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요약

이 프로토콜은 대변 펠릿 생산을 측정하여 나무 보링 갑각류인 림노리아의 먹이 속도를 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 비전문 실험실에서 사용하도록 설계되었으며 해양 조건에서 향상된 목재 내구성을 평가하기 위해 표준 테스트 프로토콜에 통합할 가능성이 있습니다.

초록

나무 지루한 무척추 동물은 급속하게 해양 목재와 나무 해안 인프라를 파괴, 매년 전 세계적으로 수십억 달러의 피해를 일으키는. 크레오소테와 크로마테드 구리 아르민(CCA)과 같은 광범위한 스펙트럼의 생생물을 함유한 목재의 치료는 이제 법규에 의한 해양 사용이 제한되어 있으며, 자연적으로 내구성이 뛰어난 목재 종과 목재의 새로운 보존 방법이 필요합니다. 이러한 방법은 해양 보어에 대한 목재 방부제를 테스트하기위한 유럽 표준과 같은 규제 표준을 충족하기 위해 테스트를 거칩니다, EN 275. 내구성이 강한 목재 종 또는 목재 방부제 치료에 대한 초기 조사는 실험실 테스트를 통해 신속하고 저렴하게 달성 될 수 있으며, 이는 일반적으로 비용이 많이 드는 장기적인 노력인 해양 현장 시험에 비해 많은 이점을 제공합니다. 림노리아 (그리브)의 많은 종은 해양 나무 지루한 갑각류입니다. Limnoria 는 아쿠아리아에서 나무를 사육하는 실용성과 목재에 대한 수유 율을 쉽게 측정하기 때문에 해양 목재 보어에 의한 목재의 생분해에 대한 실험실 테스트에 사용하기에 이상적입니다. 본 명세서에서, 우리는 그리브를 사용하여 목재 생분해성 평가를 위한 표준화가능한 실험실 시험을 간략하게 설명합니다.

서문

목보어는 해상 방어, 교각 및 양식 구조와 같은 해양 목재 구조물에 광범위한 손상을 입힐 수 있습니다. 전 세계적으로 연간 수십억 달러의 비용이 드는 교체 또는 복원비용1,2,3. 이러한 구조를 보호하기 위해 목재는 종종 생분해를 줄이기 위해 치료됩니다. 그러나 호주, EU, 영국 및 미국에서 광범위한 생물제의 사용 제한으로 인해 해양 환경에서 는 보어에게 자연적으로 내구성이 있는 새로운 수정 기술과 종의 목재가 4,5,6,7로 요구됩니다. 해양 환경에서 목재를 보존하기 위한 새로운 기술은 규제 기준을 충족하고 화학 방부제침과 같은 위험으로부터 환경 영향을 제한하기 위해 철저한 테스트가 필요합니다. 예를 들어, 1992년부터 유럽 표준인 EN 275는 해양 목재 보어 피해8,9에 대한 목재 보존 치료를 평가하는 데 사용됩니다. 이 표준은 CCA4, 5,6,7 및 creosote10과 같은 생물 분열 화합물의 사용에 대한 다른 법률과 함께 지속 가능하고 독성이 없는 목재 보호 방법과 천연 내구성이 강한 목재 종의 사용이 생물학적 시달 치료를 대체해야 합니다11,12 . EN 275에 명시된 것과 같은 해양 시험은 장노출 기간이 필요하며 따라서 비용이 많이 들고 의미 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 실험실 테스트는 해양 목재 보어 공격에 대비한 목재 제품을 보존하는 테스트 방법에 대한 훨씬 더 빠른 대안을 제공하여 치료 일정에 대한 조정을 신속하게 평가할 수 있습니다13. 이 급속한 실험실 실험의 결과는 목재의 새로운 수정 과정을 알리고 보어 손상에 자연적인 내구성을 가진 목재 종을 식별하도록 설계되었습니다. 낮은 공급 률과 활력은 잠재적 인 제품에 증가 저항을 나타낼 수 있으며,이 정보는 디자인을 개선 할 수 있도록 업계 파트너에게 다시 공급 될 수 있습니다. 우리의 방법은 민첩하고 신속한 대응을 허용, 이는 업계에서 바람직하다, 그리고 유망한 제품이 확인되면, 결과는 해양 시험에서 그들과 함께 보충 될 수있다.

그리블스(림노리아)는 가족 림노리대의 등두질 갑각류 속이다. 전 세계적으로 60종 이상의 림노리아종13,14,15종이 있으며, 영국, 림노리아 리그노럼, 림노리아 삼각타타, 림노리아 쿼드립타다16에서 3종의 일반적인 종이 있습니다. 그들은 바닷물에 잠긴 나무 표면에 터널을 뚫고 경제적으로 큰 피해를 입힙니다. 그리블은 영국 연안 해역에서 매우 풍부하며 실험실 조건에서 유지관리가 용이하므로 해양 목재 지루한 무척추 동물에 의한 목재 생분해 연구를 위한 이상적인 유기체입니다. 다른 목재 종 및 목재 보존 방법에 대한 먹이 주기율과 활력을 평가하면 생분해에 대한 저항의 효능을 결정할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 보르헤스와 동료가 설명한 그것과 함께 개발한 그리블 급식 속도를 측정하는 표준 방법을 제시하며, 비전문 실험실에서 공정을 작동시킬 수 있도록 이미지 분석의 도입을 간소화합니다. 이미지 분석은 또한 많은 수의 샘플을 수동으로 계산하는 실질적인 한계를 줄이는 데사용됩니다. 영국 표준 EN350-1:1994에 따르면 장기 해양 테스트에서내구성은 피누스 실베스트리스 sapwood18을 기준으로 등급이 매겨져 있습니다. 여기에 제시 된 단기 실험실 테스트에서, 우리는 종 ekki (로피라 알라타 은행 전 C.F 가르트른), 너치 (파구스 실바티카 L), 달콤한 밤나무 (카스타네아 사티 바 밀) 및 튜펜틴 시카라이프 (Scarma.spia)의 심장 나무를 테스트하는 제어로 스코틀랜드 소나무 (피누스 실베스트리스 L) 수액우드를 사용합니다. 나무 종당 8개의 복제중 평균 대변 펠릿 생산 및 활력은 내구성의 지표로 사용되었습니다. 우리는 그릴 종 림노리아 쿼드 립콘타타와 자연적으로 내구성이 강한 목재 종의 범위를 사용하여 전형적인 평가에서 수집 된 예시 데이터를 제공합니다. Menzies (1951)가 제공하는 열쇠에 의해 확인된 Limnoria quadripunctata는 가족 중 가장 잘 연구된 구성원이며 생분해 시험에 사용하기위한 모델 종으로 잘 확립되어 생분해 시험을위한 최적의 종으로 선정되었습니다. 이 프로토콜은 사용된 컨트롤이 동일한 종의 처리되지 않은 복제되어야하지만 다른 치료법의 목재를 테스트하는 데도 적용됩니다.

프로토콜

1. 테스트 스틱 준비

  1. 모든 치료 과정이 완료되면 드라이 우드를 테스트 스틱으로 잘라 크기 2mm x 4mm x 20mm (그림 1). 실험실 조건에서 공기 건조는 일정한 무게에 충실합니다. 테스트 중인 각 목재의 복제를 최소 5개 이상 사용하십시오.

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그림 1: 단기 실험실 테스트에 사용되는 테스트 스틱은 그리브 먹이 비율을 평가합니다.  2mm x 4mm x 20mm 크기의 나무 스틱을 테스트합니다. 왼쪽부터 ekki, 터펜틴, 달콤한 밤과 너도밤나무, 스코틀랜드 소나무 수목. 스케일 바 4mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 진공 함침
    1. 포스트 우드 준비(예: 절단 및 처리,해당하는 경우), 진공 건조기 내부에 메쉬 아래에 스틱을 놓고 뚜껑을 교체하여 진공 그리스 코팅에 의해 용이하게 되는 단단한 밀봉이 되도록 한다(그림 2).
    2. 건조기와 펌프를 연결하는 튜브 사이에 3방향 밸브를 부착하고, 세 번째 튜브는 야외로 이어진다(그림 2). 3방향 밸브가 공기로 닫혀 펌프를 실행하여 진공 건조기 내에서 -0.75에서 -1.0 bar 사이의 진공 상태를 달성하고 이 진공을 45분 -1시간 동안 유지합니다.
    3. 세 번째 튜브의 열린 끝을 바닷물 용기에 담급다. 펌프를 끄고 펌프로 이어지는 밸브를 닫은 다음 진공물이 건조기로 그려질 때까지 밸브를 천천히 엽니다. 플라스틱 용기가 메쉬 수준 이상으로 채워질 때까지 물이 흐르도록 합니다.
    4. 그런 다음 용기의 바닷물에서 튜브를 철수하여 건조기가 대기압으로 돌아올 때까지 공기가 들어갈 수 있도록 합니다. 스틱이 플라스틱 용기의 바닥으로 가라앉을 때까지 메시 아래에 잠긴 스틱을 유지합니다.

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그림 2: 실험실 급식 분석 중에 그을린 에 대한 먹이를 준비하기 위해 바닷물로 나무 막대기를 진공 청소기로 사용하는 장비.  A) 진공 건조기; B) 펌프; C) 진공 건조기용 압력 게이지; D) 진공 건조기, 펌프 및 야외 또는 바닷물 (오렌지 튜브)로 이어지는 3 방향 밸브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 침출 나무
    1. 50mL 튜브에 포함된 바닷물에 해수 포화 테스트 스틱(그림 3). 20일 동안 정기적으로 물을 교체하십시오.
      참고: 침출 과정은 처리된 또는 자연 목재를 포함하여 시험 중인 모든 실험용 목재에 적용됩니다.

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그림 3: 실험실 급식 분석 중에 울릴 준비를 위해 나무 막대기에서 침출하십시오.  50ml 팔콘 튜브에 담긴 바닷물에 완전히 잠긴 목재는 정기적인 물 변화(1-3일)로 뚜렷하게 색이 다른 침출을 생산했습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 침출하는 하트우드; 달콤한 밤, 터펜틴, 에키, 너도밤나무와 스코틀랜드 소나무 수액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 그리블 추출

  1. 감염된 나무 블록에서 그리블의 개별 표본을 추출합니다. 미세 한 집게와 얇은 (크기 000/0.4 mm 이상) 페인트 브러시를 사용합니다. 집게로 그리브 굴을 덮고있는 나무를 조심스럽게 벗깁니다.
    참고: 잠은 나무 의 표면에 발견되며 작은 구멍으로 식별 할 수 있습니다 (그림 4).
  2. 그러블이 노출되면 페인트 브러시를 사용하여 아래에서 개인을 부드럽게 데리러 바닷물로 채워진 페트리 접시에 보관하십시오. 현미경으로 그을린 후 종을 식별하고 추출하는 동안 손상이 발생하지 않았는지 확인하십시오.
    참고 : 흉부를 치는 것은 활력의 표시입니다.
    1. 그레이드 암컷이 먹이 주기 용량이 감소함에 따라 암컷이 계란을 우울히 하는 것을 버리십시오.

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그림 4: 두 개의 일반적인 환기 구멍이 있는 그릴 굴의 이미지입니다. L. 라디에이타 소나무 막대기에 quadripunctata 굴, 크기 2mm x 4mm x 20mm. 굴 입구 옆에는 두 개의 작은 환기 구멍을 볼 수 있습니다. 배율 막대 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  

  1. 리노리아 쿼드립콘타타 식별
    1. 제5 플레오니테19의 X자형 카리나 외에 동물의 흉막에 정사각형 패턴으로 배열된 네 개의 뚜렷한 튜브에 의한 스테레오마이크로코프 아래 림노리아 쿼드립크타타를 식별합니다(그림 5).

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그림 5: 리노리아 쿼드립타타 식별 기능.  등쪽 표면 림노리아 쿼드립콘타타 의 이미지, x20 배율에서 스테레오 현미경으로 촬영. 적색 화살표로 표시된 피처를 식별하면 X 자형 카리나와 파란색 화살표가 플리오텔슨에 4 개의 튜브를 나타냅니다. 배율 막대 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 잘 접시를 준비

  1. 직경 20mm의 우물이있는 멀티 웰 플레이트에서 테스트 스틱 1 개와 여과되지 않은 해수 5 mL을 웰 당 32-35 PSU 사이에 놓습니다 (그림 6).
  2. 나무의 각 유형이 접시 당 적어도 한 번 표현되도록 우물 판 전체에 체계적으로 나무의 치료 / 종을 배치합니다. 잘 당 하나의 그리블을 추가합니다.
    참고: 온도는 종 L에 대한 20 °C ± 2 °C에서 인큐베이터에서 안정적으로 유지되어야한다. 사지 침타타, 림노리아의 다른 종은 특정 종에 맞게 만든 온도 조정과 함께 사용할 수 있습니다.
  3. 포토기간(gribble) 급식율15에 영향을 미치지 않으므로 일정한 어두운 조건에서 플레이트를 보관하십시오.

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그림 6: 그리브 수유 분석용 실험용설정.  그리브 수유율의 실험실 테스트에 사용되는 12 개의 다중 우물 플레이트의 예입니다. 각 우물은 5ml 바닷물과 다른 나무 종의 하나의 테스트 스틱 (20mm x 4mm x 2mm)을 포함; 스코틀랜드 소나무 수액나무와 에키, 너도밤나무, 달콤한 밤, 터펜틴 하트우드. 배율 막대 20mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 대변 펠릿을 수집하고 계산하고 활력을 평가합니다.

  1. 일주일에 두 번, 시험용 스틱과 각 그리블(웰당 1개)을 제거하고 새로 미리 준비된 웰 플레이트에 넣습니다(웰당 5mL의 해수 포함[32-35 PSU, 18-22°C]).
  2. 페인트 브러시를 사용하여 스틱에서 대변 펠릿을 부드럽게 브러시한 후 원래 의 대변 펠릿을 유지합니다.
    참고 : 신선한 우물 판에 그릴을 전송하기 전에, 활력은 1-5의 규모로 평가 될 수있다; 1 = 죽은, 2 = 수동, 나무에, 3 = 적극적으로 수영 또는 흉막을 구타, 나무가 아닌, 4 = 나무의 표면에 크롤링, 5 = 나무에 잠복.
  3. 이미지 처리
    1. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 개별 펠릿이 보이도록 덩어리를 분리하고 우물가장자리에서 펠릿을 브러시합니다. 배율 x4에서 스테레오 현미경으로 자세한 사진을 찍고 컴퓨터에 업로드하십시오(그림 7).
      참고: 펠릿이 초점을 맞추고 있고 배경이 균일하고 수면에 그림자나 조명 반사가 없는지 확인합니다.

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그림 7: 그리브 대변 펠릿의 이미지. L. 쿼드립크타타 대변 펠릿 (작은, 원통형, 갈색 펠릿) 멀티 웰 플레이트의 한 우물에서 라디에아 소나무 나무에 먹이에서. x4 배율로 촬영. 이미지 분석을 위해 조작하기 전에 이미지(그림 7 참조). A) ImageJ에서 자동 계수에 사용할 적절한 이미지의 예입니다. 펠릿은 우물 가장자리에서 충분히 퍼져 있습니다. 우물은 중심이며 장애물이나 반사가 없습니다. B) 이미지 분석에 적합하지 않은 이미지의 예입니다. 우물은 오프 센터, 하단 절반을 차단. 파란색(점선) 원은 수면에서 빛의 반사를 나타낸다. 주황색(솔리드) 원은 너무 밀접하게 뭉쳐 있고 우물 가장자리 근처에 너무 가까이 있는 펠릿을 보여줍니다. 빨간색(파선) 원에서 제거되지 않은 우드 칩이 표시됩니다. 배율 막대 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  

  1. ImageJ를 사용하여 대변 펠릿 카운트를 생성하는 프로세스.
    1. https://imagej.nih.gov/ij/download.html ImageJ(03/08/21, 1.8.0_172 현재 최신 버전)를 https://imagej.nih.gov/ij/download.html 다운로드하거나 컴퓨터 브라우저에서 실행합니다.
    2. 드래그 및 삭제 또는 파일 | 선택하여 이미지 스택업로드 가져오기 | 이미지 시퀀스 | 찾아볼 수 있습니다. 매개 변수를 변경하지 않은 다음 Okay를 선택 합니다.
    3. 다음으로, 원 도구를 사용하여 대변 펠릿을 포함하는 우물의 하단 부분을 선택한다. 우물 가장자리를 제거하고 편집 | 선택합니다 . 외부를 지웁시다. 이미지 바이너리 만들기, 프로세스 | 선택 바이너리를 만듭니다.
    4. 분석 | 선택하여 교정 배율을 설정하고 이미지의 밀리미터당 픽셀 수를 선택합니다(예: 10픽셀 = 1mm). 펠릿 을 계산하고 분석 | 선택 입자를 분석합니다.
    5. 크기(unit2) 옆의 상자에서, 단위 조율 세트를 사용하여 가장 작은 크기의 펠릿과 동일한 낮은 임계값을 선택합니다(예: 10픽셀 = 1mm, 가장 작은 펠릿이 0.5mm인 경우, 5-무한대 선택).
    6. 드롭다운 표시 상자에서 윤곽선을 선택한 다음 요약 을 선택하고 확인 을 누릅니다(그림 8).
      참고: 자세한 내용은 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

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그림 8: ImageJ에서 사용되는 공정의 흐름 다이어그램으로 대변 펠릿을 계산합니다.  A) ImageJ의 파일 탭에서 이미지 시퀀스를 가져옵니다. B) 로컬 장치에서 이미지 시퀀스를 가져오기 위해 '이미지 시퀀스 가져오기' 대화 상자의 찾아보기 단추입니다. C) 원 도구를 사용하여 대변 펠릿 D가 포함된 영역을 선택) 편집 탭 영역에서 외부 버튼을 지우고 선택한 영역 외부를 제거합니다. E) 프로세스 탭에서 바이너리 버튼을 만듭니다. F) 분석 탭에서 스케일 단추를 설정합니다. 픽셀의 거리는 한 단위의 측정(mm)에 대한 픽셀 수와 동일합니다. G) 분석 탭에서 파티클 버튼을 분석합니다. 크기(unit^2)는 픽셀 단위로 무한대로 변질 펠릿 크기의 낮은 임계값으로 설정합니다. '개요'와 '요약'을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 데이터 분석
    1. 펠릿 수를 하루에 펠릿으로 변환하여 공급 률을 간접적으로 측정합니다. 모울팅이 발생한 날에 는 모든 모팅 개인의 데이터를 삭제합니다(그림 9).
      참고: 몰팅은 1-3일 이상 발생하며 외골격의 전체 모트를 볼 수 있을 때 확인할 수 있습니다.

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그림 9: 그리브 몰트의 예.  20mm x 4mm x 2mm 크기의 라디에이타 소나무 테스트 스틱에 그리블 (L. quadripunctata) moulting. 몰트는 빨간색 원으로 표시됩니다. 배율 막대 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

L의 먹이 실험. 쿼드립콘타타는 5가지 목재 타입(스코틀랜드 소나무(피누스 실베스트리스 L) 수액우드를 사용하여 20일 이상 실시하였습니다. 너도밤나무(파거스 실바티카 L), 에키(로피라 알라타 뱅크스 ex C. F 가에르트른), 달콤한 밤(카스타네아 사티바 밀), 터펜틴(신카르피아 글로무라이프라(Sm.) 니드)의 하트우드(자료표 참조) 2020년 11?...

토론

먹이 실험에 사용할 그리블 표본을 선택하기 전에, 개별은 그들의 적합성을 평가하기 위하여 가려져야 합니다. 크기 차이로 인해 개인 간의 먹이 비율에 약간의 차이가있을 수 있으므로 완전히 재배 된 성인 표본만 선택해야합니다. 200917년 Borges 등에서 1.5mm와 3mm 길이 사이의 개인의 먹이 속도 사이에 는 유의한 차이가 발견되지 않았다. 여성 림노리아는 계란을 우울시켰?...

공개

저자는이 연구와 관련된 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

노르웨이 연구 위원회 (오슬로 지역 기금, 알코푸르 rffofjor 269707) 및 포츠머스 대학 (과학 박사 학위 연구 장학금) 루시 마틴의 연구에 대한 자금을 제공에 감사드립니다. 또한, 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되는 나무를 제공한 게르바이스 S. 소여에게. 터펜틴은 브리티시 컬럼비아 대학의 필립 에반스 교수에 의해 제공되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well cell culture platesThermoFisher Scientific150200
50ml Falcon tubesFisher Scientific14-432-22
Adjustable volume pipetteFisher ScientificFBE100001-10 ml
BeechG. Sawyer (consultant in timber technology)Fagus sylvaticaTaxonomic authority: L
EkkiG. Sawyer (consultant in timber technology)Lophira alataTaxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
ForcepsFisher Scientific10098140
IncubatorLMS LTDINC5009
Microporous specimen capsulesElectron Microscopy Sciences70187-20
Petri dishFisher ScientificFB0875713
Scots PineG. Sawyer (consultant in timber technology)Pinus sylvestrisTaxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrushHobby Craft5674331001Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet ChestnutG. Sawyer (consultant in timber technology)Castanea sativaTaxonomic authority: Mill
TurpentineP. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia)Syncarpia glomuliferaTaxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccatorFisher Scientific15544635

참고문헌

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