쥐의 개체 위치 작업을 사용하여 피사체 내 실험 설계

요약

이 프로토콜은 동일한 쥐 집단을 사용하여 4개의 반복을 사용하여 개체 위치 작업에 대한 자세한 단계를 제공합니다. 약하고 강한 인코딩은 단기 및 장기 기억을 생성 할 수 있습니다. 반복프로토콜의 유연성은 시간과 노동력을 절약하여 외과 수술과 관련된 연구에 도움이 될 수 있습니다.

초록

오브젝트 장소 인식은 설치류에서 공간 메모리를 조사하는 데 사용되는 탁월한 방법입니다. 이 개체 위치 인식 메모리는 개체 위치 작업의 기초를 형성합니다. 이 백서에서는 동일한 쥐 집단을 사용하여 최대 4회 반복할 수 있는 옵션으로 개체 위치 작업의 수립을 안내하는 광범위한 프로토콜을 제공합니다. 약하고 강력한 인코딩 프로토콜을 사용하여 다양한 강도의 단기 및 장기 공간 기억을 연구하고 관련 메모리 억제 또는 강화 조작의 구현을 가능하게 할 수 있습니다. 또한, 여기에 제시된 카운터밸런싱과 함께 테스트의 반복은 쥐 간의 가변성을 줄이기 위해 피험자 내 비교를 위한 두 개 이상의 시험결과의 조합을 허용한다. 이 방법은 통계적 힘을 높이는 데 도움이 되며 특히 개별 동작에서 높은 변동을 생성하는 실험을 실행할 때 강력히 권장됩니다. 이것은 각 동물에게서 얻은 데이터를 증가하고 필요로 하는 동물의 전반적인 수를 감소시킴으로써 연구를 직접 구체화합니다. 마지막으로, 반복되는 물체 위치 작업의 구현은 시간과 노동력을 절약하여 외과 적 시술을 포함하는 연구의 효율성을 증가시킵니다.

서문

자발적인식작업(예: 개체 인식, 물체 장소 인식)은 설치류에서 메모리를 조사하는 데 큰 활용되고 있다. 이러한 테스트는 공포 컨디셔닝 또는 보상 동기부여를 기반으로 하는 메모리 평가에 사용되는 다양한 테스트와는 달리 자발적인 인식 작업은 새로운 자극을 향한 자발적인 탐색 적 행동에만 기반을 두고 있습니다. '신론적 선호도'^1이라고불리는 이 동작은 설치류뿐만 아니라 다른 포유류 종 및 조류 및 물고기 2와 같은 일부 비 포유류에 내재되어^{있습니다.} 공간 메모리에 의존하는 객체 위치 인식은 객체 위치 작업(공간 객체 인식 작업이라고도 함)을 사용하여 관찰할 수 있다^3. 병변 연구는 개체 장소 인식이 그대로 해마^4,5가필요하다는 것을 보여주었습니다. 비교적 간단한 훈련 프로토콜과 보강이 없기 때문에이 작업은 많은 연구에서 바람직합니다. 양수 및 음수 보강의 부재는 행동을 유도할 수 있는 추가 매개 변수및 뇌 영역을 최소화합니다. 따라서 여기서의 동작은 중립적이며 호기심과 공간 메모리를 기반으로 하여 공간 메모리의 인코딩, 통합 및 검색에 관련된 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

개체 위치 작업에 대한 프로토콜은 일반적으로 몇 분에서 몇 시간마다 다른 지연 기간으로 구분되는 단일 인코딩 및 테스트 시험 세션으로 구성됩니다. 쥐는 동물의 스트레스 수준을 최소화하기 위해 사전에 취급되는 것이 좋습니다, 따라서, 참신에 대한 혐오와 같은 인식 메모리에 영향을 미칠 수있는 행동. 마찬가지로 잘 설계된 습관 프로토콜은 작업 중에 쥐의 자연스러운 행동을 방해할 수 있는 스트레스를 방지하는 데 필수적인 역할을 합니다. 그러나, 처리 및 습관의 정도는 실험실과 실험자 사이에서 크게 다르며, 이는 낮은 복제율^6,7,8에기여할 수 있다. 인코딩 평가판에서 쥐는 지정된 두 모서리에 있는 두 개의 동일한 물체가 있는 경기장을 탐험할 시간이 주어집니다. 기간에 의해 지연되는 시험 시험에서 쥐는 동일한 쌍의 물체로 경기장을 탐험 할 시간이 주어지지만 이번에는 그 중 하나가 새로운 위치로 옮겨졌습니다. 쥐에 의해 전시된 자발적인 선호도와 새로운 위치에서 물체를 탐색하는 데 소요되는 시간이 증가하여 개체 위치^3의공간 인식 및 메모리를 나타낸다. 인코딩 평가판(반복 기간 및 횟수)을 수정하는 것은 메모리의 강도에 영향을 미칩니다.

연구의 목적에 따라, 인코딩과 시험 시험 사이의 지연의 길이는 단백질 합성 독립적 인 단기 기억 또는 단백질 합성 의존장기 기억을 모델링하기 위해 수정 될 수있다. 따라서 필요에 따라 프로토콜을 조정하여 다양한 연구에 개체 위치 작업을 사용할 수 있습니다. 또한, 약리학 및 광유전학 적 개입과 같은 실험 적 조작의 구현은 생체 이미징에서와 마찬가지로 이러한 시험 사이에도 가능합니다. 동일한 쥐 코호트 내에서 개체 위치 작업의 반복반복을 보고하는 여러 연구^9,10이 있습니다. 이것은 한 동물이 반복없이 한 세션이있는 전통적인 사용과 대조됩니다. 그러나 이러한 패러다임의 효과는 철저히 조사되지 않았으며 이를 설명하는 방법 논문도 없습니다. 우리의 지식에, 이것은 또한 체계적으로 각 반복의 결과를 비교하는 동일한 쥐 코호트를 사용하여 최대 4 개의 반복과 개체 위치 작업을 자세히 설명하는 프로토콜의 첫 번째보고 된 설명입니다. 반복은 실험 조건의 균형을 맞추기 위해 테스트 간의 변동성 감소와 피사체 내 비교를 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 작업의 신뢰할 수 있는 반복을 통해 데이터를 풀링할 수 있으므로 상대적으로 적은 수의 쥐를 사용하여 충분히 많은 양의 데이터를 생성할 수 있습니다. 마지막으로, 동일한 쥐를 사용하는 반복은 결과적으로 시간과 인건비를 절약하는 데 필요한 쥐의 수를 줄임으로써 외과 수술 및 이식과 관련된 실험에 도움이 될 수 있습니다.

이 연구는 1h 및 24-h 지연시험 다음에 강하고 약한 인코딩 시험을 사용하여 성인 쥐에서 개체 위치 작업을 수행하는 방법을 자세히 설명하는 광범위한 프로토콜을 제시합니다. 강력한 인코딩 프로토콜은 1-h 및 24-h 지연으로 테스트할 때 통계적으로 유의한 인식 메모리를 생성하므로 이러한 기억을 억제하기 위해 조작의 구현 시 단기 및 장기 기억을 연구하는 데 사용할 수^있다. 반면 약한 인코딩 프로토콜은 1h 지연으로 테스트할 때만 상당한 단기 메모리를 생성합니다. 장기 기억의 부재는 메모리^11,12의보존을 향상시키기위한 조작을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 개체 위치 작업의 복제가능성을 높이는 것을 목표로 하는 자세한 처리 및 습관 세션도 포함됩니다. 이 논문은 또한 약한 인코딩 프로토콜을 사용하여 쥐의 동일한 코호트를 가진 네 개의 별개의 맥락에서 작업의 반복을 보여 주며, 이는 매번 복제및 일관된 결과를 생성하는 것으로 확인됩니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 덴마크 및 EU 동물 복지 법규에 따라 덴마크 국가 당국(라이센스 번호: 2018-15-0201-01405)에 의해 승인되었습니다.

1. 실험적인 설정 및 고유한 컨텍스트 준비

1. 컨텍스트가 있는 오브젝트 위치 아레나
   참고: 아래 설정은 천장의 가장자리를 따라 광원이 있는 밀폐된 방음상자(그림 1B)와상자 천장 중앙에 있는 카메라로 표시됩니다. 경기장은 높이 100cm(그림1B)의벽이 있는 60cm x 60cm의 경기장이 상자 안에 배치되어 주변 방에서 완전히 분리됩니다. 모든 공간 단서는 경기장 안에 있습니다. 이렇게 하면 고유한 컨텍스트를 만드는 프로세스가 간소화됩니다. 벽 주변에 균일 한 커튼이있는 일반 오픈 필드 경기장을 둘러싸고 주변 방에서 비슷한 수준의 격리를 달성 할 수 있습니다.
   1. 폭 60cm, 높이 50cm의 불투명한 비다공성 플라스틱으로 만든 사각형 경기장을 확보하십시오. 자동화 된 소프트웨어 (해당하는 경우)에 의해 쥐의 움직임을 성공적으로 기록하기 위해 쥐의 색상과 대조 바닥에 대한 색상을 선택합니다. 경기장은상자(그림 1B)또는 커튼으로 둘러싸인 플랫폼에 배치합니다.
   2. 컨텍스트를 만들려면, 다른 색상 및 / 또는 패턴 (예를들어, 검은 색, 흰색, 줄무늬, 점)에 삽입 벽(예를 들어, 경기장과 동일한 재료로 만든 벽 덮개, 또는 쉽게 청소 할 수있는 플라스틱 벽)의 두 번째 층을 얻을. 경기장에 벽의 두 번째 레이어를 삽입하여 서로 구별됩니다.
   3. 10cm x 10cm x 5cm, 20cm x 15cm x 15cm(너비 x 길이 x 높이) 사이가 다른 치수(3D) 공간 큐(컨텍스트당 1-2)를 얻고(i) 뚜렷한 기하학적 모양과 (ii) 색상이 벽 색상을 대조한다. 쥐가 이 단서에 도달할 수 없도록 충분히 높은 벽에 걸어 놓습니다.
   4. 다공성, 구치지지 않는, 청소가 쉬운 다양한 개체(컨텍스트 수만큼)를 얻습니다. 각 새 오브젝트에 대해 고유한 기하학적 모양과 텍스처를 사용하는 것을 목표로 합니다. 너비와 높이가 5~15cm 인 객체를 선택합니다(더 높은 개체는 피하십시오). 네 개의 서로 다른 객체(콘, 축구, 직사각형 프리즘 및 삼각형 프리즘)의 예를 보려면 그림 1D를 참조하십시오.
      참고: 각 개체는 쥐와 유사해야 모든 개체의 총 탐색 시간을 비교할 수 있습니다.
   5. 경기장 바닥에 물체를 부착하기위한 최상의 솔루션을 찾으십시오(예 : 끈적 끈적한 매트, 양면 테이프 사용, 물체 아래에 금속 판 부착 및 경기장 아래에 페어링 자석 등).
   6. 다른 컨텍스트를 만들 때 벽을 다시 만들어 이전 컨텍스트에서 벽의 색상과 패턴 분포를 대조합니다. 이전 모든 큐와 는 다른 새로운 3D 공간 큐를 사용합니다. 네 가지 컨텍스트의 예는 그림 1C를 참조하십시오.
   7. 경기장 내에서 확산되고 동일한 조명을 보장하고 조광기 옵션이 있는 광원을 가져옵니다. 각 컨텍스트를 만든 후 경기장 모서리에 약 100-120 럭스로 빛의 강도를 조정합니다. 카메라를 가져와 상자 천장 중앙에 놓습니다.
      참고: 자동 채점 소프트웨어를 사용하지 않을 경우 라이트 강도를 낮은 수준으로 조정할 수 있습니다.
2. 오브젝트 버킷
   1. 버킷(직경 >50cm)을 가져옵니다. 실험 경기장과 유사하지 않도록 사각형 모양을 선택하지 마십시오. 침구 재료로 채웁니다.
   2. 다른 모양과 크기의 5-10 개체를 얻고 (실험에 사용될 개체와 다른) 무작위로 버킷에 모두 배치(그림 1A).

그림 1: 네 개의 서로 다른 컨텍스트와 개체를 포함하여 실험 설정입니다. (A)객체 습관에 대한 객체 버킷입니다. (B)실험 장치(왼쪽), 물체 위치 경기장, 카메라 및 광원을 둘러싸는 다. 컨텍스트 설정(가운데) 및 컨텍스트 설정이 있는 아레나(오른쪽) 전에 실험 상자와 아레나입니다. (C)뚜렷한 벽색과 패턴, 3차원 공간 큐를 가진 4가지 컨텍스트(1-4). (D)각각 1-4 컨텍스트에서 사용되는 네 개의 객체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 카메라 및 추적 소프트웨어(선택 사항)
   1. 카메라 레코더를 원격으로 제어하는 데 사용할 수 있고 쥐 코를 추적할 수 있는 소프트웨어를 가져옵니다. 각 실험 전에 각 특정 컨텍스트 및 쥐 변형에 대한 소프트웨어를 조정합니다.
4. 개체 위치 및 실험 그룹의 균형 조정
   1. 인코딩 및 테스트 시험을 위해 가능한 개체 위치 조합을 준비하고 이를 카운터로 지정합니다. 모든 모서리를 개체 위치로 커버하고 대각선 모서리에 인접한 오브젝트 이동및 그 반대의 경우도 마찬가지(그림 2A)와같은 조합을 만듭니다.
   2. 특정 실험에 대한 일정을 준비하여 한 실험 그룹의 각 쥐를 카운터와 일치시다. 쥐가 충분한 경우, 한 그룹 내에서 두 쌍의카운터(그림 2A)의각 쌍을 사용합니다. 단일 인코딩/테스트세션(그림 2B)에서두 실험 그룹에 대해 동일한 카운터 집합을 사용합니다. 다음세션(즉, 각 새 컨텍스트)에 대한 카운터를 다시 할당합니다.
      참고: 인코딩/테스트 세션 동안 쥐를 혼합 순서로실행합니다(예:한 케이지에 있는 모든 쥐를 차례로 실행하지 마십시오. 대신 케이지를 회전시켜 하나 이상의 쥐의 케이지 내에서 차분한 환경을 보장합니다).
   3. 두 개 이상의 컨텍스트를 사용하여 실험군(예를 들어, 1-h 메모리 대 24h 메모리 그룹)의 균형을 맞추는 경우, 각 그룹에 쥐를 할당하고 다음 컨텍스트에서 그룹을 변경한다(도2B).

그림 2: 대표적인 역균형 방법. (A)인코딩 및 시험 시험에서 투기장에서 객체의 가능한 방향이 카운터로 명명된다. 개체 1은 항상 움직이는 개체입니다. 두 개의 카운터마다 서로 균형을 이루어 움직이는 오브젝트의 위치가 변경됩니다. 각 모서리는 두 번 점유되고 오브젝트 1은 대각선에서 인접으로 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. (B)두 개의 불균형 세션에 대한 인코딩/테스트 일정의예(예: 컨텍스트 1 및 2). 쥐는 컨텍스트 1의 실험 조건에 할당됩니다(세션 X, 왼쪽). 카운터 쌍세트(즉, 1-2, 3-4, 5-6 및 7-8)를 하나의 실험 군에서 각 쥐에 선택및 할당한다. 카운터의 동일한 세트는 두 실험 그룹에서 쥐에 할당됩니다. 컨텍스트 2(세션 X+1; 오른쪽)의 다음 세션에서 실험 그룹의 쥐는 카운터 밸런싱을 위해 변경되고 새로운 카운터 쌍 집합이 할당됩니다. 인코딩 및 테스트 시험의 시작 시 시간을 주목해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고: 이 프로토콜의 모든 처리, 습관 및 인코딩/테스트 세션은 12h 광/어두운 주기의 광단계에서 최적화되어 광상 동안 실험을 수행하는 것이 좋습니다.

2. 취급 및 습관

1. 쥐가 원조 (쥐가 홈 시설에서 사육되는 경우) 또는 실험 시작 2-3 주 (쥐가 외부 시설에서 주문되는 경우, 도착 후 1 주일 동안 적응 할 수 있도록 한 후)에서 시작 쥐를 처리하기 시작합니다.
2. 쥐가 편안하게 만지고 실험자가 집어 들 때까지 일주일에 2 또는 3 일 동안 4 마리의 쥐의 각 케이지에 적어도 10-15 분 지출하십시오. 케이지의 쥐 수에 따라 케이지당 할당된 시간을 조정합니다.
   참고: 쥐와 함께 일하기를 기대하는 모든 실험자가 취급 중에 존재하는 것이 중요합니다.
3. 처리가 원고에서 시작되는 경우 이 수준에 도달하면 취급을 최소(선택 사항)로 줄입니다. 실험 2-3주 전에 시작하면 습관 세션이 시작될 때까지 계속 처리하십시오.
4. 쥐를 실험실로 가져와 쥐를 실험실로 데려와 실험실에 쥐를 습관화시한다. 쥐가 적어도 30 분 동안 앉아서 진정하고 습관화 할 수있는 시간을 줄 수 있도록하십시오. 이 시간 후, 하우징 룸에 쥐 / 케이지를 반환합니다.
   참고: 2.4단계는 처리와 결합하여 필요에 따라 여러 번 반복할 수 있습니다. 프로토콜에 추가조작(예: 주사 절차 처리 등에 대한 처리)을 포함하는 경우 이 단계에서 추가 적인 습관이 구현될 수 있다.
5. 개체 습관화를 수행하여 쥐를 습관화하여 개체와 상호 작용하고 새로운 환경의 경험에서 비롯된 일반적인 스트레스 수준을 줄입니다.
   1. 세션 1의 경우 모든 홈 케이지를 실험실로 가져와 쥐가 방에 습관화하여 최소 30 분 동안 정착하게하십시오. 같은 케이지에서 20분 동안 쥐(2-4마리 쥐)를 양동이에 함께 넣습니다. 쥐의 각 그룹 사이의 배설물을 제거하여 양동이를 청소. 모든 케이지에 대한 절차를 반복합니다. 모든 쥐를 집 새장에 넣고 하우징 룸으로 돌아갑니다.
   2. 세션 2의 경우, 별도의 날에 모든 케이지를 실험실로 가져와 최소 30분 동안 둡니다. 각 쥐를 양동이에 개별적으로 넣고 10분 동안 넣습니다. 쥐를 다시 집 케이지에 넣고 각 쥐 후 양동이를 청소합니다. 모든 케이지를 하우징 룸으로 되돌려 놓습니다.
   3. 세션 3의 경우 별도의 날에 2.5.2 단계를 반복합니다.
6. 실험장치가 밀폐된상자(도 1B)인경우, 새로운 실험 기구에 쥐를 습관화하기 위해 빈 상자 습관을 수행하기로 한다. 세션 4에서는 모든 케이지를 실험실로 가져와 30분 이상 둡니다. 같은 케이지에서 쥐를 함께 배치 (2-4 쥐) 컨텍스트 또는 공간 큐없이 빈 경기장에(그림 1B,중간) 20 분. 모든 쥐를 다시 홈 케이지에 넣고 각 쥐 그룹 후에 70 %의 에탄올로 경기장을 닦으부습니다.
   참고: 단계 2.5 및 2.6은 컨텍스트 습관 주간 이전인 한 주에 수행해야 합니다(2.7단계, 그림 3참조). 이 단계 동안 며칠 동안 휴식을 취할 수 있습니다. 그러나 2.7단계를 시작한 후 각 단계는 시험이 끝날 때까지 지정된 대로 연속해서 수행되어야 합니다(단계 2.9).
7. 일반적인 스트레스 수준을 줄이고 환경의 공간 학습을 지원하기 위해, 컨텍스트 및 3D 큐에 쥐를 습관화컨텍스트 습관을 수행합니다.
   1. 빈 경기장을 수정하여 섹션 1.1에 설명된 대로 첫 번째 컨텍스트를 만들지만 오브젝트를 경기장에 넣지 는 않습니다. 녹음 장비를 준비합니다.
   2. 세션 1의 경우 모든 케이지를 실험실로 가져와 최소 30분 동안 둡니다. 수동으로 이 작업을 수행하면 레코더를 시작합니다. 첫 번째 쥐를 경기장 중앙에 놓고 쥐가 경기장을 10 분 동안 탐험 할 수 있습니다. 그런 다음 레코더를 중지 (수동 경우), 다시 홈 케이지에 쥐를 배치합니다. 각 쥐 후 70 %의 에탄올로 경기장을 철저히 닦고 모든 케이지를 하우징 룸으로 반환합니다.
   3. 세션 2 및 3의 경우, 2일 연속 각 쥐에 대해 2.7.2를 반복하여 쥐당 3회의 문맥 습관이 총편이 있다.
      참고: 특히 큰 그룹을 다룰 때 쥐가 경기장에 들어가는 순서를 섞는 것이 좋습니다. 이것은 하루의 동시에 반복적으로 특정 쥐를 실행 방지.

그림 3: 처리, 습관 및 개체 위치 작업 프로토콜을 포함한 행동 실험의 설계입니다. 쥐는 습관주의 주 전에 몇 주부터 정기적으로 처리해야합니다. 0주차에는 개체 및 실험 상자 습관이 4회 이상 수행되며 그 사이에 최소 24시간 간격이 수행됩니다. 1주차에는 24시간 간격으로 3회 연속 세션이 진행되고 인코딩 및 테스트 시험이 진행됩니다. 다음 세션을 진행하기 전에 최소 48h 및 최대 1주일 간격이 있어야합니다(예: 2주 또는 3주차에 다음 컨텍스트에 대한 습관시작). 약어: Hab., 습관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 인코딩 평가판(세션 4)
   참고: 약리학 조작의 경우, 약리학제의 특성에 따라 인코딩 시험 전후 또는 시험 시험 전후에 에이전트를 투여하는 적절한 시간이 될 수 있습니다.
   1. 모든 케이지를 실험실로 가져와 서 적어도 30 분 동안 둡니다. 사전에 준비된스케줄(도 2B)을사용하여, 끈적끈적한 매트 나 양면 테이프를 사용하여 지정된 위치에 첫 번째 동일한 쌍의 물체를 배치 (2 모서리와 각 벽에서 >10cm의 거리; L 자형 판지 조각을 사용할 수 있습니다).
   2. 레코더를 시작합니다(수동인 경우). 첫 번째 쥐를 벽에 마주보고 있거나 물체가 점유하지 않는 모서리를 향합니다(각 오브젝트와 동일한 거리).
      참고: 약한 또는 강한 인코딩을 보려면 아래 단계를 따르십시오.
   3. 약한 인코딩 (1 재판)의 경우쥐가 경기장과 물체를 20 분 동안 탐색 할 수 있습니다. 그런 다음 레코더(수동 인 경우)를 중지하고 쥐를 다시 홈 케이지에 배치합니다. 물체를 제거하고 70%의 에탄올로 오브젝트와 경기장을 모두 완전히 닦습니다.
   4. 각 쥐가 20분의 1인코딩 시험을 받을 수 있도록 모든 쥐에 대해 2.8.3단계를 반복하십시오.
   5. 강력한 인코딩(3회 시험)의 경우쥐가 경기장과 물체를 5분 동안 탐험할 수 있도록 합니다. 그런 다음 레코더(수동 인 경우)를 중지하고 쥐를 다시 홈 케이지에 배치합니다. 개체를 제거하지 마십시오. 70%의 에탄올로 경기장과 물체를 닦아냅니다.
   6. 반복 단계 2.8.5 총 3 시험이 있도록 같은 쥐와 두 번 더. 시간이 다 되면 쥐를 다시 홈 케이지에 넣습니다. 물체를 제거하여 철저한 세척을 위해 물체와 경기장을 70% 에탄올로 닦아냅니다.
      참고: 쥐에 대한 시험 간 간격은 약 1-2 분이어야합니다.
   7. 각 쥐에 대해 2.8.5-2.8.6 단계를 반복합니다.
   8. 지연 시간이 24h보다 짧은 경우 시험 시험이 될 때까지 케이지를 실험실에 보관하십시오. 그렇지 않은 경우 모든 케이지를 완료하면 하우징 룸으로 반환합니다.
9. 시험 시험 (세션 4)
   참고: 지연 기간은 인코딩 평가판 시작부터 계산되어야 합니다.
   1. 24-h 지연(또는 다음 날 시험 시험을 요구하는 지연)의 경우, 모든 케이지를 실험실에 가져와 쥐를 최소 30분 동안 방치할 수 있도록 첫 번째 검사보다 충분한 시간을 남겨 둡다. 일정에 따라 지정된 위치에 개체를 배치합니다(새 위치에 있는 개체 중 하나).
   2. 시간이 되면 레코더(수동인 경우)를 시작합니다. 첫 번째 쥐를 벽에 마주보고 있거나 물체가 점유하지 않는 모서리를 향합니다(각 오브젝트와 동일한 거리).
   3. 쥐가 경기장과 물체를 5분 동안 탐험하도록 허용합니다. 그런 다음 레코더를 중지합니다(수동인 경우). 쥐를 다시 홈 케이지에 넣습니다. 물체를 제거하고 70%의 에탄올로 오브젝트와 경기장을 모두 완전히 닦습니다.
   4. 각 쥐에 대해 2.9.2-2.9.3 단계를 반복합니다. 모든 케이지를 다시 하우징 룸으로 되돌려 놓습니다.
      참고: 다음 각 인코딩/테스트 세션에서 최소 48h 및 최대 1주일 간격으로 2.7단계(컨텍스트 습관)에서 습관 프로토콜을 시작합니다.

3. 데이터 분석

1. 각 쥐에 대해 이 목적을 위해 설계된 소프트웨어를 사용하거나 수동 설정을 사용하여 인코딩 및 테스트 평가판 모두에서 각 개체에 대한 탐색 시간을 점수매기합니다. 전체 기간 동안 인코딩 평가판을 점수매기기. 최고의 차별 성능^3에대한 2 분 에 대한 점수 테스트 시험. 자동화된 온라인 소프트웨어 점수를 사용하는 경우 소프트웨어에서 점수 매기기 데이터를 내보냅니다.
2. 쥐가 물체와 접촉하거나 물체를 스니핑하거나 2cm 미만의 거리에서 물체를 마주보고 있을 때 탐색 시간을 계산합니다. 쥐의 주의가 물체 이외의 다른 곳에 나타나지 않는 한 등반과 물체에 앉아 있는 것을포함합니다(예: 물체에서 멀리 보이는 것).
3. 각 쥐에 대해 두 개체에 대한 총 탐색 시간을 계산합니다. 신뢰할 수 없는 탐색을 반영할 수 있으므로 이 시험시험(2분 득점)에서 총 탐사 시간이 10초 미만인 쥐를 제외하는 것이 좋습니다.
4. 각 개체(방정식 1) 또는 각 래트(수학식 2)에 대한 차별 지수(DI)에 대한 탐색 비율을 계산하고 그룹에 대한 평균 값을 계산합니다.
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   참고: % 탐색이 50% 또는 DI가 0인 경우 성능이 확률 수준에 있고 쥐가 두 개체에 대한 선호도가 없음을 의미합니다. 인코딩 시험 중 평균 백분율 탐색 및 DI는 각각 ~50% 또는 0이어야 합니다. 인코딩 평가판에서 두 개체에 대해 [평균 ±(2× SD)보다 높은 선호도를 보이는 모든 쥐는 각 시험의 분석에서 제외되어야 한다. 이를 통해 테스트 평가판에서 환경 설정을 안정적인 개체 위치의 메모리로 안정적으로 해석할 수 있습니다. 이 값은 개별 테스트 또는 여러 테스트에서 데이터를 결합한 데이터를 계산할 수 있습니다.
5. 실험 설정에 가장 적합한 방법으로 데이터를 분석합니다. 기회 수준 이상의 중요한 기본 설정을 감지하기 위해 원 샘플 t-테스트를사용합니다.
6. 두 개 이상의 컨텍스트를 카운터밸런싱과 사용하는 동안 컨텍스트 간에 동일한 실험 조건의 결과를 결합합니다.
   참고: 동일한 쥐로 구성된 그룹이 생성되어 두 그룹에 대해 쌍t-테스트를사용하여 주제 내 비교를 가능하게 하고 두 개 이상의 그룹에 대한 분산(ANOVA)의 반복적인 측정 해석을 사용합니다.

결과

여기에 는 남성 티로신 하이드록실라제(Th)-Cre 트랜스제닉^{랫트(13)를} 사용하여 리스터 후드 균주와 야생형 리스터 후드 쥐에 4번 을 교차하는 것으로 기술된 강력하고 약한 인코딩 프로토콜모두에 대한 대표적인 결과가 나와 있다. Th-Cre 형질전환 쥐는 이 쥐 라인이 광유전학을 관련시키는 미래 연구 결과에서 사용될 것이기 때문에 이용되었습니다. 각 프로토콜을 사용하여 메모리는 1 시간 및 24 h의 지연으로 테스트되었습니다. 1 h에서 테스트 단기 메모리를 보여 주며 24-h 테스트는 장기 기억을 보여줍니다. 인코딩 기본설정에 대한 제외값은 프로토콜에 설명된 바와 같이 5개의 테스트(강력하고 약한 인코딩 프로토콜)의 결합된 데이터를 [50.8% ±(2×10.8%)로 계산하였다. 이러한 값 의 위와 아래에 인코딩 선호도가 있는 쥐는 각 테스트의 분석에서 제외되었습니다.

강력한 인코딩 실험을 위해 16마리의 쥐가 사용되었고 약한 인코딩 실험을 위해 19마리의 쥐가 사용되었습니다. 강한 인코딩 시험 동안 (3 × 5 분 인코딩; 도 4A),어느 개체(52.0 ± 1.9%, n = 16, t₁₅ = 1.1, p = 0.29; 원샘플 t-테스트대 확률 수준)에 대한 중요한 선호도가 없었다. 이 강력한 인코딩 프로토콜은 1-h 및 24-h 지연(1-h 메모리, 77.9 ± 2.4%, n = 8, t₇ = 11.8, p < 0.001; 24-h 메모리, 24-h 메모리 모두 테스트에서 기회 수준(50%)보다 훨씬 높은 평균 백분율 탐색 측면에서 볼 때 와 같이 새로운 위치에서 개체에 대한 선호도를 주도했습니다. 65.2 ± 5.3%, n = 8, t₇ = 2.8, p = 0.025; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준). 1-h와 24h 메모리 사이에는 큰 차이가 없었습니다(p = 0.056; 페어링되지 않은 Welch의 t-test).

약한 인코딩 시험 중(20분 인코딩; 결과 4개의 컨텍스트에서 풀로 드린 경우; 도 4B),어느 개체(51.1 ± 1.0%, n = 66, t₆₅ = 1.2, p = 0.24; 원샘플 t-테스트대 확률 수준)에 대한 선호도가 크게 나타났습니다. 이 약한 인코딩 프로토콜은 1-h 지연을 가진 시험에서 기회 수준에 비해 새로운 위치에서 개체에 대한 선호도가 크게 증가했지만 24-h 지연(네 가지 컨텍스트에서 결합된 데이터; 1-h 메모리, 66.7 ± 2.0%, n = 32, t₃₁ = 8.2, p < 0.001; 24-h 메모리, 24-h 메모리, 24-h 메모리 49.6 ± 2.6%, n = 34, t₃₃ = 0.16, p = 0.87; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준). 1-h 및 24-h 지연(1h 메모리: n = 32, 24h 메모리: n = 34, t_61.5 = 5.2, p < 0.001; 페어링되지 않은 Welch의 t-test)를 가진 테스트의 성능 사이에 는 상당한 차이가 있었습니다.

그룹 레벨의 메모리는 24-h 지연 테스트에서 기회 수준 성능에 의해 인덱싱된 것으로 관찰되지 않았지만 개별적인 변형을 보였다. 노 메모리 조건에 약한 이러한 높은 변이(예를 들어,24-h 테스트)는 일반적으로 개체의 더 무작위 탐사로 인해 관찰되었다. 따라서 쥐의 성능을 개별적으로 해석하지 않는 것이 중요합니다. 대신 개별 데이터 포인트의 분포를 테스트의 신뢰할 수 있는 결과로 그룹 평균과 함께 사용할 수 있습니다. 인코딩이 강할수록 쥐의 동작이 균일해지고, 강력한 인코딩 프로토콜에 대해 도 4A에서 관찰될 수 있는 통계적 유의에 도달하는 데 필요한 쥐의 수가 줄어듭니다. 대조적으로, 약한 조건에 대한 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 더 큰 그룹이 필요합니다(그림 4B).

그림 4: 강력하고 약한 인코딩 후 메모리 성능. (A)강한 인코딩 시험 (3 × 5 분 인코딩) 1-h 또는 24 h 테스트 시험 다음에. 인코딩 시험(n = 16)동안 두 개체에 대한 중요한 선호는 없었습니다. 강력한 인코딩은 확률 수준(1-h 및 24-h 메모리: 각 그룹에서 n = 8)에 비해 1h 및 24-h 지연으로 테스트에서 새겨진 위치에서 개체에 대한 선호도가 크게 증가했습니다. 그룹 간에 는 큰 차이가 없었습니다. (B)약한 인코딩 시험(20분 인코딩)이 1h 또는 24h 시험 시험다음에 그 뒤를 따랐다. 인코딩 시험(n = 66)을 코딩하는 동안 두 개체에 대해 크게 선호하지 않았습니다. 약한 인코딩은 1-h로 시험에서 새겨진 위치에서 개체에 대한 선호도가 크게 증가했지만 기회 수준(1-h 메모리: n = 32; 24h 메모리: n = 34h 메모리: n = 34)에 비해 24-h 지연이 발생했습니다. 1-h와 24-h 지연을 가진 테스트의 성능 사이에는 상당한 차이가 있었습니다. 결과는 네 가지 컨텍스트에서 풀로 나아졌습니다. 개별 데이터 포인트는 점으로 표시됩니다. 모든 막대는 SEM± 0.05, *< p < 0.001로 새겨진 위치에서 개체탐색 비율을 표시합니다. 원 샘플 t-테스트대 확률 수준(50%, 대시 선). ^###p < 0.001; ns, 중요하지; 페어링되지 않은 웰치의 t-test. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이러한 확립된 프로토콜의 유의한 장점은 쥐의 동일한 코호트를 가진 4개의 별개의 문맥(도1C)을사용하여 4회 수행될 수 있다는 것이다. 그림 5에 표시된 결과는 두 개의 실험 그룹(1-h 및 24h 메모리 그룹)과 균형을 맞추는 한 가지 가능한 방법을 보여 줍니다. 두 그룹은 두 컨텍스트(컨텍스트 1 및 2)에 비해 균형을 이루었으며, 이는 두 가지 추가 컨텍스트(컨텍스트 3 및 4)에서 반복되었습니다. 그림 5A). 4개의 컨텍스트에서 결과는 각 컨텍스트에서 기회 수준과 선호도를 비교하여 각 실험 그룹에 대한 메모리를 평가한 도 5B, D(그림 5B,D)에서개별적으로 제시되며(1-h 메모리: 컨텍스트 1, 69.9 ± 3.6%, n = 9, t₈ = 5.5, p < 0.001; 컨텍스트 2, 65.6 ± 3.9%, n = 9, t₈ = 4.0, p = 0.004; 컨텍스트 3, 65.2 ± 3.8%, n = 7, t₆ = 4.0, p = 0.007; 컨텍스트 4, 65.3 ± 5.6%, n = 7, t₆ = 2.7, p = 0.035; 24-h 메모리: 컨텍스트 1, 45.1 ± 6.4%, n = 9, t₈ = 0.77, p = 0.46; 컨텍스트 2, 49.1 ± 4.9%, n = 9, t₈ = 0.18, p = 0.86; 컨텍스트 3, 57.2 ± 4.1%, n = 8, t₇ = 1.7, p = 0.12; 컨텍스트 4, 47.6 ± 4.7%, n = 8, t₇ = 0.52, p = 0.62; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준).

컨텍스트 1, 2 및 4에서, 그룹의 주제 간 비교는 1h와 24h 메모리(1h 메모리 대 24-h 메모리: 컨텍스트 1, t_12.7 = 3.4, p = 0.005; 컨텍스트 2, t_15.2 = 2.6, p = 0.019; 컨텍스트 3, t_13.0 = 1.4, p = 0.17; 컨텍스트 4, t_12.2 = 2.4, p = 0.032; 페어링되지 않은 웰치의 t-test). 데이터의 더 나은 표현 및 주제 내 비교를 위해 두 개의 불균형 컨텍스트에서 나온 결과가 결합되었습니다(그림5C,E). 결합된 실험군은 개별적으로 확률 수준과 비교하였다(컨텍스트 1 및 2 결합: 1-h 메모리, 67.8 ± 2.6%, n = 18, t₁₇ = 6.7, p < 0.001; 24h 메모리, 47.1 ± 3.9%, n = 18, t₁₇ = 0.74, p=0.4; 컨텍스트 3 및 4 결합: 1-h 메모리, 65.3 ± 3.3%, n = 14, t₁₃ = 4.7, p < 0.001; 24-h 메모리, 52.4 ± 3.2%, n = 16, t₁₅ = 0.73, p = 0.48; 원 샘플 t-테스트 대 기회 수준). 이어서, 실험군은 서로 비교하였다.

두 컨텍스트 쌍에서, 주제 내 비교에 의해 밝혀진 그룹 들 사이에 상당한 차이가 있었다 (1-h 메모리 대 24-h 메모리: 컨텍스트 1 및 2 결합, t₁₆ = 3.5, p = 0.003; 컨텍스트 3 및 4 결합, t₁₃ = 2.4, p = 0.032; 쌍 t-테스트). 두 개의 상반된 세션에 대해 컨텍스트 1 과 4를 사용하여 약한 인코딩 프로토콜에서도 와일드 타입 리스터 후드 쥐를 사용하여 비교 가능한 결과를 얻을 수 있었습니다(데이터가 표시되지 않음). 결과의 복제력과 신뢰성은 단방향 ANOVA를 사용하여 각 데이터 집합을 비교하여 검증되었습니다. 네 가지 컨텍스트(1h 메모리: F_3,28 = 0.31, p = 0.81; 24-h 메모리: F_3,30 = 0.99, p = 0.41)에서 유의한 차이가 발견되지 않았다. 따라서 이 프로토콜의 지침을 따르는 경우 개체 위치 테스트를 반복의 최소 영향없이 안정적으로 반복할 수 있습니다.

그림 5: 두 개의 실험 단이 두 세션에 걸쳐 균형을 이루는 약한 인코딩 프로토콜의 결과를 제시하고 분석하는 다양한 방법. (A)두 개의 실험 그룹(1-h 및 24h 메모리 그룹)과 균형을 맞추기 위한 실험 설계(컨텍스트 1 및 2). 카운터 밸런싱은 두 개의 추가 세션(컨텍스트 3 및 4)에서 반복되었습니다. (B와 D) 각 컨텍스트와 실험 그룹의 결과는 개별적으로 기회 수준과 서로 비교되었습니다. 네 가지 컨텍스트에서, 1-h 지연을 가진 시험에서 새신 위치에서 객체에 대한 선호도가 확률 수준 [Context 1및 2: n = 9 그룹당(B);에 비해 크게 증가하였다. 컨텍스트 3 및 4: n = 그룹당 7(D)]. 24-h 지연 테스트에서 새포지티드 위치에 있는 개체에 대한 기본 설정은 우연과 다르지 않았습니다(컨텍스트 1 및 2: n = 그룹당 9; 컨텍스트 3 및 4: 그룹당 n = 8). 컨텍스트 1, 2 및 4에서 실험 그룹의 선호도 사이에는 상당한 차이가 있었지만, 주제 간 비교에 의해 밝혀진 바와 같이 컨텍스트 3은 아니었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; 원 샘플 t-테스트대 확률 수준(50%, 대시 선). ^#p < 0.05; ^##p < 0.01; ns, 중요하지; 페어링되지 않은 웰치의 t-test. (C와 E) 결과는 두 개의 불균형 컨텍스트에서 실험 그룹을 결합한 후 제시된다[컨텍스트 1 및 2 결합, n = 그룹당 17(C); 컨텍스트 3 및 4 결합, n = 그룹당 14(E)]. 새별 위치에서 개체에 대한 선호도는 두 컨텍스트 쌍모두에서 1h를 가진 테스트에서 기회 수준에 비해 크게 증가했지만 24-h 지연은 아닙니다. 실험 그룹의 주제 내 비교는 두 컨텍스트 쌍에서 1h 및 24h 지연을 가진 시험에서 새의 위치에서 객체에 대한 선호도 사이에 상당한 차이점을 드러냈습니다. p < 0.001; 원 샘플 t-테스트대 확률 수준(50%, 대시 선). ^#p < 0.05, ^##p < 0.01; 쌍 t-테스트. 개별 데이터 포인트는 점으로 표시됩니다. 모든 막대는 새그림의 탐색 비율을 sEM± 의미로 표시합니다.

토론

개체 위치 작업은 앞에서 설명한 대로 공간 메모리를 조사하기 위해 다양한 연구에서 사용할 수 있습니다. 설치의 유연성은 서로 다른 강점의 단기 및 장기 메모리를 모델링할 수 있게 해주며, 저렴한 비용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 그러나 프로토콜에 영향을 줄 수 있는 매개 변수가 많고, 이러한 매개 변수^6에서다른 연구가 약간 다르기 때문에 처음으로 작업을 성공적으로 구현하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 위의 프로토콜은 이 프로세스를 통해 독자를 원활하게 안내하기 위한 것입니다. 복제성이 높은 작업의 성공적인 구현에 중요한 단계는 아래에서 논의될 것입니다.

인코딩/테스트 세션은 종종 개체 위치 실험을 실행할 때 초점이지만, 처리 및 습관 프로토콜은 결과가 방해받지 않는 자연 쥐^{동작(14,15)에}의존하는 이러한 종류의 행동 테스트 결과에 지대한 영향을 미친다. 따라서 인코딩/테스트 세션 앞의 단계는 쥐 동작및 메모리에 영향을 미치고 결과적으로 최종 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 주의해서 설계되어야 합니다. 쥐가 실험자에 익숙해지고 작업과 같은 취급 및 습관의 좋은 수준은 자연 행동을 전시할 가능성을 증가시키는 동시에 스트레스 요인의 효과를 최소화할 것이다^8. 프로토콜에 언급 된 바와 같이, 쥐 균주가 홈 시설에서 유지되는 경우 처리는 새끼의 짜기로 일찍 시작할 수 있습니다. 이전 경험 (표시 되지 않은 데이터)와 여러 이전 연구의 그에서^16,17,이 조기 처리 결과 낮은 불안과 다음 달에 호기심향상.

개체 위치 작업은 쥐의 본질적인 탐사 드라이브에전적으로 의존하기 때문에 쥐가 탐구하거나 '신포빅^{행동'1이라고}불리는 참신함에 접근하는 것을 꺼려하지 않으면 예상되는 행동이 쉽게 방해될 수 있습니다. 따라서 연구의 특정 요구에 따라 철저한 취급 및 습관 프로토콜을 포함하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 최소 요구 사항 가이드로 사용될 수 있으며, 추가 단계를 구현할 수있다(예를 들어,연구가 추후 주사를 포함하는 경우, 주사 절차 및 특정 보유 위치에 대한 습관이 요구되는 경우). 균주와 실험 쥐의 나이는 두 가지 다른 영향력있는 요소이며 최적이 아닌 결과를 피하기 위해 실험을 계획하기 전에 고려해야합니다. 상이한 쥐 균주는 다른 행동 및 기준선 불안 수준을 가질 수 있습니다^18,19,20 따라서, 프로토콜에 대한 특정 조정은 사용되는 변형에 따라 필요할 수 있습니다.

이 프로토콜은 리스터 후드 변형과 야생 형 리스터 후드 쥐에 네 번 교차 긴 에반스 변형과 Th-Cre 형 형 트랜스 제닉 쥐와 잘 작동 하도록 확인. 행동 실험에 있는 쥐를 위한 논리적으로 이상적인 시작 나이는 약 12 주^20입니다,그러나 긴장 간 가변성 및 작업의 특정 요구 사항을 고려해야 합니다. 그것은 또한 연구에 대 한 관심 있는 경우 개발 쥐를 사용할 수 있습니다., 비록 프로토콜에 조정 이 필요할 수 있습니다 하 고 여기에 적용 되지 않습니다. 그러나, 주어진 된 나이에 쥐성공적으로이 작업을 수행 하는 데 필요한 인지 기능을 개발 하는 여부를 고려 하는 것이 중요 하다. 이 것을 조사하는 연구^21는 출생 후 38일및 이전이 아닌 사춘기 쥐만, 성인 쥐에서 관찰된 바와 같이, 새로운 위치에서 객체에 대한 선호도에 반영된 동종 중심의 공간 기억을 보여주었다는 것을 보고했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 첫번째 인코딩/시험 세션의 시작부분에서 15-16 주 오래된 쥐를 사용하여 성공했습니다. 이전에는 동일한 강력한 인코딩 프로토콜이 23주 된 쥐를 사용할 때 적절한 수준의 습관수준에 도달하지 못해 충분한 나이에 의식하지 못하는 부정적인 결과를 낳았습니다. 이 쥐는 기회 수준과 다르게 수행하지 못했거나 실제로, 변위 된 개체 대신 안정적인 개체에 대한 선호도 측면에서 관찰 된 참신에 대한 혐오를 나타냈다 (데이터가 표시되지 않음). 이러한 결과는 처리 습관의 나이와 타이밍이 습관의 효과에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공하고 그 결과, 시험에서 불안과 신포성 행동의 관찰에 기여한다.

여기서는 개체 위치 작업에 강력하거나 약한 인코딩을 보장하는 두 개의 서로 다른 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 수립하는 동안, 단일 긴시험(예: 20분 인코딩) 동안 탐사 5-10분 후에 개체에 대한 관심이 감소하는 것으로 관찰되었고, 쥐는 결국 탐험을 중단했다. 이렇게 하면 개체 위치의 메모리가 약해집니다. 짧은 휴식기간(예: 3 x 5분 인코딩)으로 인코딩 시험을 인터로프트하는 인코딩 프로토콜은 이를 극복하고 시험 전반에 걸쳐 높은 탐색으로 이어집니다. 따라서 이러한 두 인코딩 프로토콜의 활성 탐색 시간 및 상이한 레이아웃은 메모리의 강도에 영향을 미치며, 이는 20분 인코딩 프로토콜 이후보다 3 x 5분 인코딩 후 더 강해진다. 유사한 결과는 또한 단일 예심 대 인터리브 된 예심 프로토콜을 가진 약간 다른 기간을 사용하여 달성될 수 있고, 조정은 연구 결과 및 쥐 긴장의 필요에 맞게 할 수 있습니다.

방에 외부 단서만있는 일반 흰색 열린 필드를 사용하는 프로토콜과는 달리, 여기에 제시 된 프로토콜은 서로 다른 컨텍스트와 학습 시간이 더 필요한 장미 신호가있는 경기장을 사용합니다. 따라서 인코딩 평가판 전에 프로토콜에 컨텍스트 습관 단계를 추가하는 것이 좋습니다. 이를 통해 쥐는 습관화 중에 각 컨텍스트의 공간 맵을 형성하고 다음 인코딩 시험의 지속 시간을 줄일 수 있습니다. 또한 컨텍스트 습관은 쥐가 3D 공간 큐와 같은 각 컨텍스트 내에서 가능한 산만에 습관화하여 인코딩/테스트 세션에서 개체 탐색 이외의 동작을 최소화할 수 있도록 합니다. 여러레벨(즉, 다양한 물체 위치 조합(카운터) 및 물체 변위의 방향으로 구성된 철저한 카운터밸런싱 방법의 구현으로, 경기장 구석의 광강도 및 벽 색상/패턴의 변화로 인해 상승할 수 있는 원치 않는 선호도가 최소화된다.

인코딩/테스트 세션 간의 복제가능성을 높이고 반복의 영향을 최소화하기 위해 작업을 반복할 때 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 첫째, 고유한 컨텍스트(인코딩/테스트 세션의 반복 횟수만큼)는 동일한 컨텍스트를 사용하여 반복되는 세션을 수행하여 발생할 수 있는 공간 메모리의 축적을 방지하도록 설계되어야 합니다. 이를 달성하기 위해, 다른 색상과 패턴의 교체 가능한 벽을 가진 장치가 사용되었다(도 1B,C). 벽에 걸려 있는 뚜렷한 벽과 3D 객체(예: 장난감 또는 고유한 색상과 모양의 작은 일상 용품, 프로토콜 및 그림 1C참조)는 쥐가 자신의 맥락과 관련하여 개체 위치를 학습하는 데 잠재적으로 사용하는 공간 단서와 랜드마크입니다. 테스트가 이동된 개체에 대한 기본 설정을 생성하지 못하는 경우 컨텍스트(벽 설계 및 공간 큐)의 이러한 매개 변수를 변경하는 것을 고려할 수 있습니다. 또는 직사각형 또는 원형 형 경기장을 이 프로토콜과 같이 사각형 아레나 대신 오브젝트 위치 작업에 사용할 수 있습니다. 원형 경기장은 코너와 경기장에서 자주 관찰 되는 코너 환경 설정을 제거 하기 위해 보고^{된다 22,} 따라서, 특히 높은 불안 쥐 또는 마우스 변형을 처리할 때 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 네 개의 서로 다른 컨텍스트를 만드는 요구 사항은 사각 모양으로 가장 최적으로 작동하지만 일부 조정 후 원형 경기장을 작동시킬 수도 있습니다.

둘째, 각 인코딩/테스트 세션 사이의 간격은 쥐가 매번 동일한 수준의 이자를 유지하되 반복의 울창한 일정으로 인한 누적 학습의 위험을 피하면서 결정되어야 합니다. 일반적으로 인코딩과 테스트 시험 사이의 지연 시간의 길이를 두 배 이상 간격으로 하는 간격은 충분하며, 더 긴 간격은 두 개 이상의 반복에 더 유리합니다. 즉, 24-h 테스트 후 최소 48h 간격은 하나 또는 두 개의 반복에 충분하지만 4개의 반복에 대해 1주 간격을 사용하는 것이 좋습니다. 그림 5의 결과와 ANOVA를 사용한 비교결과에서 볼 수 있듯이 작업을 4번 성공적으로 반복할 수 있습니다. 이를 바탕으로, 확립된 프로토콜을 사용하여 최대 4개의 실험 조건의 균형을 맞출 수 있습니다. 실험 그룹의 수는 고유한 컨텍스트에서 인코딩/평가판 세션의 반복 횟수를 결정합니다. 그림 5의 결과는 두 개의 실험 그룹과 프로토콜을 사용하는 한 가지 가능한 방법을 나타냅니다. 그룹은 두 세션에서 균형을 이루고 유효성 검사를 위해 두 개의 추가 세션에서 동일한 조건이 반복되었습니다. 두 번째 역균형 세션 집합을 사용하여 새로운 조건의 균형을 맞출 수도 있습니다. 유사하게, 서너 개의 실험 조건은 각각 서너 개의 균형 잡힌 세션을 사용하여 비교될 수 있다.

이러한 경우 컨텍스트는 프로토콜에 설명된 대조적인 특성을 수용하도록 설계되어야 합니다. 불균형 설계가 장기간 지속되는 효과나 손상을 남길 수 있는 약리학적 개입과 같은 추가 조작이 사용되는 실험에 적합하지 않을 수 있다는 점은 주목할 만하다. 시험의 효과와 복제성을 유지하기 위해 실험은 그에 따라 설계되어야 합니다. 그림 5에서설명한 바와 같이 반복된 테스트의 데이터를 여러 가지 방법으로 제시하고 분석할 수 있습니다. 초기 분석의 경우, 각 컨텍스트의 실험 그룹은 하나의 샘플 t-test를사용하여 기회 수준과 개별적으로 비교하여 중요한 선호도를 결정할 수 있습니다(그림5B,D). 이렇게 하면 데이터를 빠르게 이해하는 데 도움이 될 수 있지만 그룹의 간접적인 비교만 보장합니다. 따라서 두 개 이상의 그룹을 비교하기 위해 각각 2개의 샘플 t-테스트(쌍 또는 페어링되지 않은) 또는 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석해야 합니다. 이는 단일 인코딩/테스트세션(도 4A 및 도 5B,D) 또는 두 개의(또는 그 이상) 불균형컨텍스트(그림 5C,E)로부터그룹의 주제 간 비교 형태일 수 있다. 후자의 방법은 특히 약한 메모리 조건을 다룰 때, 특히 이전에 설명한 바와 같이 동작의 임의성으로 인해 높은 분산을 초래하는 것이 좋습니다.

불균형 컨텍스트를 결합하면 그룹의 동작을 최소한의 변형으로 안정적으로 시각화하는 데 필요한 더 큰 그룹으로 연결됩니다. 불균형 세션에서 반복이 있는 프로토콜을 사용하면 동일한 통계적 전력을 가진 단일 테스트를 사용하는 데 필요한 수의 약 1/3으로 쥐 수가 감소할 것으로 예상할 수 있습니다. 일반적으로, 반균형 세션을 위한 7~15마리의 랫트(총)의 범위와 효과 크기 및 0.8보다 큰 전력을 가진 단일 세션에 대해 20~50마리의 쥐(그룹당 10~25개)의 범위에서 샘플 크기는 충분하다. 필요한 동물의 수의 감소와 이 프로토콜을 사용하여 각 동물에게서 얻은 정보의 증가는 연구를 구체화하고 연구에서 동물의 윤리적 사용의 3R 원칙을 제공합니다. 이 단계에서는 강한 기억과 동반되지 않는 무작위 쥐 행동이 확률 과 그 이상 모두에서 개별적인 강한 선호도를 초래할 수 있지만 그룹 평균은 기회와 크게 다르지 않은 선호도를 산출해야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 개별 데이터는 신중하게 해석해야 합니다. 그룹 내개별 데이터 포인트분포도 결과를 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 도 4 및 도 5에서볼 수 있듯이 메모리의 강도에 따라 분포가 변경됩니다. 전반적으로 여기에 제시된 프로토콜은 단기 및/또는 장기 공간 메모리를 모델링하기 위해 반복된 개체 위치 작업을 구현하기 위해 쉽게 따를 수 있습니다. 간단하고 유연한 교육 프로토콜과 추가 조작을 구현할 가능성은 이 작업을 인기 있는 선택으로 만듭니다. 프로토콜을 수정하면 메모리 수집, 통합 및 회수와 같은 특정 단계를 조사할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603