입 후 조직 손상의 평가에 도움이 될 두 가지 기술을 설명, 흐름 세포 측정 및 TUNEL(도 3).

현재 성인 제브라피시의 AKI 모델은 신장및 튜블러 파괴에 광범위한 손상을 유도하는 젠타미신의 i.p. 주입을 포함하며, 신뇌발생 이벤트는 5일부터 시작되며, 재생은 21일 후 사출65일까지완료된다. 한편, 패혈증 관련 급성 신장 손상(S-AKI)의 모델은 Edwardsiella tarda와의감염에 의해 확립되었으며, 인슐린과 같은 성장 인자 결합 단백질-7(IGFBP7), 금속로단백질 2(TIMP-2), 신장 손상 분자 1(KIM-16) 및 신장 손상 분자의조직 억제제와 같은 AKI 마커의 발현이 크게 증가했기 때문에, 제브라피쉬는 치료제를 찾기 위한 고처리량 동물로 알려져 있으며, 여기에는 프로바이오틱스와 미생물유래 대사산물의 사용이 포함되어 신장 기능 및 재생67을연구한다. 그러나, 사용 가능한 모델은 직접 이러한 치료의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 우리는 성인 제브라피시(그림4)에서AKI를 유도하는 다른 방법을 확립하여, 시슬라틴을 생선 미생물에 직접적인 영향을 받지 않는 알려진 신증후군제제로서, 항생제나 E. tarda와의감염에 대한 젠타미신 모델과 마찬가지로 패혈증 모델인 것으로 알려져 있다. 그러나, 우리가 우리의 cisplatin 프로토콜을 개발하는 동시에, 또 다른 그룹은 또한 동물 당 10-20-30 μg로 복용량을 단순화, 성인 얼룩말 피시에 있는 cisplatin의 신혈독성효력을 탐구했습니다 68. 그들은 또한 생존에 cisplatin 복용량 의존 효과 보여 주었지만, 우리는 같은 나이에서 제브라피쉬는 매우 다른 크기와 무게를 가질 수 있기 때문에, 모든 물고기에 대한 cisplatin의 단일 양을 사용하는주의를 권장하고이 결과에 변화를 유도 할 수있다69,70. 우리는 쥐와이 연구에서 수행되는 것처럼 동물의 해당 무게에 복용량을 조정하는 것이 중요하다고 생각합니다.

성인 얼룩말 fish와 우리의 실험에서, cisplatin 복용량 응답 효과 보였다. 이는 시스플라틴 주입 후 동물의 생존율을 모니터링하여 시각화하였다(도5). 우리는 다른 물리적 징후가 모니터링 시간 동안 볼 수 없기 때문에, 신독성의 척도로 하지 cisplatin의 복용량의 강도를 추정하는 방법으로 생존을 사용했다. 이것은 신장 상해의 엄격이 cisplatin 주입의 복용량 및 주파수에 의해 변조될 수 있는 설치류와 비교할 수 있습니다15,cisplatin 의 높은 농도와 치명적인 복용량을 달성71. 죽은 또한 시스플라틴72의애벌레 모델에서 다음 날에 볼 수 있습니다. 우리의 목표는 며칠 만에 급성 부상을 유도하기 위한 것이었기 때문에, 우리는 주입 후 신장 손상을 관찰 할 수있는 것으로 시스플라틴의 120 μg / g 용량을 선택했지만, 이것은 연구의 목적에 따라 조정할 수 있습니다.

인간에서, AKI는 감소된 사구체 여과율(GFR), 높은 혈청 크레아티닌 및 혈액 우레아 질소3에의해 임상적으로 진단된다. Zebrafish에서 AKI 모델의 레퍼토리에는 일부 유전자 조건부모델(73,74) 및 일부 약물 관련모델(65,72)이포함되어 있지만, 일부 AKI 기능성 파라미터는 기술적어려움(예: 혈액 수집)으로 인해 제브라피시에서 측정할 수 없기 때문에, 대부분의 연구는 AKI1,75 등의 특징을 관찰하기 위한 형태학적 및 시각 기술을 채택하고 있습니다.

설치류에서 시스플라틴은 근위 및 단위 튜블러의 상피 세포에 들어가며, 세포 내부는 대사 활성화를 거치고 세포 세포 기관에 매우 반응성이 뛰어나며 세포 구조의 변화를 유도합니다. 이러한 변화는 매우 높은 용량에서 세포사멸과 자가세포, 심지어 괴사를 유도할 수 있습니다. 이러한 손상에 대응하여, 많은 사이토카인이 방출되고 백혈구는 염증으로 이어지고기관(15)의기능에 영향을 미치는 채용된다. 이것은 부상당한 신장에서 찾아볼 수 있는 세포의 어떤 모형의 평가의 중요성을 강조합니다, 주민 또는 침투한 면역 세포로. 여기서 우리는 요즘 사용할 수있는 형질 면역 기자 라인을 사용하여, 흐름 세포측정에 의해 이를 평가하는 방법을 보여 주었다(표 1). 시스플라틴은 주사 후 신장 24h에서호중구(mpo:GFP 양성 세포)의 비율을 증가하였다(도6). 제브라피시의 경우 신장은 다른 혈액 세포 유형을 초래하는 HSC의 틈새 시장입니다. 그럼에도 불구 하 고, 많은 과립 세포와 대식 세포는 일반적으로 혈액에서 순환. 우리의 예에서, 우리는 호중구의 골수페록시다제의 프로모터에서 GFP를 표현하는 mpo:GFP 형질대사를 사용했다52. mpo:GFP 형질대사의 본래 연구는 호중구 성숙의 다른 상태에서 골수구산소증의 발현을입증76 하지만 우리의 게이트 전략은 혈액에서 오는 성숙한 세포를 포함하는 과립세포 분획에 초점을 맞추고52,이러한 방법은 우리의 분석은 침투 세포와 거주 세포가 아닌 포함. 이것은 원하는 세포 인구를 격리할 때 고려하는 것이 중요합니다.

위에서 설명한 바와 같이, 아포토시스는 시스플라틴 관련 AKI의 가장 고전적인 마커입니다. 여기서, 우리는 TUNEL 분석에 의한 죽은 세포의 국소화를 위한 간단한 프로토콜을 시연했습니다. 시스플라틴 주사는 세포 세포 24 마피(도 7)의수를 증가시킵니다. 이것은 조직에서 죽은 세포를 직접 계산하여 쉽게 정량화 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 세포 특이적 사망의 식별을 위해 원하는세포(예를 들어, 관 세포)에 대한 항체의 사용, 또는 형질대사라인의 사용은 이 기술과 함께 사용될 수 있다. AKI의 젠타미신 유도 모델과 비교했을 때, 시스플라틴은 주사후3일째에 젠타미신 아포토시스가 더 높았기 때문에 더 심각한 모델이 될 것으로 보인다.

다양한 부작용에도 불구하고 시스플라틴은 암 치료에 여전히 널리 사용되고 있으며, 암종, 생식세포 종양, 림프종 및 육종77을포함한 다양한 유형의 암에 대한 효과덕분입니다. 신장 독성은 cisplatin10을가진 처리에 있는 환자의 1/3에서 생기고, 따라서 이 효력을 감소시키고 reno보호를 증가할 수 있는 전략에 대한 검색은 필수적입니다. 우리는 이 원고에 제시된 방법과 기술이 신장 상해의 기계장치를 해명하고 신장 합병증때문에 손해를 입는 개별의 삶의 질을 향상하기 위하여 필수적일 수 있는 치료 표적을 찾아는 것을 도울 것이라는 점을 믿습니다, 주로 cisplatin의 사용과 관련되었던 그들.

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상 파울로 - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), 콘셀호 나시오날 데 데센볼비멘토 치엔티피코 e Tecnológico (CNPq) 및 코르데나카소 데 아페르페이소메멘토(파벨리카메토). 우리는 마리아 리타 도스 산토스 e 파소스 부에노의 실험실에서 우리의 협력자에게 감사하고 유전학 및 진화 생물학과의 제브라피시 시설, 상파울루 대학의 생물 과학 연구소에서. 우리는 친절하게 원고에 대한 의견과 제안에 대한 크리스티안 나파 드 수자 브레다와 테레사 라켈 드 올리베이라 라말호 감사합니다. 우리는 이 비디오의 녹음, 판 및 제작에 대해 생물 의학 연구소의 멀티미디어 팀의 마르시오 비야르 마틴스에게 매우 감사하고 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSMade by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringeBD Plastipak990256Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tankTecniplastPart of the aquactic system
6 well plateCorning351146
10 mM Tris/HClPrepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tubeCorning352070
2-3% AgaroseInvitrogen16500-500Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBSGibco12657-09Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500GDissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% EthanolMade by diluting 100% ethanol in distilled water
70% EthanolMade by diluting 100% ethanol in distilled water
90% EthanolMade by diluting 100% ethanol in distilled water
100% EthanolSynth00A1115.01.BJ
100% XyleneSynth00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µmCorning431750
CisplatinBlau Farmacêutica16020227C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheetObtained from local stationary store
DAPISigma-AldrichD9542Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forcepsFine Science Tools11254-20
Flow cytometry tubesCorning352052
Glass slideThermo-Fisher4445
Histology cassetteCiencor2921
Immuno stain chamberCiencorEP-51-05022
IncubatorNAPCO5400Set to 37 °C
Insect pinsPapillonModel micro15x20
In Situ Cell Death Detection KitRoche Diagnostics12156792910
Metal moldLeica Biosystems3803081
Micropipette 200-1000 µLEppendorfUse 1 mL tips
MS-222 (Tricaine)Fluka AnalyticalA5040-25G
NaCl 0.9%SynthC1060.01.AGDissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polishPrefer transparent
Neubauer chamberPrecicolor HGB
Pasteur plastic pipetUnited Scientific SuppliesP31201
ParaplastSigma-AldrichP3558
Petri dishJ.ProLab0307-1/660 and 100 mm
Plastic spoonObtained from local store
Proteinase KNew England BioLabsP8102Diluite from stock 20 mg/ml
ScissorsFine Science Tools14060-09
Scalpel bladeSolidor
SpongeObtained from local store
Trypan BlueCromoline10621/07
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-00
Vectashield Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000-10
CentrifugeEppendorf5810R
CytometerBD BiosciencesFACSCanto II
Fluorescence StereoscopeZeissAxio Zoom.V16
Fluorescence MicroscopeZeissAxioVert.A1
MicrotomeLeicaJung Supercut
ScaleOhaus CorporationAR2140

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