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요약

초음파 보조 추출 (UAE)은 용매의 추출 효율을 높이고 대마초 spp. 바이오 매스에 적용하면 추출에 필요한 시간을 줄입니다. 이것은 열화로 인한 비용 및 잠재적 인 칸 나비 노이드 손실을 감소시킵니다. 또한 UAE는 낮은 용매 사용으로 인해 녹색 방법으로 간주됩니다.

초록

산업용 대마 (대마초 spp.)에는 잠재적 인 의학적 이점과 함께 많은 관심있는 화합물이 있습니다. 이러한 화합물 중 칸 나비 노이드가 주목의 중심, 특히 산성 칸 나비 노이드에 도달했습니다. 초점은 향정신성 활동의 부족으로 인해 산성 칸 나비 노이드로 향하고 있습니다. 대마초 식물은 산성 칸 나비 노이드를 생산하며 대마 식물은 낮은 수준의 향정신성 칸 나비 노이드를 생산합니다. 따라서, 산성 칸 나비 노이드 추출을위한 대마의 활용은 칸 나비 노이드의 공급원으로 추출하기 전에 탈탄산의 필요성을 제거 할 것입니다. 용매 기반 추출의 사용은 초임계CO2 와 같은 용매에서의 용해도가 그들의 용해도 상수에 도달하는 데 필요한 높은 압력 및 온도로 인해 제한되기 때문에 산성 칸나비노이드를 얻는 데 이상적입니다. 용해도를 높이기 위해 고안된 다른 방법은 초음파 보조 추출입니다. 이 프로토콜에서, 초음파 보조 추출 효율에 대한 용매 극성 (아세토니트릴 0.46, 에탄올 0.65, 메탄올 0.76, 및 물 1.00) 및 농도 (20%, 50%, 70%, 90%, 및 100%)의 영향이 조사되었다. 결과는 물이 가장 효과적이지 않았고 아세토니트릴이 검사된 가장 효과적인 용매였음을 보여준다. 에탄올은 가장 낮은 독성을 가지며 일반적으로 안전한 것으로 간주되기 때문에 추가로 조사되었다 (GRAS). 놀랍게도, 물 속의 50 % 에탄올은 대마에서 가장 많은 양의 칸 나비 노이드를 추출하는 데 가장 효과적인 에탄올 농도입니다. 칸 나비 디올산 농도의 증가는 100 % 에탄올과 비교할 때 28 %, 100 % 아세토니트릴과 비교할 때 23 %였다. 50 % 에탄올이 우리의 적용에 가장 효과적인 농도라고 결정되었지만,이 방법은 대체 용매로도 효과적이라는 것이 입증되었습니다. 결과적으로, 제안 된 방법은 산성 칸 나비 노이드를 추출하는 데 효과적이고 신속한 것으로 간주됩니다.

서문

산업용 대마 (대마초 spp.)는 다양한 식물 조직 (꽃, 잎 및 줄기)에서 산성 칸 나비 노이드를 생산하며 꽃1에서 가장 높은 농도로 발견됩니다. 대마초 산업은 이러한 화합물을 추출하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다. 이러한 방법 중 하나는 비극성 및/또는 극성 용매를 이용하는 용매 추출이며, 그 중 에탄올이 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 용매 추출 단독으로는 그의 능력이 제한된다; 따라서 전자 레인지 보조 추출 (MAE) 및 초음파 보조 추출 (UAE)과 같은 증강 추출 기술은 수율을 높이도록 설계되었습니다. 또한, 고농도 칸 나비 디올 (CBD)은 초임계 유체 기술2를 사용하여 추출 할 수 있습니다.

추출은 역동적 인 과정이며 몇 가지 요인, 즉 수분 함량, 입자 크기 및 용매3의 효율성에 영향을 미칩니다. 특히, UAE 기술의 경우 효율성은 온도, 압력, 주파수 및 시간4에 의해 관리됩니다.

초음파 보조 추출은 초음파가 액체를 통과하여 입자를 동요시키는 과정입니다. 교반 과정 동안, 식물 재료는 음향 캐비테이션, 압축 및 팽창의 사이클을 경험하여 용액에서 붕괴되는 기포를 형성하여 극한의 온도와 압력의 생성을 초래합니다5. 압력 및 온도 변화는 용매의 물리적 특성을 변화시켜 추출6의 효능을 증가시킬 수 있습니다. 추가적으로, 캐비테이션은 식물 매트릭스(7)로부터 유기 및 무기 화합물이 침출되도록 유도하는 분자 상호작용을 방해할 수 있다. 이 과정은 두 가지 주요 유형의 물리적 현상을 포함합니다 : (1) 세포벽을 가로 지르는 확산과 (2) 벽을 깨뜨린 후 세포 내용물을 헹구는 것8. 그러나 UAE의 사용에는 함정이 없습니다. UAE가 화합물 9,10을 분해 할 수 있다는 몇 가지 보고서가 있습니다. 또한, 캐비테이션 부위에서 생성 된 온도는 칸 나비 노이드의 탈탄산에 필요한 온도보다 높습니다. 그러나 Mudge et al.11은 UAE를 사용하고 CBD 또는 테트라 하이드로 칸 나비 놀 (THC)의 큰 탈탄산을 관찰하지 못했으며, 이로 인해 UAE가 낮은 에너지를 사용하여 신속하게 추출 할 수 있기 때문에 칸 나비 노이드 추출을위한 효율적이고 녹색 방법임을 입증했습니다.

De Vita et al.12는 MAE 및 UAE 방법의 사용을 구체적으로 조사한 결과, 각 방법에 대한 최적 조건을 적용 할 때 UAE가 식물 재료에 존재하는 산성 및 중성 CBD 및 THC를 더 많이 추출한다는 것을 발견했습니다. 유사하게, Rožanc et al.13은 여러 추출 방법 (UAE, soxhlet, maceration 및 초임계 유체)을 비교하고 추출물의 생물학적 활성을 조사했습니다. Rožanc은 모든 방법이 칸 나비 노이드를 추출하는 데 효과적이라는 것을 입증했습니다. 그러나 초임계 유체와 UAE는 칸 나비 디올산 (CBDA)을 추출하는 데 가장 효과적이었습니다. 추가적으로, UAE 추출은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 분석법에 의해 측정되었을 때 가장 높은 생물학적 활성을 가졌다. Rožanc의 연구는 또한 추출 과정이 조추출물을 생산하는 데 효과적이지만 추출물의 생물학적 활성에 영향을 미치는 비 칸 나비 노이드 화합물의 일부가 남아 있음을 보여주었습니다. 추가적으로, 이들 화합물은 조 추출물(13)로부터의 개별 칸나비노이드 화합물의 분리 및 정제를 복잡하게 할 수 있다.

초임계 유체 추출 (SFE) 기술은 중성 칸 나비 노이드를 추출하는 데 사용되었습니다. 여러 연구에 따르면 SFE와 에탄올과 같은 유기 용매가 중성 칸 나비 노이드 2,3의 추출 효율을 높였다는 것을 보여주었습니다. 압력이 산성 칸나비노이드를 추출할 수 있는 수준으로 증가되었을 때, 비-칸나비노이드 함량 또한 증가하였다. 이와 같이, 이러한 고압은 칸나비노이드에 대한 SFE의 선택성이 감소하고 추가적인 후처리가 요구되기 때문에 산업 가공에 실용적이지 않다. 결과적으로, 탈탄산은 SFE 이전에 수행되어야하며, 이는 최대 18 %2의 칸 나비 노이드 손실을 초래할 수 있습니다. SFE의 효율을 증가시키기 위해, 최종 추출물(14)의 순도를 증가시키기 위해 고상 추출과 같은 기술들과 조합되었다. 그러나, 최종 생성물로서 높은 순도를 가짐에도 불구하고, 중성 카나비노이드만이 얻어진다.

전통적으로, 분석 실험실에서, 칸 나비 노이드는 9:1 메탄올 : 클로로포름 혼합물에서 추출되었다. 그러나 Mudge et al.11은 UAE를 사용할 때 단일 용매로 효과적인 추출을 수행 할 수 있음을 입증했습니다. 이 연구는 80 % 메탄올이 전통적인 9 : 1 메탄올 : 클로로포름 추출만큼 효과적이라는 것을 보여 주었기 때문에 친환경 용매가 효과적 일 수 있음을 나타냅니다. 따라서 UAE는 낮은 자본 비용, 추출 시간 단축, 낮은 에너지 사용 및 용매 부피 등 여러 가지 이점을 가지고 있기 때문에 잠재적 인 사용을 조사했습니다. 그러나 UAE의 경우 극성 용매를 사용하면 엽록소 및 기타 비 칸 나비 노이드를 추출 할 수 있으며 이는 색상7에 문제를 일으킬 수 있습니다. 결과적으로, 상업적 규모로 산성 칸 나비 노이드를 얻을 수있는 가능성을 조사하기 위해 UAE는 산업용 대마 품종 체리 와인을 사용하여 고용되었습니다. 체리 와인은 C. sativa 와 C. indica의 하이브리드로, The Wife와 Charlotte의 Cherries의 품종 사이의 십자가입니다. 체리 와인 품종은 테트라 하이드로 칸 나비 놀산 (THCA)의 낮은 수준을 가진 높은 CBDA 생산 균주 (15 % ~ 25 % CBD)입니다. 품종은 7 ~ 9 주간의 개화가있는 C. indica-dominate 균주입니다.

최적의 UAE 추출 프로토콜을 확립하기 위해 두 가지 접근 방식, 즉 한 번에 하나의 요소 (OFT) 최적화와 CCD (Central Composite Design)를 사용하는 DoE (Design of Experiment) 접근법15가 취해졌습니다. DoE의 경우, CBDA/CBD 추출은 시료/용매 비율, 추출 시간 및 용매 농도를 요인으로 하여 최적화되었으며, 결과 데이터는 RSM(Response Surface Methodology)에 의해 분석되었습니다. 결론적으로, 설명 된 프로토콜은 가장 많은 양의 CBD / CBD를 추출하기위한 최적의 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 식물 재료 준비

  1. 밭에서 자란 식물에서 체리 와인 꽃차례를 얻고, 남쪽에서 북쪽으로 구성된 식물로 중앙에 1m 떨어져 있고 1.2m 떨어진 줄로 식물이 있습니다 (미국 콜로라도 주 롱몬트에 위치한 재배).
  2. 꽃차례를 35°C에서 48시간 동안 공기-건조시킨다. 꽃차례를 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 177 μm로 설정한다.
  3. 분쇄 된 재료를 80 호 메쉬 체를 통해 통과시킵니다. 생성 된 분말을 나중에 사용할 수 있도록 실온에서 밀봉 된 백에 보관하십시오.

2. 초음파 추출

  1. 대마초 꽃차례 분말 0.5 g을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣었다. 40 mL의 용매(예를 들어, 탈이온수 중의 50% 에탄올)를 용기에 첨가한다.
  2. 추출 용기를 40kHz 및 실온으로 설정된 초음파 욕조에 넣으십시오 (초음파 처리 전력은 100W입니다).
  3. 초음파 욕조에서 30 분 동안 추출을 수행하고 욕조의 온도를 25 °C에서 30 °C로 증가시킵니다.
  4. 추출 유체를 원심분리 튜브로 데칸트한다.
  5. 유체를 15°C에서 3,000 x g 에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 진공하에 8 μm 여과지를 통해 여과한다.

3. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정량 분석

  1. 7 개의 칸 나비 노이드 표준 : 칸 나비 크로멘 (CBC), CBD, CBDA, 칸 나비 놀 (CBN), 테트라 하이드로 칸 나비 놀산 (THCA), Δ8-THC 및Δ9-THC를 100 % 메탄올에서 100, 50, 25 및 12.5 μg / mL의 작동 농도로 희석하십시오. 40kHz로 설정된 초음파 욕조에서 5 분 동안 혼합하고 초음파 처리하며 100W의 초음파 처리 전력
  2. 0.45 μm 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 시린지 필터를 통해 표준을 필터링한다. 샘플 상청액을 0.45 μm PTFE 시린지 필터를 통해 (단계 2.5로부터) 여과한다.
  3. 분석하고자 하는 시료를 1.5 mL 바이알에 넣고 HPLC 자동 시료 주입기에 넣고 한 번에 10 μL를 로딩한다.
  4. 표 1에 제공된 조건 및 파라미터에 따라 HPLC를 실행한다. 생성 된 표준 곡선에서 50-200 μg / mL의 칸 나비 노이드 농도를 도출합니다.
  5. 추출 공정에 사용된 용매(40 mL)의 부피를 곱하여 μg의 칸나비노이드를 얻었다. μg의 칸 나비 노이드를 1000으로 나눔으로써 칸 나비 노이드의 mg으로 변환하십시오.
  6. mg / g 건조 중량을 얻기 위해 추출에 사용 된 식물 재료 (0.5g)의 원래 중량으로 나눕니다.

4. 반응 표면 방법론을 이용한 최적화

  1. 데이터 분석 도구를 사용하여 표 4 와 같이 12개의 요인점과 3개의 중앙점을 가진 15개의 실험 실행으로 구성된 모델을 설정합니다.
  2. 반응 표면 방법론 및 중앙 복합 설계를 사용하여 추출 파라미터, 추출 시간(T), 용매 농도(S) 및 샘플/용매 비율(R)을 최적화합니다. 변수 T, S 및 R의 범위를 각각 5-30분, 20%-100% 및 60-100(1:X)으로 설정합니다.
  3. 친유성 추출물의 총 수율과 추출 된 CBD 및 CBDA의 수율을 반응 인자 (RF)로 선택하십시오.

결과

사용된 용매는 극성 지수(0.460 - ACN)의 중간에서 극성(1.000 - 물)까지의 범위이다. 표 2로부터, 물은 칸나비노이드에 대한 효과적인 추출제를 만들지 못했음을 알 수 있는데, 이는 칸나비노이드가 소수성13으로 인해 물에 대한 용해도가 제한됨에 따라 예상치 못한 것은 아니다. 물과 대조적으로, 다른 용매는 CBD와 CBDA의 유사한 추출 값을 가졌으며, 가장 극성이 적은 용?...

토론

용매의 극성은 화합물의 효과적인 추출에 중요한 역할을합니다. 산성 칸나비노이드는 본질적으로 약간 극성이기 때문에, 카르복실산 모이어티에 많은 부분이 있기 때문에, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성 용매가 가장 효과적일 것이라고 가정하였다. Garrett과 Hunt19는 THC를 사용한 연구에서 수성 에탄올에 대한 용해도가 용액 내 퍼센트 에탄올과 용액의 이온 강도를 기반으로한?...

공개

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

본 연구는 콜로라도주립대학교 대마초연구소-푸에블로, 한국 정부가 후원하는 한국혁신재단 보조금(MSIT)(2021-DD-UP-0379), 춘천시(대마 R&D 및 산업화, 2020-2021)의 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileJ.K.Baker9017-88solvent
CannabichromeneCerilliantC-143Cannabinoids standard
CannabidiolCerilliantC-045Cannabinoids standard
Cannabidiolic acidCerilliantC-144Cannabinoids standard
CannabidivarinCerilliantC-140Cannabinoids standard
CannabigerolCerilliantC-141Cannabinoids standard
CannabinolCerilliantC-046Cannabinoids standard
CentrifugeHanil Scientific IncSupra 22KCentrifuge
Cherry Wine hempCFH, Ltd.-Flower extraction material
Distilled waterTEDIAWS2211-001solvent
EthanolTEDIAES1431-001solvent
Filter paperWhatman#2Filtering
GrinderDaesung ArtlonDA280-SMilling
HPLCShimadzuLC-10 systemAnalysis of Cannabinoid
MethanolTEDIAMS1922-001solvent
Minitab 16.2.0Minitab Inc.
Syringe filtersWhatman6779-1304Filtering
TetrahydrocannabivarinCerilliantT-094Cannabinoids standard
Trifluoroacetic acidSigma-aldrich302031-1LHPLC flow solvent
Untrasonic bathJinwoo4020PUltrasonic extraction
Zorbax Eclipse plus C18 HPLC columnAgilent9599990-902HPLC column
Δ8 - TetrahydrocannabinolCerilliantT-032Cannabinoids standard
Δ9 - TetrahydrocannabinolCerilliantT-005Cannabinoids standard
Δ9 - Tetrahydrocannabinolic acidCerilliantT-093Cannabinoids standard

참고문헌

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